LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và
kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

NGUYỄN THỊ HẠNH

1


0949.141.000

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Hoàng Thị Thu Yến - Giảng
viên, phó trưởng khoa - Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người
đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi
hoàn thành luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu hệ gen
- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn và tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình làm đề tài.
Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Dương Trung
Dũng – giảng viên trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời
gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè,
đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt
thời gian qua.
Tác giả
NGUYỄN THỊ HẠNH


RNA
Ribonucleic Acid
SSR
Simple Sequence Repeat (đoạn lặp lại trình tự đơn giản)
TAE
Tris acetat EDTA

4


MỞ ĐẦU
1.

Lí do chọn đề tài
Cây chè là loài cây công nghiệp dài ngày, có nguồn gốc từ vùng khí hậu Nhiệt
đới và Á nhiệt đới. Chè có nhiều vitamin có giá trị dinh dưỡng và bảo vệ sức khoẻ,
có tác dụng giải khát, bổ dưỡng và kích thích hệ thần kinh trung ương, giúp tiêu hoá
các chất mỡ, giảm được bệnh béo phì, chống lão hoá … Do đó nước chè đã trở thành
thứ nước uống của nhân loại. Ngày nay, hầu hết dân cư trên thế giới dùng nước chè
làm nước uống hàng ngày. Một số nước uống chè thành tập quán và tạo ra được một
nền văn hoá nguyên sơ là “văn hoá trà”.
Ngoài để uống người ta còn dùng nước chè xanh để rửa các vết thương những
chỗ lở loét, nhiễm trùng trên cơ thể. Vì thế chè không những có tên trong danh mục
giải khát mà còn có tên trong từ điển y học, dược học. Người Nhật Bản khẳng định
chè cứu người khỏi bị nhiễm xạ và gọi đó là thứ nước uống của thời đại nguyên tử.
Ở vùng Tây Nam Trung Quốc thời cổ đại đã dùng lá chè làm vật trao đổi ngang giá
và thứ thuốc tiên. Ngoài ra, cây chè còn mang lại nhiều lợi ích kinh tế xã hội như:
giải quyết công ăn việc làm, đem lại nguồn thu nhập ổn định cho người dân, thúc
đẩy quá trình công nghiệp hóa và hiện đại hóa nông thôn (Đỗ Ngọc Quý, Đỗ Thị
Ngọc Oanh, 2008).

Để đạt được mục tiêu đề tài chúng tôi tiến hành những nội dung nghiên cứu
sau:

1.

Nghiên cứu tạo dòng tái tổ hợp mang đoạn cDNA/EST ngẫu nhiên được tổng hợp từ

2.

mRNA của cây chè bản địa Thái Nguyên.
Xác định và phân tích đặc điểm trình tự của đoạn cDNA/EST đã được tạo dòng từ
cây chè bản địa Thái Nguyên

6


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1
1.1.1

Giới thiệu chung về cây chè
Phân loại
Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O. Kumtze và thuộc hệ thống
phân loại sau :
Giới thực vật – Plantae
Ngành Ngọc Lan (Angiospermae)
Lớp Ngọc lan ( Dicotyledonea)
Bộ chè (Theales)
Họ chè (Theaceae)
Chi chè (Camellia hoặc Thea)

Đặc điểm:
- Thân gỗ, cao từ 6 đến 10 m.
- Lá to và dài 15 - 18 cm màu xanh nhạt, đầu lá dài, răng cưa nhỏ và dày.
- Tôm chè có nhiều lông tơ, trắng và mịn trông như tuyết, nên còn gọi là chè
tuyết. - Có khoảng 10 đôi gân lá.
- Có khả năng thích ứng trong điều kiện ấm ẩm, ở địa hình cao, năng suất

8


cao, phẩm chất thuộc loại tốt nhất.
Nguyên sản ở Vân Nam - Trung Quốc, miền Bắc của Miến Điện và
Việt Nam.
d) Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var.
assamica) Đặc điểm:
- Thân gỗ cao tới 17 m phân cành thưa.
- Lá dài tới 20 - 30 cm, mỏng, mềm, thường có màu xanh đậm, dạng lá hình bầu
dục, phiến lá gợn sóng, đầu lá dài.
- Có trung bình 12 - 15 đôi gân lá.
- Rất ít hoa quả.
- Không chịu được rét hạn.
- Năng suất, phẩm chất tốt.
Trồng nhiều ở Ấn Độ, Miến Điện, Vân Nam (Trung Quốc) và một số
vùng khác.
1.1.2

Nguồn gốc và phân bố
a) Nguồn gốc
Nguồn gốc cây chè là vấn đề phức tạp, cho đến nay có nhiều quan điểm khác
nhau về nguồn gốc cây chè, dựa trên những cơ sơ về lịch sử, khảo cổ học và thực

chè dại này lên phía Bắc với các điều kiện khí hậu khắc nghiệt hơn, chúng sẽ
thích hợp dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có thành phần catechin phức
tạp hơn, cùng với tạo thành (-) epigalocatechin và các galat của nó. Điều đó có
nghĩa là trao đổi chất ở đây hướng về phía tăng cường quá trình hidroxil hóa và
galil hóa. Từ những biến đổi hóa sinh này của các cây chè dại và cây chè được
trồng trọt, chăm sóc cho phép đi tới một kết luận mới là “ Nguồn gốc cây chè
chính là ở Việt Nam”. Từ đó có sơ đồ tiến hóa cây chè thế giới sau đây: Camellia
→ Chè Việt Nam → Chè Vân Nam lá to → Chè Trung Quốc → Chè Assam (Ấn
Độ ).
Tuy có sự khác nhau nhưng quan điểm nêu trên đều có sự thống nhất rằng:


cây chè có nguồn gốc từ Châu Á, nơi có điều kiện khí hậu nóng, ẩm.
Hiện nay cây chè phân bố khá rộng rãi trong những điều kiện tự nhiên rất
khác nhau, từ 30 vĩ độ nam (Natan – Nam Phi) đến 45 vĩ độ bắc (Gruzia – Liên
Xô), là những nơi có điều kiện tự nhiên rất khác xa vùng nguyên sản.
b)

Phân bố
Sự phân bố của cây chè phụ thuộc nhiều vào điều kiện khí hậu. Các kết quả

nghiên cứu đều đưa đến một kết luận chung là: Vùng khí hậu nhiệt đới, á nhiệt
đới thích hợp cho cây chè. Ngày nay, do trình độ khoa học kỹ thuật ngày càng
phát triển đã lai tạo, chọn lọc ra nhiều giống chè khác nhau và được trồng rộng rãi
ở nhiều nước khác nhau trên thế giới. Theo Đỗ Ngọc Quỹ[10], thì hiện nay chè
được phân bố khá rộng từ 42º vĩ Bắc Pochi (Liên Xô cũ) đến 27º Nam Coriente
(Achentina).
Sự phân bố của cây chè theo điều kiện khí hậu đất đai và địa hình cũng có sự
khác nhau. Đất trồng chè tốt phải nhiều mùn, thoát nước tốt và có độ dốc thoải.
Ảnh hưởng của độ cao đã hình thành nên các vùng chè với nhiều giống chè, chất

thay đổi về hình dạng, màu sắc và kích thước tùy theo giống, điều kiện tự nhiên
và điều kiện canh tác. Các độ tuổi khác nhau của lá chè tạo ra các các sản phẩm
chè có chất lượng khác nhau do thành phần hóa học trong các lá này khác nhau.
Hoa: Hoa chè là loại hoa lưỡng tính, trong hoa có 5 - 8 cánh màu trắng, có khi
lại hơi phớt hồng. Tràng có 5 - 9 cánh màu trắng hay phớt hồng, bộ nhị đực trung
bình có 200 - 300 cái; bao phấn có hai nửa bao, chia 4 túi phấn, hạt phấn hình tam
giác màu vàng nhạt (khi chín màu hoàng kim). Bầu nhị cái có 3 - 4 ô, chứa 3 - 4
noãn, ngoài phủ lớp lông tơ, núm nhị cái chẻ ba. Ở gốc bầu nhụy có tuyến mật
làm thành một vòng tròn gọi là đĩa.
Quả: Quả chè là một loại quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả chè có dạng hình tròn,
tam giác, vuông tùy theo số hạt. Khi còn non quả chè có màu xanh, khi chín
chuyển xang màu xanh thẫm hoặc nâu. Khi quả chín vỏ nứt ra giải phóng các hạt
chè. Kích thước của hạt phụ thuộc vào giống, kỹ thuật canh tác. Hạt chè có khối
lượng từ 0,6 – 2g thường từ 1- 1,6g.
Hạt: Hình cầu, bán cầu, tam giác tùy giống chè; vỏ sành thường màu nâu,
cứng, bên trong là lớp vỏ mỏng.


Hệ rễ: Gồm rễ cọc (trụ), rễ dẫn (hay rễ nhánh, rễ bên) màu nâu hay nâu đỏ và
rễ hút hay rễ hấp thụ màu vàng ngà.
Đặc tính sinh lý, sinh thái của cây chè
Nhiệt độ không khí thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của chè là 22 28oC, độ ẩm không khí tương đối thích hợp là 80 - 85 %. Hàm lượng nước cần
thiết cho cây chè biến động tùy từng giống chè. Loại đất thích hợp cho trồng chè
dày 60 – 100 cm; mực nước ngầm dưới 100 cm; độ chua pH: 4,5 - 5,5; tỷ lệ mùn
3 - 4 %.
Sinh trưởng và phát triển của cây chè
Sự phát triển của cây chè chia làm hai chu kỳ: Chu kì phát triển lớn gồm
suốt đời sống cây chè từ khi hạt nảy mầm đến khi cây chết và chu kì phát triển
nhỏ bao gồm các giai đoạn sinh trưởng, phát triển lặp lại nhiều lần trong một
năm.

trình biến đổi sinh hóa trong búp chè và đến sự hoạt động của các men, là chất
quan trọng không thể thiếu được để duy trì sự sống của cây. Hàm lượng nước
trong búp chè thay đổi tùy theo giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời
gian hái và tiêu chuẩn hái v.v... Trong búp chè (tôm + 3 lá) hàm lượng nước
thường có từ 75 - 82%. Để tránh khỏi sự hao hụt những vật chất trong búp chè
qua quá trình bảo quản và vận chuyển, phải cố gắng tránh sự giảm bớt nước trong
búp chè sau khi hái.
Tanin: Tanin là một trong những thành phần chủ yếu quyết định đến phẩm
chất chè. Tanin còn gọi chung là hợp chất fenol, trong đó 90% là các dạng
catechin. Tỷ lệ các chất trong thành phần hỗn hợp của tanin chè không giống
nhau và tùy theo từng giống chè mà thay đổi. Những hợp chất này dựa vào tính
chất của chúng có thể phân thành:
- Dạng tan được trong este: phân tử lượng 320 - 360.
- Dạng tan trong nước hoặc xeton: phân tử lượng 420 - 450.
- Dạng kết hợp với protein (chỉ sau khi dùng dung dịch NaOH 0,5% để xử lý,
mới có thể hòa tan trong dung dịch).
Các dạng catechin như epicatechin galat, epigalocatechin galat tham gia vào
quá trình sinh trưởng của cây.


Về mặt phẩm chất chè, tanin giữ vai trò chủ yếu trong việc tạo thành màu
sắc, hương vị của chè (nhất là đối với việc chế biến chè đen), vì vậy trong quá
trình trồng trọt cần chú ý nâng cao hàm lượng tanin trong nguyên liệu.
Tanin được dùng trong y học để làm thuốc cầm máu, nó có khả năng tăng
cường sức đề kháng của thành huyết quản trong cơ thể động vật, tăng cường sự
tích lũy và đồng hóa sinh tố C.
Ancaloit: Trong chè có nhiều loại ancaloit nhưng nhiều nhất là cafein. Hàm
lượng cafein ở trong chè có từ 3 - 5% thường nhiều hơn cafein ở trong lá cà phê
từ 2 - 3 lần. Nó không có khả năng phân ly ion H+ tức là không có tính axít mà
chỉ là một kiềm yếu. Cafein chỉ hòa tan trong nước với tỷ lệ 1/46, rất dễ hòa tan

Diệp lục và các sắc tố khác gần nó: Trong lá chè có chứa diệp lục tố, carotin
và xantofin. Các sắc tố này biến động theo giống, theo mùa và các biện pháp kỹ
thuật canh tác.
Trong chè thành phẩm diệp lục tố có ảnh hưởng xấu tới phẩm chất của chè
bởi vì làm cho sản phẩm có màu xanh, mùi hăng, vị ngái.
Dầu thơm: Dầu thơm ở trong chè rất ít, hàm lượng của chúng trong lá chè
tươi: 0,007% - 0,009% và trong chè bán thành phẩm: 0,024 - 0,025%. Hàm
lượng dầu thơm trong lá chè, được tăng dần ở những địa hình cao, tuổi lá quá
non chứa ít hương thơm. Dầu thơm ảnh hưởng trực tiếp đến hương vị của chè do
hương thơm tự nhiên và do quá trình chế biến tạo thành như sự lên men, ôxi
hóa, tác dụng của độ nhiệt cao.
Dầu thơm có tác dụng điều tiết sinh lý của cây để thích hợp với điều kiện bên
ngoài (khi độ nhiệt quá cao hay quá thấp) và ngăn cản những bức xạ có bước
sóng ngắn, tác hại đến cây chè. Đối với cơ thể con người dầu thơm có tác dụng
kích thích hệ thần kinh trung ương làm cho tinh thần minh mẫn, thoải mái dễ
chịu nâng cao hiệu suất làm việc của các cơ năng trong cơ thể.


Vitamin: Các loại vitamin có trong chè rất nhiều. Chính vì vậy giá trị dược
liệu cũng như giá trị dinh dưỡng của chè rất cao. Theo các tài liệu của Trung
Quốc, hàm lượng một số vitamin trong chè tính theo mg/1.000g chất khô như
sau: Vitamin A: 54,6; B1: 0,70; B2: 12,20; PP: 47,0; C: 27,0 v.v...
Đáng chú ý nhất là hàm lượng vitamin C ở trong chè, nhiều hơn trong cam
chanh từ 3 đến 4 lần. Quá trình chế biến chè đen làm cho vitamin C giảm đi
nhiều vì nó bị ôxi hóa, còn trong chè xanh thì nó giảm đi không đáng kể.
Men: Men là nhân tố quan trọng của sự sống. Men quyết định chiều
hướng phát triển của mọi phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sinh vật và
chúng là chất kích động tất cả các biến đổi hóa học.
Trong búp chè non có hầu hết các loại men, nhưng chủ yếu gồm hai nhóm
chính:

Giá trị về mặt kinh tế xã hội: Cây chè giữ vai trò quan trọng trong cơ cấu cây
trồng nông nghiệp, sản phẩm chè là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của ngành
nông nghiệp Việt Nam. Sản xuất chè đã góp phần tạo công ăn việc làm, xóa đói
giảm nghèo, tạo nguồn thu nhập ổn định cho người dân và thúc đẩy quá trình
công nghiệp hóa, hiện đại hóa nông thôn, nhất là vùng Trung du và miền núi.
Ngoài ra, trồng chè còn giúp phủ xanh đất trống đồi trọc, chống sói mòn đất,
bảo vệ môi trường…
Giá trị về mặt văn hóa: Lá chè được sử dụng không chỉ để chế biến thức uống
phục vụ nhu cầu của con người, mà từ lâu chè thành phẩm đã trở thành nét văn
hóa đặc trưng của nhiều quốc gia. Uống chè là nét văn hóa lâu đời của người Việt
Nam, mang một giá trị thiêng liêng, cao quý trong đời sống tinh thần của con
người. Thưởng thức chè là một thú vui tao nhã, tạo được cảm hứng trong văn thơ,
hội họa… Ở Việt Nam chè không thể thiếu trong lễ nghi giao tiếp, giáo dục, cưới
xin, ma chay, hội hè….
1.2
1.2.1

Thư viện cDNA/EST
Giới thiệu về cDNA/EST
a) Định nghĩa
EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thường dài từ 200 - 500 nucleotide)
được tạo ra từ một hoặc cả hai đầu của một gen biểu hiện (từ đầu 5’ hay 3’ của
cDNA). Gồm có 5’EST và 3’EST


Hình 1.1: Sơ đồ hình thành EST
-

5’ EST được tạo ra từ một phần đầu 5’ của cDNA, có khuynh hướng bảo


truyền để xác định vị trí nhiễm sắc thể của một gen đặc biệt. Một khi vị trí
nhiễm sắc thể đã được xác định, các nhà khoa học sẽ sử dụng những phương
pháp hóa sinh để phân lập gen và protein tương ứng. Dù bằng cách nào thì
những phương pháp này đều tốn nhiều thời gian, có trường hợp nhiều năm, và
kết quả là chỉ có vị trí và sự miêu tả của một số lượng phần trăm nhỏ của gen
đƣợc tìm thấy.
Tuy nhiên, thời gian đòi hỏi cho việc định vị và mô tả hoàn toàn một gen
đã giảm xuống đáng kể nhờ sự phát triển và hướng tiếp cận của một kĩ thuật
được dùng để tạo ra Expressed Sequence Tag hay EST. EST cung cấp cho nhà
nghiên cứu một phương pháp nhanh chóng và không tốn kém cho việc khám
phá các gen mới, tìm được dữ liệu về sự biểu hiện và điều hòa gen, và cho việc
thành lập bản đồ gen.
Ý tưởng là giải trình tự những mảnh DNA mà chúng đại diện cho những
gen biểu hiện trong tế bào, mô hay cơ quan nào đó từ những sinh vật khác nhau
và sử dụng những sự đánh dấu này để tìm ra được gen bằng sự bắt cặp giữa các
nucleotide. Thách thức kết hợp việc xác định gen từ trình tự bộ gen biến đổi
giữa các sinh vật và độc lập với kích thước bộ gen cũng như sự hiện diện hay
vắng mặt của intron, nó là những trình tự DNA xen vào làm gián đoạn trình tự
mã hóa protein của một gen.
c)

Sự hình thành EST
cDNA đại diện cho 1 gen biểu hiện đã được phân lập, các nhà khoa học sau

đó có thể giải trình tự vài trăm nucleotide từ đầu này hay đầu kia của phân tử để
tạo ra hai loại EST khác nhau.


Sử dụng mRNA để tạo cDNA
cDNA là một dạng của DNA đượcc tạo ra trong các phòng thí nghiệm, sử dụng

trong nghiên cứu sinh học phân tử như: xác định thành phần, cấu trúc của protein
được mã hóa bởi đoạn DNA cụ thể, biểu hiện gen của eukaryote trong tế bào
prokaryote, nghiên cứu sự biểu hiện của mRNA, và rất nhiều ứng dụng cụ thể
khác. cDNA (complementary DNA, copy DNA) được tạo từ mRNA trưởng thành
(mature mRNA) sử dụng enzyme Reverse transcriptase. Ở eukaryote, mRNA có
đuôi poly Adenine để phân biệt với các loại RNA khác, đồng thời giữ vai trò tạo
đọan mồi (primer) trong quá trình phiên mã ngược. Để xây dựng thư viện cDNA
nhất thiết phải tạo dòng cDNA tức là tạo số lượng lớn bản sao cDNA dựa vào cấu
trúc của mRNA hoặc lượng nhỏ cDNA ban đầu và sự hỗ trợ của thành tựu công
nghệ sinh học. Có nhiều phương pháp tạo thư viện cDNA/EST, tuy nhiên các
phương pháp này chỉ khác nhau ở phương pháp tổng hợp cDNA. Dưới đây là
phương pháp tạo thư viện cDNA/EST, trong đó cDNA được tổng hợp bằng kỹ
thuật RT-PCR:
- Tách chiết RNA tổng số
Nguyên tắc chung: phân tử RNA không bền dễ bị phân huỷ bởi các enzim
ribonuclease và các enzim này thì có mặt ở khắp nơi, có hoạt tính rất cao và rất
bền vững với các tác nhân thường dung để loại enzim. Do vậy việc tách chiết


RNA đòi hỏi rất thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm từ ribonuclease từ môi
trường, thao tác phải trong điều kiện vô trùng.
Tách RNA toàn phần. Gồm ba bước cơ bản như tách chiết DNA.
+ Bước 1: Tế bào và mô được nghiền trong dung dịch hỗn hợp chất tẩy mạnh và
tách protein lien kết ra khỏi RNA.
+ Bước 2: Loại bỏ protein khỏi mẫu qua xử lí phenol chlorophorm và li tâm. +
Bước 3: Tủa RNA hoà tan trong pha nước bằng etanol và li tâm để thu nhận lại. .
- Tinh sạch RNA: 90 -99% RNA tổng số trong tế bào là tRNA, rRNA các loại
RNA này có kích thước và trình tự xác định nên có thể tách riêng bằng điện di
và li tâm. Riêng mRNA chiếm từ 1- 5% có kích thước và trình tự vô cùng đa
dạng song chúng có một điểm chung là có đuôi poliA nhờ đó có thể tách nó

khả năng chịu hạn. Fumiya Taniguchi và cộng sự đã xây dựng thư viện
cDNA/EST từ 7 bộ phận khác nhau của cây chè và tìm ra 17.458 đoạn EST.
Thư viện cDNA/EST cung nguồn thông tin cho các nghiên cứu nhằm tìm
hiểu các quá trình sinh lí quan trọng liên quan đến quá trình sinh trưởng của chè
như: quá trình đồng hóa nitơ, chuyển hóa axit amin. Các gen quy định chất lượng
chè như các gen liên quan đến việc chuyển hóa các hợp chất thứ cấp ( catechin và
cafein)
(Breed Sci. 2012 Jun; 62(2): 186–195.
Published online 2012 Jun 19. doi: 10.1270/jsbbs.62.186
PMCID: PMC3405963

Expressed sequence tags from organ-specific cDNA
libraries of tea (Camellia sinensis) and polymorphisms
and transferability of EST-SSRs across Camelliaspecies
Fumiya Taniguchi,1,2,* Hiroyuki Fukuoka,3 and Junichi Tanaka1,2,4

/>