Header Page 1 of 148.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Út Lợt

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT
CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH
NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU
CALCIUM VÀ PROTEIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – 2012

Footer Page 1 of 148.


Header Page 2 of 148.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Nguyễn Thị Út Lợt

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI SINH VẬT
CHẾ BIẾN XƯƠNG CÁ TRA THÀNH
NGUYÊN LIỆU THỰC PHẨM GIÀU

nghiệp đã luôn bên cạnh ủng hộ tôi.

Footer Page 3 of 148.


Header Page 4 of 148.

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi, các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong
bất kỳ công trình nghiên cứu nào. Các tài liệu tham khảo đều có nguồn gốc xác
thực.
Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Út Lợt

Footer Page 4 of 148.


Header Page 5 of 148.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... ii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iii
DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN ................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .......................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ...........................................................................................x
DANH MỤC CÁC BẢNG ...........................................................................................xi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................1

2.4.3 Định danh VK bằng phương pháp sinh học phân tử [33] ........................... 40
2.4.4 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm KL [22] [29] [32] ........... 41
2.4.5 Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp khuếch tán trên thạch [11]42
2.4.6 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến [11] [20] .... 44
2.4.7 Phương pháp định tính acid lactic [16] [21] ............................................... 45
2.4.8 Phương pháp định lượng acid tổng [2] [21] .............................................. 46
2.4.9 Phương pháp xác định độ ẩm [3] [10] ........................................................ 46
2.4.10 Phương pháp định lượng calcium [3] [10]................................................ 47
2.4.11 Định lượng đạm tổng số (phương pháp Kjeldahl) [3] [10] ...................... 48
2.4.12 Định lượng đạm formol (phương pháp Sorensen) [3] [10] ...................... 50
2.4.13 Phương pháp xác định đạm ammoniac [3] [10] ....................................... 51
2.4.14 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 53

CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ..............................................................54
3.1 Khảo sát thành phần hóa học của bột xương cá tra ......................................54
3.2 Đặc điểm sinh học của Bacillus và VK lactic ..................................................54
3.2.1 Bacillus ....................................................................................................... 55
3.2.2 VK lacic ...................................................................................................... 56
3.2.3 Kết quả định danh đến loài bằng sinh học phân tử ..................................... 58
3.3 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh tổng
hợp protease và acid của 2 chủng VK nghiên cứu ...............................................59
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh
tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens .............................................. 59

Footer Page 6 of 148.


Header Page 7 of 148.

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng sinh


Hàm lượng calcium
Hiệu suất thu nhận đạm hòa tan

HSTP

Hiệu suất thủy phân

KL

Khuẩn lạc

MT

Môi trường

NF

Nitrogen formol

N NH3

Nitrogen ammoniac

N TS

Nitrogen tổng số

NL


Hình1.2: Lactobacillus casei ................................................................................................. 10
Hình1.3: Lactobacillus bulgaricus ........................................................................................ 11
Hình 1.4: Lactobacillus brevis ............................................................................................... 12
Hình 1.5: Cá tra ....................................................................................................................... 7
Hình 1.6: Sữa giàu calcium .................................................................................................. 21
Hình 1.7: Một số dược phẩm giàu calcium ......................................................................... 22
Hình 1.8: Một số thực phẩm bổ sung calcium .................................................................... 22
Hình 3.1: Bột xương cá tra ................................................................................................... 54
Hình 3.2: Hình thái KL của Bacillus (x4) ........................................................................... 55
Hình 3.3: Hình thái tế bào của Bacillus (x100) ................................................................... 55
Hình 3.4: Bào tử của Bacillus (x100) ................................................................................... 55
Hình 3.5: Bacillus có catalase dương tính ........................................................................... 56
Hình 3.6: Vòng phân giải casein của Bacillus có hoạt tính protease ................................ 56
Hình 3.7: Hình thái KL của VK lactic (x4) ......................................................................... 57
Hình 3.8: Hình thái tế bào của VK lactic (x100) ................................................................ 57
Hình 3.9: VK lactic có catalase âm tính .............................................................................. 58
Hình 3.10: Định tính acid lactic bằng thuốc thử Uphermen ............................................. 58
Hình 3.11: Vòng phân giải casein của Bacillus amyloliquefaciens khi được nuôi ........... 60
cấy ở các khoảng thời gian khác nhau ................................................................................ 60
Hình 3.12: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ protease của ........................ 60

Footer Page 9 of 148.


Header Page 10 of 148.

Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 60
Hình 3.13: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến hoạt độ protease của ..................................... 62
Bacillus amyloliquefaciens .................................................................................................... 62
Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến hoạt độ protease của ........................... 63

cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ........................................................ 85
Hình 3.29: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình
trích ly calcium từ xương cá tra ........................................................................................... 86
Hình 3.30: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá
tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ........................................................................... 87
Hình 3.31: Dịch xương cá tra ............................................................................................... 88

Footer Page 11 of 148.


Header Page 12 of 148.

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1: Quá trình lên men lactic đồng hình (nét liền) và dị hình (nét đứt) ............. 13
Sơ đồ 2.1: Sơ đồ thí nghiệm xử lý phụ phẩm cá tra bằng VSV tạo nguyên liệu
TP giàu calcium và protein ............................................................................................... 28
Sơ đồ 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp protease của Bacillus amyloliquefaciens.................................................. 31
Sơ đồ 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện MT nuôi cấy lên khả năng
sinh acid của Lactobacillus casei ...................................................................................... 33
Sơ đồ 2.4: Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein
từ xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens .................................... 35
Sơ đồ 2.5: Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium của
xương cá tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ..................................................... 36

Footer Page 12 of 148.


Header Page 13 of 148.

Lactobacillus casei ................................................................................................................ 71
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng sinh acid của ................................ 72
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 72
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nồng độ sucrose đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 74
Bảng 3.16: Ảnh hưởng của pH ban đầu của MT đến khả năng sinh acid của
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 75
Bảng 3.17: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh acid của .................................... 76
Lactobacillus casei ................................................................................................................ 76
Bảng 3.18: Động học quá trình lên men của Lactobacillus casei..................................... 78
Bảng 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ nước đến quá trình thủy phân protein từ
xương cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens........................................... 80
Bảng 3.20: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens đến
quá trình thủy phân protein từ xương cá tra ................................................................... 82
Bảng 3.21: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 83
Bảng 3.22: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình thủy phân protein từ xương
cá tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens ...................................................... 84
Bảng 3.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch lên men Lactobacillus casei đến quá trình
trích ly calcium từ xương cá tra .......................................................................................... 86
Bảng 3.24: Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly calcium từ xương cá
tra bằng dịch lên men Lactobacillus casei ......................................................................... 87
Bảng 3.25: Một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra sau thủy phân
protein và trích ly calcium bằng VSV ................................................................................ 88

Footer Page 14 of 148.


Header Page 15 of 148.


Footer Page 15 of 148.


Header Page 16 of 148.

- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của xương cá tra.
- Khảo sát ảnh hưởng các điều kiện MT nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
protease của Bacillus amyloliquefaciens và khả năng sinh acid của Lactobacillus
casei.
- Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân protein từ xương cá
tra bằng dịch nuôi cấy Bacillus amyloliquefaciens.
- Xác định điều kiện thích hợp cho quá trình trích ly calcium từ xương cá tra
(sau khi tách protein) bằng dịch lên men Lactobacillus casei.
- Phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa của dịch xương cá tra đã được xử lý bằng
VSV.

Footer Page 16 of 148.


Header Page 17 of 148.

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tổng quan về vi sinh vật nghiên cứu
1.1.1 Vi khuẩn Bacillus
1.1.1.1 Đặc điểm chung
* Vị trí phân loại
Bacillus là giống lớn, đa dạng (có khoảng 48 loài). Theo Ferdinand Cohn
(1872), Bacillus (VK tạo nội bào tử) có vị trí phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes

thí nghiệm, Bacillus có thời gian thế hệ là 25phút. [41]
* Về hình thái
KL khô, không màu hoặc màu trắng xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra một lớp
màng mịn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi, lõm nhiều hay ít bám
chặt vào môi trường thạch. [5] [45] [65]
Tế bào hình que, kích thước 0.3 - 2.2 x 1.2 - 7µm [41], tế bào thường nối với
nhau thành chuỗi có độ dài khác nhau hoặc tạo ra lớp riêng rẽ [45] [65]. Bào tử có
dạng hình cầu elip hay hình trụ tròn nằm trong khoảng trung tâm đến gần cuối tế
bào và túi bào tử phồng hoặc không phồng, bào tử có kích thước 0.6 - 0.9 x 1.0 1.5µm. [43] [68]
* Về sinh lý, sinh hóa
Bacillus là loại trực khuẩn Gram dương, phản ứng Gram của Bacillus có thể
thay đổi trong chu trình sống của nó, chỉ những tế bào còn non mới chắc chắc là
Gram dương. Chúng có sinh bào tử [43], khác với tế bào dinh dưỡng, vách bào tử
mỏng, không bắt màu phẩm nhuộm được bao bọc bởi vỏ trong có cấu tạo từ glycan
peptid và vỏ ngoài nên nó bị khúc xạ ánh sáng mạnh hơn, khó nhuộm màu, bền với
nhiệt và các yếu tố phá hủy khác. Tế bào khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm
mao. [1]
Hầu hết các loài thuộc chi Bacillus sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Là
những sinh vật hóa dị dưỡng thu năng lượng nhờ sự oxi hóa các hợp chất hữu cơ,
chúng có khả năng sử dụng chất hữu cơ do nhiều nguồn cơ chất khác nhau cung cấp
như tinh bột, đường, protein đến chất béo, một số VK tự dưỡng không bắt buộc
(Bacillus schlegelli). Chúng có khả năng phát triển trong MT chỉ có CO 2 và tạo ra
ATP thông qua quá trình lên men butandiol cũng như amon hóa nitrate. [36] [46]

Footer Page 18 of 148.


Header Page 19 of 148.

Chu trình sống của Bacillus được chia ra làm 3 giai đoạn: tăng trưởng sinh dưỡng,


Header Page 20 of 148.

dụng để sản xuất lysine, lên men đậu nành [38]. Bacillus amyloliquefaciens được
thế giới sử dụng để sản xuất α – amylase và protease ở quy mô công nghiệp.
+ Ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thuộc da. Việc xử lý da bằng cách sử
dụng enzyme là tốt nhất vì nó mang lại nhiều lợi thế: dễ kiểm soát, nhanh chóng và
giảm được chất thải. Xử lý bằng enzyme sẽ tiêu hủy các sắc tố không mong muốn,
từ đó có được da sạch [42]. George và cộng sự (1995) sử dụng protease kiềm của
B. amyloliquefaciens cho việc làm rụng lông và da.
- Trong nông nghiệp: Do Bacillus có khả năng tạo bào tử, sinh các loài enzyme
ngoại bào và khả năng đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh như Streptococcus
pyogenes, E. coli, Salmonella, Vibrio sp, ... nên được sử dụng làm probiotic. [25]
[35] Ví dụ như Bacillus subtilis bổ sung trong thức ăn chăn nuôi nhằm cải thiện tiêu
hóa, sức tăng trưởng, giảm sự tái phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao
nuôi nhằm duy trì chất lượng nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi [38]. Yerra
Koteswara Rao và cộng sự (2006) đã nghiên cứu và chứng minh được
chủng Bacillus amyloliquefaciens B128 là một tác nhân kiểm soát sinh học
đối với Botrylis elliptica (mầm bệnh màu xám mốc trên hoa huệ).
- Bảo vệ môi trường: Một số loài thuộc chi này có khả năng sinh protease và
cellulase với hoạt tính khá cao như Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefacien,
Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus megaterium, ... người ta sử dụng
chúng làm phân bón hữu cơ để thủy phân protein thực vật và động vật có trong rác
hữu cơ hoặc sử dụng để xử lý rác thải [38][23]. Ngoài ra, chúng còn là một trong
những thành phần của sản phẩm dùng để xử lý môi trường nuôi tôm và thức ăn bổ
sung cho tôm. Thành phần của các sản phẩm này là các VSV (Pseudomonas
fluorescens, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Lactic bacteria,
Rhodotorula mucilaginosa, Rhodosporidium toruloides) mà trong đó mỗi loại giữ
một chức năng riêng và tổng của các sản phẩm là hệ VSV có ích, giúp cho con tôm
phát triển khoẻ mạnh, chống lại được một số bệnh và điều kiện khắc nghiệt [50].

Theo khóa phân loại của Bergey (1957), VK lactic thuộc: [44]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus, Pediococcus
Họ: Enterococcaceae

Footer Page 21 of 148.


Header Page 22 of 148.

Giống: Enterococcus
Họ: Leuconoscaceae
Giống: Leuconostoc
Ho: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus, Lactococcus

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của VK lactic [47]
* Môi trường sống
Trong tự nhiên, VK lactic thường gặp trong đất, nước, không khí, nhưng chủ
yếu là ở thực vật (rau, quả, ...) và các sản phẩm lên men (sữa chua, nem chua, dưa
muối chua, ...). Chúng tồn tại trong đường ruột (có nhiều VK lactic thuộc
Enterococcus và Lactobacillus, trong đó VK Lactobacillus chiếm số lượng nhiều
nhất) và miệng của cơ thể người và động vật [20].
VK lactic không thể phát triển được trong môi trường muối khoáng thuần khiết
chứa glucose, NH 4 +. Đa số chúng cần hàng loạt vitamin và các acid amin.
Nhiệt độ sinh trưởng tối thích của VK lactic ưa ấm là 25 - 350C, ưa nhiệt 40 450C và ưa lạnh là thấp hơn 50C. Khi gia nhiệt khoảng 60 - 800C thì hầu hết chúng
bị chết sau 10 - 30phút.

phần của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được
sử dụng trong phân loại.
VK lactic trao đổi chất chủ yếu bằng quá trình lên men. VK lactic có thể lên
men được các đường monosaccharid, disaccharid, protein tan, pepton, ... Phần lớn
chúng không lên men tinh bột và các polisaccharid khác. Khi nghiên cứu về khả
năng lên men lactic từ nguyên liệu chứa đường, người ta thấy có hai nhóm VK

Footer Page 23 of 148.


Header Page 24 of 148.

lactic chuyển hóa đường hoàn toàn khác nhau: VK lactic đồng hình và VK lactic dị
hình [20].
* VK lactic đồng hình
- Lactobacillus casei [6] [20] [67]
+ Là những trực khuẩn nhỏ, có kích
thước rất ngắn. Chúng có thể tạo thành chuỗi,
không chuyển động, Gram dương.
+ Yếm khí tuỳ tiện; lên men tốt glucose,
maltose, lactose tạo ra môi trường có từ 0,8% 1% axit lactic; và không tạo catalase.
Hình1.2: Lactobacillus casei
+ Nguồn nitơ cho vi khuẩn này là peptone. Chúng thuỷ phân casein và
gelatin rất yếu.
+ Nhiệt độ tối thiểu cho chúng phát triển là 10oC, t0 opt từ 28 - 320C.

Footer Page 24 of 148.


Header Page 25 of 148.