TÊN CHUYÊN ĐỀ

Trình bày nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng pha
thường (NP-LC); cấu tạo máy GC, đưa ra và nói rõ một
số ứng dụng trong thực phẩm.

Sinh viên thực hiện:
1. Lại Đào Hiếu Hạnh

15116017

2. Bùi Thị Thanh Hằng

15116018

3. Huỳnh Quang Thúy Hằng

15116019

4. Phạm Trọng Hiếu

15116020

Thời gian thưc hiện: Sáng Thứ 5

Đánh giá của giảng viên:

1


PHƯƠNG PHÁP SẮC LỎNG KÝ PHA THƯỜNG ( NP-LC)

gian. Mỗi một thành phần đi qua hệ thống trong một khoảng thời gian riêng biệt, gọi là
thời gian lưu. Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp được chuyên chở trong chất lỏng hoặc khí
và các thành phần của nó được tách ra do sự phân bố khác nhau của các chất hòa tan khi
chúng chảy qua pha tĩnh rắn hoặc lỏng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được dùng đểphân
tích hợp chất phức tạp dựa trên ái tính khác nhau của các chất trong môi trường động khí
hoặc lỏng và đối với môi trường hấp phụtĩnh mà chúng di chuyển qua như giấy, gelatin
hay gel magnesium silicate,... Sắc ký là phương pháp để phân tách và tinh sạch các phân
tử sinh học. Sắc ký là phương pháp nhanh, dễ dàng và không ảnh hưởng đến protein, đây
là phương pháp được đề nghịtrong nghiên cứu định lượng protein hay các phân tử.
2.Khái niệm và nguyên tắc phương pháp sắc ký lỏng:
a.Khái niệm sắc ký lỏng:
Sắc ký lỏng là phương pháp tách sắc ký các chất dựa trên sự phân bố khác nhau
của chúng giữa hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là một chất lỏng chảy qua pha
tĩnh chứa trong cột.
_ Sắc ký lỏng được tiến hành chủ yếu dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao
đổi ion,loại trừ theo kích thước hoặc tương tác hoá học lập thể.
b.Phương pháp sắc ký lỏng pha thường:
b.1.Nguyên tắc chung sắc ký lỏng:
Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại
sắc ký .
+ Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo .
+ Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion .
+Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết .
+Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký sel hay rây phân tử .
Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột ,chúng ta cần có một pha
động .
Như vậy nếu chúng ta nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C .. Vào
cột phân tích ,kết quả các chất A,B,C.. Sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.Quyết
định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp các tương tác .
_ Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử .

b.2.Một số đặc điểm phương pháp sắc ký lỏng pha thường:
Không phải là hình thức được sử dụng phổ biến nhất của HPLC.
Cột được làm đầy với các hạt silica nhỏ xíu, và dung môi không phân cực hexane, ví dụ. Một cột điển hình có đường kính 4,6 mm (có thể ít hơn), và chiều dài 150250 mm.
Các hợp chất có cực trong hỗn hợp qua cột sẽ bị giữ trên cột lâu hơn so với các
hợp chất không phân cực. Những chất không phân cực do đó sẽ vượt qua cột nhanh hơn.
b.3.Đặc trưng cơ bản xảy xa trong phương pháp sắc ký lỏng pha
thường:

_ Trong hệ thống sắc ký đầu tiên người ta sử dụng:
+ CaCO3 làm chất nhồi cột ( pha tĩnh).
+ Petroleum ether làm dung môi pha động.
 Cột mang tính phân cực và pha động mang tính không phân cực.

_ Các loại cột sử dụng trong sắc lỏng ký pha thường:
-Si-CH2CH2CH2CN

+ Cột Silica gel: dùng đa mục đích.

-Si-CH2CH2CH2NH2
5

-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)CH2(OH)


+ Cột Cyano:dung đa mục đích.
+ Cột Amino: phân tích đường.
+ Cột Diol: phân tích protein.
Si

Si

định.
II.Cấu tạo máy GC:
Hệ thống sắc ký khí bao gồm các thành phần cơ bản như sau:

1.Nguồn cung cấp khí mang:

7


Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ
không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…).
2. Lò cột:
Dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích
3. Bộ phận tiêm mẫu:
Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể
thay đổi. Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia
dòng (splitless).
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động
(Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace).
4. Cột phân tích:
Có 2 loại cột: cột nhồi và cột mao quản.
+Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường ính 24mkm
và chiều dài 2-3m.
+Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có
đường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m.

Cột nhồi và cột mao quản
5. Đầu dò:
Các loại đầu dò thông dụng bao gồm đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID) và đầu dò dẫn
nhiệt (TCD). Cả 2 loại đầu dò này đều nhạy với hầu hết chất phân tích với các nồng độ

+ Đầu dò quang hóa ion (PID)
+ Đầu dò ion hóa phóng xung (PDD)
+ Đầu dò ion hóa nhiệt (TID)
+ Đầu dò cực tím chân không (VUV)
9


+ Đầu dò hồng ngoại (IRD)
+ Đầu dò ion hóa Heli (HID)
+ Đầu dò độ dẫn điện phân (ELCD)…
6. Bộ phận ghi nhận tín hiệu:
Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
Đối với các hệ thống HPLC hiện đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi
nhận, lưu các thông số, sắc ký đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ
số phân giải,… đồng thời tính toán, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tích.
7. In dữ liệu
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có
cài phần mềm điều khiển.
*Một số hệ thống GC tại CASE
Cùng với sự phát triển của kỹ thuật sắc ký, sắc ký khí là công cụ hữu hiệu trong
nghiên cứu khoa học đặc biệt trong lĩnh vực hóa học phân tích. Phương pháp sắc ký khí là
một trong những phương pháp được sử dụng phổ biến trong việc phân tích các hợp chất
hữu cơ dễ bay hơi trong các loại nền mẫu.
Tại CASE, các hệ thống sắc ký khí của các hãng sản xuất thiết bị phân tích nổi
tiếng như Shimadzu (GC 2010, GC 2010 Plus), Perkin Elmer, Varian (3800), Thermo
Finnigan (Trace GC),… với các đầu dò như FID, ECD, NPD, FPD, TCD, MS có khả
năng phân tích được các hợp chất hữu cơ có bản chất khác nhau. Các hệ thống GC đều có
gắn các bộ phận chích mẫu tự động (Autosampler) và bộ phận hóa hơi (Headspace).

10

tích phân hóa diện tích các pic trở nên dễ dàng và thông dụng. Kết quả được báo cáo đầy
đủ các thông tin của pic như chiều cao pic, diện tích pic, phần trăm trong mẫu …
-

Các phương pháp tính toán định lượng:

***Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Đây là phương pháp tính thành phần phần trăm của mẫu bằng cách đo diện tích
từng pic trên sắc kí đồ. Theo cách này đem diện tích pic của chất quan tâm A cho tổng
diện tích
của các pic:
%A = (diện tích pic A/tổng diện tích các pic)x100 %
Khi phân tích thành phần có điểm sôi sát nhau của một dãy đồng đẳng, phương
pháp này có thể dùng để tính tỷ lệ phần trăm khối lượng.
12


Phương pháp này chỉ đúng nếu tất cả các cấu tử đều được rửa giải và đáp ứng
của detector với mọi cấu tử là giống nhau. Nếu những điều kiện này thỏa mãn thì đây là
phương pháp nhanh và hiệu quả.
*** Phương pháp tính theo hệ số hiệu chỉnh
Như đã biết detector đáp ứng khác nhau đối với các chất khác nhau. Vì vậy cần
phải tính hệ số hiệu chỉnh. Nhờ hệ số này có thể tính được thành phần phần trăm của các
cấu tử trong mẫu.
%A dientichcua A / F(A)
(dientichcua Ai / F (Ai))

Cách xác định hệ số hiệu chỉnh:
Tiêm dung dịch chuẩn đã biết nồng độ các cấu tử A, B, C… vào GC
Sắc kí đồ thu được có các pic phân giải hoàn toàn và diện tích thu được tương ứng

hành sắc kí hỗn hợp. Từ tỉ lệ diện tích đo được, bằng đường chuẩn tương đối vừa dựng ta
có tỉ lệ trọng lượng. Với trọng lượng chuẩn S thêm vào đã biết ta tính được trọng lượng
của chất X.
Phương pháp này có các ưu điểm:
Không cần biết đến đáp ứng của detector
Không cần duy trì nghiêm ngặt các đi ều kiện tiến hành sắc kí vì những thay đổi
được loại trừ theo cách tính tỷ số..
IV.Ứng dụng:
14


_Các hệ thống sắc ký khí với tất cả các loại đầu dò, CASE có thể phân tích được hầu hết
các hợp chất thuốc trừ sâu họ Chlor (Aldrin, Eldrin,…), họ Phospho (Chlorpyriphos,
Diazinon,…) họ Cúc (Cypermethrin, Deltamethrin,…), các loại thuốc diệt cỏ, diệt nấm
trong các nền mẫu nông sản, thực phẩm, thủy hải sản, môi trường… phục vụ công tác an
toàn vệ sinh cho các loại hàng hóa lưu thông trong nước và xuất khẩu.
_ Phân tích các chỉ tiêu trong nước theo quy chuẩn của Bộ Y tế (QCVN 01:2009/BYT) và
các quy chuẩn khác.
_ Phân tích dư lượng PCBs, PAHs, trong các nền mẫu thực phẩm, môi trường, nước,…
theo yêu cầu của các cơ quan quản lý trong và ngoài nước.
_ Phân tích các hóa chất POPs (Persistent Organic Pollutants) trong môi trường, thực
phẩm,…
_ Phân tích hơn 20 amino acid trong thực phẩm, phân bón, chế phẩm sinh học,…
_ Phân tích mẫu bệnh phẩm, mẫu ngộ độc: Methanol, Trichloroacetic, Benzen, Toluen,…
trong máu, nước tiểu.
_ Phân tích BTX (Benzen – Toluen – Xylen) và một số hợp chất bay hơi khác trong
không khí.
_ Phân tích các hoạt chất, hương liệu trong dược phẩm,… theo các dược điển Anh (BP),
Mỹ (USP), Nhật (JP), Châu Âu (EP), Việt Nam,…
_ Phân tích thành phần acid béo, cholesterol, và các thành phần khác theo yêu cầu trong

của lái xe dưới ảnh hưởng của rượu "(DUI) viết tắt được sử dụng trong nhiều huyện điều
chỉnh) phương pháp này có thể để xác định nồng độ cồn trong máu pháp y mang khí:..
helium, 20 mL / phút cột:. 6 ft × 2 mm kính ID det:.. FID tiêm: 1 ml lò: 85 ° C đóng gói:.
5% Carbowax 20M vào 60/80 Carbopack B xác định rượu (tức là ethanol) trong máu
hoặc nước tiểu Một ứng dụng rõ ràng là khi các cơ quan thực thi pháp luật cần phải xác
định có hay không một người nào đó là say xỉn. trong những trường hợp này, độ nhạy cao

16


là cần thiết kể từ 0,1% nồng độ cồn trong máu được coi là say sưa một cách hợp pháp ở
hầu hết các quốc gia
Sắc ký khí-Mass phổ (GC-MS) đã được sử dụng để điều tra sự khác biệt gây bệnh
ở một dạng ung thư theo giới tính và tình trạng mãn kinh. Trong một nghiên cứu được
xuất bản bởi BMC (dịch vụ BioMed Central xuất bản nghiên cứu ban đầu về ung thư).
Ung thư, các nhà khoa học đã tìm cách để đánh giá những thay đổi trong chuyển hóa
steroid tiết niệu ở nam giới và trước và sau mãn kinh phụ nữ bị ung thư tuyến giáp dạng
nhú (PTC). GC-MS đã được sử dụng để đo nồng độ trong nước tiểu của 84 steroid trong
tất cả các bệnh nhân chống lại các điều khiển tương ứng. Tỷ lệ trao đổi chất của estrone
2-hydroxy 2-hydroxy-17 bêta estradiol đặc biệt cho thấy sự khác biệt giới tính ở những
bệnh nhân PTC. Người ta hy vọng những phát hiện có thể giúp hiểu được sự khác biệt
gây bệnh trong PTC theo điều kiện giới tính và mãn kinh tốt hơn.

17