Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây
gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid
Chromatography).
1. Khái niệm
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở
phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phương
pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn
đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang
rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu
cơ. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do:
có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi
hoặc dễ phân hủy nhiệt.
Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích các hợp chất
thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnh vực thực
phẩm, dược phẩm, môi trường…
2. Phân loại
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia
HPLC thành 4 loại:
• Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography).
• Sắc ký phân bố (partition chromatography).
• Sắc ký ion (ion chromatography).
• Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography).
Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích
được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp
chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000).
SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và
pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký
pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography).
Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này

organochlorosilan để tạo ra các pha tĩnh không phân cực, phân cực trung bình hoặc
rất phân cực tùy theo nhóm R gắn vào.
Hình 2: Tạo nhánh trên bề mặt silica
Thường chỉ khoảng 50% nhóm –OH mất H+ để tạo ra HCl (tức < 4µmol/m2 bề
mặt bị silan hóa) vì sự kết hợp sẽ dần dần bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng lập thể. Ngoài
nhóm Cl người ta còn sử dụng –OCH3.
Hợp chất cần phân tích khi đi qua pha tĩnh sẽ bị giữ lại bởi những lực lượng tương
tác khác nhau tùy thuộc tính chất, đặc điểm của chất tan và pha tĩnh.
Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cực hoặc ít
phân cực. Đó là các ankyl dây dài như C8 (n-octyl), C18 (n-octadecyl) còn gọi là
ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài ra còn có
cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhóm alkyl.
Người ta nhận thấy các alkyl dây dài cho kết quả tách ổn định hơn các loại khác
nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất.
Hình 3: Cấu trúc của cột ODS
Tuy nhiên do hiệu ứng lập thể nên trong cấu trúc của pha tĩnh còn nhóm –OH chưa
phản ứng, gây ảnh hưởng xấu đến quá trình tách sắc ký tùy môi trường pH phân
tích.
Trong môi trường quá acid (pH < 2) thì có sự phân ly các nhóm ether (-O-Si-C18)
ra khỏi nền. Lúc này cột sẽ mất hoạt tính dẫn đến chất cần phân tích không còn
tương tác tốt với pha tĩnh nữa.
Trong môi trường baz (pH > 7), chính nền silic mang pha tĩnh có thể bị hòa tan
(SiO2 thành silicat), hệ quả là N giảm và số nhánh ghép cũng giảm, mũi rộng ra và
thời gian lưu cũng có thể giảm. Kết quả phân tích như vậy sẽ mất đi độ chính xác.
Một trong những cách khắc phục hiện tượng này là dùng các chất như
trimethylchlorosilan ClSi(CH3)3 hoặc hexamethyldisilazan (ít sử dụng hơn) để
tương tác với nhóm –OH này (gọi là hiện tượng end-capping). Lúc này ta sẽ có loại
cột ít tương tác với chất phân tích có tính baz (cột LC-DB của hãng SUPELCO).
Hình 4. Cấu trúc cột LC-DB
Có một cách khác để loại trừ bớt ảnh hưởng của nhóm –OH mà không cần tương

lại kết quả tách mũi theo yêu cầu thì chúng ta phải thay đổi bản chất pha động (sử
dụng dung môi khác), tức thay đổi α. Đôi khi có thể phải thay đổi cả pha tĩnh.
Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích và pha
động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid (cho proton) hoặc tính
baz (nhận proton) của dung môi.
Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặc dung dịch
đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trong nước. Nước là
một dung môi rất phân cực nên nó không tương tác với những nhóm alkyl không
phân cực trong pha tĩnh, do đó nó được coi như pha động yếu nhất và có tốc độ rửa
giải chậm nhất trong tất cả các dung môi động của SKPĐ.
Hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ thường làm gia tăng độ nhớt dẫn đến việc tăng
áp suất cột.
Hình 6: Độ nhớt của hỗn hợp nước và dung môi hữu cơ ở 25
o
C
Việc lựa chọn dung môi và thành phần dung môi trong pha động được tối ưu hóa
cho những hợp chất cần phân tích. Thông thường, người ta sử dụng hỗn hợp dung
môi MeOH/nước trước, rồi ACN/nước hay THF/nước. Với một hỗn hợp chất phân
tích phức tạp thì sẽ có sự trộn lẫn của các dung môi hữu cơ với nước. Khi lựa chọn
thì phải chọn các hỗn hợp MeOH, ACN và THF với nước có độ rửa giải tương
đồng.
Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế độ
isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chương trình
gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn.
5. Một số đại lượng cơ bản trong phân tích sắc ký
5.1. Hệ số phân bố
Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình
như sau:
Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng số phân
bố (partition coefficient) và được tính như sau:

và hiệu quả tách. Nó được xác định qua phương trình sau:
Hay
Với N được xác định từ phương trình (2.5) hoặc (2.6).
Nguồn: Phòng Phân tích Sắc Ký (CASE)