BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ THÚY DIỆU
MSV: 1101077
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2016
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
TRẦN THỊ THÚY DIỆU
XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Th.S Trần Thị Lan Hương
2. Th.S Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược- ĐH Dược HN
Trung tâm đánh giá TĐSH - VKN thuốc TW
dẫn em thực hiện khóa luận này.
ẠO
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Bộ môn Hóa Dược - Trường Đại học Dược
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
Hà Nội, Trung tâm Tương đương sinh học - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương,
G
thầy cô và các anh, các chị đã tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong suốt thời
H
Ư
N
gian thực hiện khóa luận.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô, các cán bộ Trường Đại học Dược
TR
ẦN
Hà Nội, những người đã trang bị cho em rất nhiều kiến thức trong suốt quá trình
Í-
H
Ó
A
Em xin chân thành cảm ơn!
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
.Q
Phó Viện trưởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương đã tận tình chỉ bảo, hướng
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
Ơ
1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường .......................................................................3
N
G
1.1.5. Một số phương pháp định lượng PAN trong dịch sinh học ..............................4
H
Ư
1.2. Tổng quan về HPLC và thẩm định phương pháp định lượng thuốc
TR
ẦN
trong dịch sinh học ......................................................................................................5
1.2.1. Tổng quan về HPLC..........................................................................................5
B
1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học .......................9
10
00
CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................11
.Q
1.1.1. Công thức hóa học ............................................................................................2
D
IỄ
N
Đ
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ........................................................27
3.3. Bàn luận .............................................................................................................40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................41
4.1. Kết luận ..............................................................................................................41
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
: Mẫu kiểm tra nồng độ thấp (Lower Quality Control Samples)
MQC
: Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples)
HQC
: Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples)
MeCN
: Acetonitril
MeOH
: Methanol
SKĐ
: Sắc ký đồ
Cmax
: Nồng độ đỉnh
T1/2
: Thời gian bán thải
Ó
A
10
00
B
TR
ẦN
H
Ư
N
G
Đ
ẠO
TP
.Q
U
Y
Ơ
N
Nội dung
Một số chế phẩm pantoprazol trên thị trường
1.2
Một số nghiên cứu định lượng pantoprazol trong dịch sinh học
2.1
Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
2.2
Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
2.3
Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu
2.4
Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
2.5
32
3.6
Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn
33
3.7
Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi pantoprazol
34
3.8
Độ ổn định dung dịch nội chuẩn trong thời gian ngắn
35
3.9
Độ ổn định dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày
3.10
Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã
3.11
G
N
H
Ư
TR
ẦN
B
10
00
A
Ó
H
Í-
-L
11
11
12
12
14
14
ÁN
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
Bảng
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
Nội dung
Trang
Ơ
Hình
N
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
22
23
23
24
SKĐ của PAN và IS trong pha động MeCN: đệm phosphat pH 7,3
(36:64) với tốc độ dòng 1,5 mL
3.9
Quy trình xử lý mẫu
24
10
00
B
3.8
25
A
SKĐ mẫu chuẩn PAN (4000 ng/ml) và IS với quy trình xử lý mẫu
được chọn
26
D
IỄ
N
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
27
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
U
Y
.Q
TP
ẠO
Đ
G
N
ĐẶT VẤN ĐỀ
Loét dạ dày - tá tràng là bệnh khá phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Hiện
H
Ơ
N
nay, đây đang là bệnh đứng đầu về tỉ lệ mắc trong số các bệnh về đường tiêu hóa.
Trên thế giới, ước tính khoảng 10% dân số mắc bệnh ở mọi lứa tuổi, không phân
U
Y
N
biệt giới tính, tỉ lệ mắc bệnh ở người lớn cao hơn trẻ em và hàng năm tăng khoảng
0,2% [18]. Có nhiều nhóm thuốc điều trị loét dạ dày - tá tràng như nhóm thuốc
ẠO
TP
nhóm thuốc ức chế bơm proton tác dụng nhanh, hiệu quả, tỷ lệ làm lành vết loét có
thể đạt tới 95% sau tám tuần điều trị. Thuốc ít ảnh hưởng đến khối lượng dịch vị, sự
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
Đ
ÀN
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10
00
lựa chọn được các thuốc an toàn, hiệu quả, kinh tế. Tuy vậy, hiện nay ở nước ta vẫn
chưa có một quy trình chuẩn, phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm để định
lượng pantoprazol trong huyết tương.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế và với mong muốn xây dựng phương pháp xác
định nồng độ pantoprazol trong huyết tương nhằm phục vụ cho công tác điều trị và
đánh giá tương đương sinh học các chế phẩm chứa hoạt chất pantoprazol chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài : “Xây dựng phương pháp định lượng Pantoprazol
trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” với 2 nội dung
N
H
Ơ
N
1.1.1. Công thức hóa học
- Pantoprazol (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S
- Khối lượng phân tử : 383,37
- Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – 2 – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl)
methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12].
-L
Í-
H
Ó
A
10
00
B
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
TR
ẦN
H
Ư
N
G
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
ẠO
TP
.Q
U
Y
- Công thức cấu tạo :
ng/mL đạt được sau khoảng 2 – 2,5 giờ khi dùng PAN liều 40mg chia liều hoặc
ẠO
xơ gan là 3 - 6 giờ.Vì vậy, cần xem xét hiệu chỉnh liều cho bệnh nhân suy gan
[1,2,14,20].
Đ
G
N
H
Ư
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
* Chỉ định
- Loét dạ dày - tá tràng.
- Bệnh trào ngược dạ dày - thực quản.
TR
ẦN
- Hội chứng tăng tiết acid (hội chứng Zollinger Ellison).
- Dự phòng loét dạ dày - tá tràng do dùng thuốc chống viêm không steroid, do
stress [1,2,20].
-L
Í-
Đ
ÀN
TO
ÁN
STT
Bảng 1.1: Một số chế phẩm PAN trên thị trường
2
Bột đông khô pha
tiêm
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
Tên biệt dược
H/lượng
Nhà sản xuất
Bio-panto
40mg
Biodeal Laboratories
Pantoloc
40mg
Nycomed
Pantosec
40mg
Cipla
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
U
Y
N
H
- Chuyển hoá: PAN được chuyển hoá chủ yếu ở gan nhờ enzym CYP2C19
của cytochrom P450 để thành demethylpantoprazol.
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
Ơ
N
3
TP
.Q
sinh học có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như HPLC, điện di mao
quản, phóng xạ miễn dịch. Tuy nhiên, phương pháp định lượng bằng HPLC vẫn
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
ẠO
được nhiều nghiên cứu sử dụng nhất do có nhiều ưu điểm. Một số phương pháp
định lượng PAN trong huyết tương bằng HPLC được trình bày ở bảng 1.2.
Tủa
1 Huyết
[17] tương
chó
1,5 ml/phút
Omeprazol
A
H
-L
TO
ÀN
Đ
Huyết
3
tương
[10]
người
50:50 (v:v)
Tủa
protein
bằng
methanol
(MeOH)
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
Detector
Í-
Huyết
tương
người
ÁN
2
[6]
IỄ
N
D
Xử lý mẫu
Điều kiện sắc ký
TR
ẦN
Mẫu
B
PP
H
www.daykemquynhon.blogspot.com
5
Nhận xét:
N
Phương pháp 1, 2 và 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung
môi MeCN, MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa
N
H
Ơ
sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ, không thuận
lợi cho quá trình phân tích mẫu.
TP
chuẩn là chưa thực sự hợp lý.
Dựa trên sự tham khảo các tài liệu đã được công bố và dựa vào tính chất lý
H
Ư
N
G
10
00
B
LƯỢNG THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC
1.2.1. Tổng quan về HPLC
1.2.1.1. Khái niệm chung
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng ở áp suất cao. Quá trình sắc ký xảy ra theo cơ chếphân bố [4,5].
* Pha tĩnh:
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết định sự tách
của hỗn hợp các chất.
Loại pha tĩnh phổ biến được chế tạo trên nền Silica. Nhóm OH trên bề mặt hạt
D
IỄ
N
Đ
ÀN
TO
silica phản ứng với dẫn chất clorosilan tạo ra dẫn chất siloxan:
Pha động là dung môi rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký. Yêu cầu của
pha động:
N
H
Ơ
- Trơ với pha tĩnh và bền vững theo thời gian.
- Hòa tan chất cần phân tích.
TP
- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường [5,16].
* Phân loại sắc ký: dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà chia làm
TR
ẦN
H
Ư
N
G
Đ
H
Ó
A
10
00
B
1.2.1.2. Cấu tạo máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản, bao gồm các bộ phận chính sau:
* Hệ thống cấp dung môi:
Hệ thống cấp dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ.
Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan.
* Bơm:
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định,
phù hợp với quá trình sắc ký.
* Bộ phận tiêm mẫu:
Để đưa mẫu phân tích vào cột, có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng
hệ thống tiêm tự động.
* Cột sắc ký:
Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ
với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác
nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký.
* Detector:
N
H
Ơ
1.2.1.3. Một số thông số đặc trưng trong phân tích pic của HPLC
* Thời gian lưu tR
TP
dài. Nếu tR quá nhỏ thì khả năng tách kém [4,5].
ẠO
* Hệ số chọn lọc α
Đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B, người ta dùng hệ số
Đ
=
=
H
Ư
N
α =
10
00
Trong đó: W: chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao của pic
a: khoảng cách từ chân đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép
đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic [4,5].
* Số đĩa lý thuyết và hiệu lực cột N
Hiệu lực cột được đo bằng thông số số đĩa lý thuyết N của cột:
D
IỄ
N
Đ
ÀN
TO
Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [4,5].
* Hệ số bất đối AF
Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
.Q
Yêu cầu: RS > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [4,5].
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
ẠO
1.2.1.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
TR
ẦN
H
Ư
N
G
độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic. Có 4 phương pháp
thường được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn
nội, phương pháp thêm chuẩn và phương pháp chuẩn hóa diện tích.
Do đặc điểm của nền mẫu huyết tương có chứa nhiều thành phần khác nhau
nên các phương pháp định lượng hoạt chất trong huyết tương thường có giai đoạn
D
và các sai số gây ra do máy móc và kỹ thuật.
Phương pháp chuẩn nội:
* Nguyên tắc: thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử lượng bằng nhau của một
chất tinh khiết rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Chất được thêm này gọi là
nội chuẩn.
* Yêu cầu với chất nội chuẩn:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất nội chuẩn phải được tách hoàn toàn và có
thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử.
- Có cấu trúc hóa học tương tự chất thử.
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử.
- Không phản ứng với bất kỳ thành phần nào của mẫu thử.
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm.
* Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm:
Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa lượng chất chuẩn khác nhau nhưng cùng
chứa một lượng nội chuẩn. Tiến hành sắc ký và ghi lại đáp ứng pic, từ đó vẽ đường
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
.Q
U
Y
t(R)A; t(R)B
: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
WA; WB
W1/2A; W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
thử cũng được thêm chuẩn với lượng như trên. Tính tỷ số diện tích ( chiều cao ) pic
N
H
Ơ
của chất thử trên diện tích ( chiều cao ) pic của chất nội chuẩn rồi dựa vào đường
chuẩn tìm nồng độ của chất thử [4,5].
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
ẠO
của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích
thực tế.
G
1.2.2.2. Một số phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong
ÁN
-L
Í-
dung môi (MeOH, MeCN).
- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan
trong một dung môi sang dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất.
D
IỄ
N
Đ
ÀN
TO
1.2.2.3. Nội dung thẩm định
* Tính chọn lọc – đặc hiệu
Độ chọn lọc hay tính đặc hiệu thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể
xác định (định tính - định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các
thành phần khác có trong mẫu thử như các chất nội sinh, chuyển hóa, sản phẩm
phân hủy hay các thuốc uống cùng [7,8,13,15].
* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều
cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
TP
Ơ
Mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn (1/30-1/10 Cmax) thường
TP
.Q
Độ đúng: giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị thực của
mẫu đã biết [7,8,13,15].
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
ẠO
* Độ chính xác
Độ chính xác: là độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình phân
N
G
Đ
tích nhiều lần trên cùng một mẫu thử đồng nhất, được biểu thị bằng giá trị CV
(%)[7,8,13,15].
H
Ư
Đánh giá độ ổn định gồm:
- Độ ổn định của dung dịch nội chuẩn gốc và dung dịch gốc: Độ ổn định thời
gian ngắn ở nhiệt độ phòng, độ ổn định thời gian dài.
TO
ÁN
- Độ ổn định của dung dịch làm việc: Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ
phòng, độ ổn định thời gian dài.
ÀN
- Độ ổn định của mẫu dịch huyết tương: sau 3 chu kỳ đông - rã, ở nhiệt
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
U
Y
N
H
được chấp nhận là LLOQ [7,8,13,15].
* Độ đúng
D
VKNT TP HCM
QT219011212
Pantoprazol natri
VKNTTW
0114306.01
Lansoprazol
VKNTTW
.Q
Hàm lượng
Đ
G
93,87%
H
Ư
N
93,72%
P.A
Merck, Đức
10
00
B
Độ tinh khiết
-L
Bảng 2.2: Các hóa chất dùng trong nghiên cứu
Acetonitril
Í-
H
A
Methanol
D
IỄ
N
Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
U
Y
N
H
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
12
Bảo quản
01
13PN00493
Viện huyết học – truyền máu TW
06
13PN00228
Viện huyết học – truyền máu TW
07
15P006178
Viện huyết học – truyền máu TW
N
-35oC ± 5oC
G
N
TR
ẦN
H
Ư
-35oC ± 5oC
Sartorius Sigma 2 – 16K, Đức
Sanyo MDF – 236, Nhật
Haier, Trung Quốc
Thiết bị lọc nước
TKA, Đức
Máy lắc xoáy
Velp, Ý
Máy lắc cơ học
GFL, Đức
Micropipet
Eppendorf, Đức
Đầu típ cho micropipet
Isolab, Đức
Ống chiết thủy tinh 15 mL
SUPELCO, Đức
Bình định mức, pipet class A
-35oC ± 5oC
2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4.
Thiết bị
N
Nơi cung cấp
Ơ
Lô
H
Mẫu
Đ
www.daykemquynhon.ucoz.com
MailBox : [email protected]
Bảng 2.3: Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
- Thẩm định phương pháp về các chỉ tiêu: Tính chọn lọc - đặc hiệu, đường
chuẩn và khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, hiệu
Đ
suất chiết, độ ổn định.
10
00
B
TR
ẦN
H
Ư
N
G
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Chuẩn bị các mẫu huyết tương tự tạo
2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc
- Dung dịch chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn PAN trong methanol (MeOH) để
thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ PAN chính xác khoảng 1000 µg/mL.
- Dung dịch nội chuẩn gốc: hòa tan chất chuẩn lansoprazol trong MeOH để thu
được dung dịch nội chuẩn gốc có nồng độ khoảng 1 mg/mL.
Đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết
tương trắng có pha nội chuẩn (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn PAN và
IS. Tiến hành pha loãng CC1 VÀ CC2 với huyết tương trắng để thu được các mẫu
chuẩn có nồng độ từ 30 – 4000 ng/mL như ở bảng 2.5.
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
U
Y
N
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
14
Nồng độ (ng/mL)
970
-
30
S2
100
900
-
S3
500
500
-
S4
1000
0
-
-
1000
-
Đ
-
G
Ơ
H
N
U
Y
.Q
TP
ẠO
1000
500
N
H
HQC
Nồng độ (ng/mL)
90
1800
3500
VHT trắng (µL)
910
550
125
VQC1 (µL)
-
450
875
VQC2 (µL)
90
MailBox : [email protected]
Bảng 2.5: Chuẩn bị đường chuẩn
2.3.2. Xây dựng phương pháp phân tích
2.3.2.1. Xác định điều kiện sắc ký
Khảo sát phương pháp phân tích trên hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu detector UV-VIS, với các điều kiện sắc ký khác nhau như:
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
15
- Lựa chọn bước sóng phát hiện
N
- Lựa chọn cột sắc ký
- Lựa chọn pha động
N
chiết tách PAN từ huyết tương trên các mẫu chuẩn PAN hòa tan trong huyết tương
trắng bằng các phương pháp như:
- Tủa protein với các tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ như: MeOH,
MeCN, acid perclorid
- Chiết lỏng - lỏng với các dung môi khác nhau: chloroform, tert butyl methyl
ether.
Í-
H
Ó
A
10
00
B
2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích
2.3.3.1. Tính đặc hiệu - chọn lọc
Tiến hành phân tích sắc ký các mẫu: Huyết tương trắng với 6 mẫu có nguồn
gốc khác nhau và huyết tương trắng có pha chuẩn PAN ở nồng độ 30 ng/mL và IS.
So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
ÁN
-L
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu phải
gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng [7,8,13,15].
2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính
Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung
dịch có nồng độ như sau: 30 - 100 - 500 - 1000 - 2000 - 2500 - 3000 - 4000 ng/mL.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
16
Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Từ đáp ứng pic của
N
các chất tại các nồng độ, xác định tương quan giữa đáp ứng pic với nồng độ đã pha.
Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Từ phương trình
N
H
Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL. Dựa theo
TR
ẦN
đường chuẩn pha trong huyết tương trắng tiến hành trong cùng điều kiện, tính lại
nồng độ của các mẫu vừa khảo sát.
Nồng độ chuẩn thấp nhất được chấp nhận là LLOQ nếu thoả mãn điều kiện
B
sau:
10
00
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic trung
bình của mẫu LLOQ phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic trung bình của mẫu trắng.
Ó
A
- Độ đúng của từng mẫu phải đạt từ 80% - 120% so với nồng độ thực.
Í-
H
- Độ chính xác CV ≤ 20% [7,8,13,15].
.Q
U
Y
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm
2.3.3.5. Độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày( độ chính xác)
Chuẩn bị các lô mẫu QC tương tự như ở mục xác định độ đúng. Xác định kết
quả định lượng các mẫu QC theo đường chuẩn tiến hành trong cùng điều kiện.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
17
Xác định độ lặp lại trong ngày bằng cách tính toán độ lệch CV giữa giá trị các
N
lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng một ngày.
Đ
Tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của
PAN và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học (có qua chiết tách) với đáp
TR
ẦN
H
Ư
ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách).
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ khác nhau không được quá 15%.
10
00
B
- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC có
qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%.
Ó
2.3.3.7. Độ ổn định
A
Diễn đàn hỗ trợ giáo dục : Đ/C 1000B Trần Hưng Đạo Tp Quy Nhơn
Người sáng lập : Nguyễn Thanh Tuấn - Chủ quản tài nguyên : Nguyễn Thanh Tú
U
Y
độ phân tích được của mỗi lô mẫu có giá trị CV ≤ 15% [7,8,13,15].
Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC trong một
thời gian nhất định (khoảng 6 ngày). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch
chuẩn PAN gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC những khoảng thời gian
nhất định (khoảng 6 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.
Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha
không quá 2%.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
www.twitter.com/daykemquynhon
https://plus.google.com/+DạyKèmQuyNhơn
www.facebook.com/daykem.quynhon
www.daykemquynhon.blogspot.com
18
Phân tích mẫu huyết tương ở 2 nồng độ LQC và HQC sau khi đã rã đông và để
TO
ÁN
-L
Í-
H
Ó
A
10
00
B
TR
ẦN
H
Ư
ở nhiệt độ phòng một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ), so sánh với nồng độ mẫu
được xử lý ngay sau khi rã đông.
Nồng độ PAN trong mẫu được xử lý sau khi bảo quản một thời gian nhất định
IỄ
N
Đ
ÀN
So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong autosampler sau một thời gian xác định (khoảng 25 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay
sau xử lý.
Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai
khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả
định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.
Đóng góp PDF bởi GV. Nguyễn Thanh Tú
www.facebook.com/daykemquynhonofficial
www.facebook.com/boiduonghoahocquynhonofficial
Copyright: Tài liệu đại học ©