BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÚY DIỆU
MSV: 1101077

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ THÚY DIỆU

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG
PANTOPRAZOL TRONG HUYẾT TƯƠNG
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. Th.S Trần Thị Lan Hương
2. Th.S Tạ Mạnh Hùng
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa dược- ĐH Dược HN
Trung tâm đánh giá TĐSH - VKN thuốc TW


1.1.2. Tính chất hóa lý .................................................................................................2
1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của PAN ........................................2
1.1.4. Một số chế phẩm trên thị trường .......................................................................3
1.1.5. Một số phương pháp định lượng PAN trong dịch sinh học ..............................4
1.2. Tổng quan về HPLC và thẩm định phương pháp định lượng thuốc
trong dịch sinh học ......................................................................................................5
1.2.1. Tổng quan về HPLC..........................................................................................5
1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học .......................9
CHƯƠNG 2: ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ..........................................................................................................11
2.1. Điều kiện thực nghiệm .......................................................................................11
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................13
2.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................13
2.4. Phương pháp xử lí kết quả .................................................................................19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ NHẬN XÉT ...............................................................20
3.1. Kết quả xây dựng phương pháp định lượng.......................................................20
3.2. Kết quả thẩm định phương pháp phân tích ........................................................27
3.3. Bàn luận .............................................................................................................40
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................41
4.1. Kết luận ..............................................................................................................41
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

PAN

: Pantoprazol


: Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (Middle Quality Control Samples)

HQC

: Mẫu kiểm tra nồng độ cao (High Quality Control Samples)

MeCN

: Acetonitril

MeOH

: Methanol

SKĐ

: Sắc ký đồ

Cmax

: Nồng độ đỉnh

T1/2

: Thời gian bán thải

UV–VIS : Tử ngoại – khả kiến (Ultra violet – Visble)
US–FDA : Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ
(United States of American Food and Drug Administration)
EMA


Các hóa chất dùng trong nghiên cứu

11

2.3

Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu

12

2.4

Các thiết bị dùng trong nghiên cứu

12

2.5

Chuẩn bị đường chuẩn

14

2.6

Chuẩn bị mẫu kiểm tra

14

3.1


Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi nội chuẩn

33

3.7

Kết quả thẩm định tỷ lệ thu hồi pantoprazol

34

3.8

Độ ổn định dung dịch nội chuẩn trong thời gian ngắn

35

3.9

Độ ổn định dung dịch chuẩn pantoprazol gốc dài ngày

35

3.10

Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã

36

3.11


Trang

3.1

Phổ hấp thụ UV-VIS của PAN

20

3.2

SKĐ PAN và omeprazol

21

3.3

SKĐ PAN và rabeprazol

21

3.4

SKĐ PAN và lansoprazol

22

3.5

SKĐ của PAN và IS với tỷ lệ pha động 30:70

3.10

được chọn

26

3.11

SKĐ mẫu huyết tương trắng

27

3.12

SKĐ mẫu huyết tương trắng có chứa nội chuẩn

27

3.13

SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa PAN

27

3.14

SKĐ mẫu huyết tương trắng chứa IS và PAN nồng độ 30 ng/ml.

27


phương pháp HPLC.
2. Thẩm định phương pháp đã xây dựng, đề ra quy trình phân tích thường quy
để định lượng pantoprazol trong huyết tương theo tiêu chuẩn US-FDA và
EMA.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ PANTOPRAZOL
1.1.1. Công thức hóa học
- Pantoprazol (PAN) có công thức phân tử : C16H14F2N3O4S
- Khối lượng phân tử : 383,37
- Công thức cấu tạo :

- Tên khoa học : 5- (Diflomethoxy) – 2 – [( 3, 4- dimethoxypyridin – 2- yl)
methanesulfinyl] – 1H- 1,3 – benzodiazole [9,11,12].
1.1.2. Tính chất hóa lý
- Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng.
- Khó tan trong nước, log P = 2,18.
- Rất dễ bị phân hủy trong môi trường acid, thường thấy ở dạng muối natri
ngậm 1,5 phân tử nước.
- Hấp thu UV do có liên kết đôi liên hợp [3,12,14].
1.1.3. Cơ chế tác dụng, dược động học, chỉ định của pantoprazol
* Cơ chế tác dụng:
Sau khi được hấp thu, PAN tích lũy trong ống tiết acid của tế bào thành dạ dày.
Ở đây, nó gắn kết với nhóm sulfhydryl của hệ enzyme H+/ K+ - ATPase trên bề
mặt tiết gastrin của tế bào vách, gây ra sự ức chế tiết acid cơ bản và tiết acid do kích
thích. PAN có thể ức chế sự tiết acid dạ dày mà không kể đến bản chất của kích
thích (acetylcholin, histamin, gastrin…) [1,2,20].

STT

1

2

Dạng bào chế

Viên nén bao tan
trong ruột

Bột đông khô pha
tiêm

Tên biệt dược

H/lượng

Nhà sản xuất

Bio-panto

40mg

Biodeal Laboratories

Hasanloc

40mg


Nycomed

Pantosec

40mg

Cipla


4

PMS-Pantoprazol

40mg

Pharmascience Inc

3

Viên nén GPKD

Proton-P

40 mg

Aristopharma

4

Viên nén


Xử lý mẫu
Tủa
protein

IS

Omeprazol

bằng
acetonitril
Tủa
protein
bằng
acetonitrilmethanol=

Rofecoxib

Cột

Huyết
3
tương
[10]
người

Omeprazol

Detector


,6mm)

Acetonitril:
đệm phosphat
UV,
pH 6,8 =
λ 288nm
32:68 (v/v)
Tốc độ dòng:
1,5 ml/phút

50:50 (v:v)
Tủa
protein
bằng
methanol
(MeOH)

Pha động


5

Nhận xét:
Phương pháp 1, 2 và 3: Xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein trong dung
môi MeCN, MeOH đơn giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, nền mẫu phức tạp, mẫu chưa
sạch, pic của chuẩn không tách được hoàn toàn pic tạp trên sắc ký đồ, không thuận
lợi cho quá trình phân tích mẫu.
Ngoài ra, với phương pháp 2 dùng nội chuẩn là rofecoxib, là một thuốc
NSAID cấu trúc không có nhiều điểm tương đồng với pantoprazol nên dùng làm nội

- Hòa tan chất cần phân tích.
- Có độ tinh khiết cao.
- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký.
- Có tính kinh tế và đảm bảo môi trường [5,16].
* Phân loại sắc ký: dựa theo độ phân cực của pha động và pha tĩnh mà chia làm
2 loại:
- Sắc ký pha thuận: Pha tĩnh phân cực, pha động là dung môi ít phân cực hơn.
Trong sắc ký pha thuận thì chất ít phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ
phân cực của pha động, thời gian lưu giảm dần.
- Sắc ký pha đảo: Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực hơn. Trong sắc
ký pha đảo thì các chất phân cực nhất được rửa giải đầu tiên. Khi tăng độ phân cực
của pha động thì thời gian lưu tăng dần [4,5].
1.2.1.2. Cấu tạo máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản, bao gồm các bộ phận chính sau:
* Hệ thống cấp dung môi:
Hệ thống cấp dung môi thường bằng thủy tinh, đôi khi bằng thép không gỉ.
Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ 0,45 µm)
và đuổi khí hòa tan.
* Bơm:
Để bơm pha động vào cột sắc ký, bơm này phải điều chỉnh được áp suất
(thường 0– 400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn định,
phù hợp với quá trình sắc ký.
* Bộ phận tiêm mẫu:
Để đưa mẫu phân tích vào cột, có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm mẫu bằng
hệ thống tiêm tự động.
* Cột sắc ký:
Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ
với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Cột sắc ký có nhiều cỡ khác
nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trính sắc ký.
* Detector:

Trong đó: W1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh pic.
W là chiều rộng của pic đo ở đáy pic [4,5].
* Hệ số bất đối AF
Để đánh giá tính bất đối xứng của pic người ta dùng hệ số bất đối:
AF =
Trong đó: b là nửa chiều rộng sau pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao pic
a là nửa chiều rộng trước pic đo ở chiều cao bằng 1/10 chiều cao
pic[4,5]


8

* Độ phân giải Rs
Là đại lượng đo mức độ tách của hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B)
Rs =
Trong đó:
t(R)A; t(R)B

hoặc

: thời gian lưu của 2 pic liền kề nhau (A và B).

WA; WB
: độ rộng pic đo ở các đáy pic.
W1/2A; W1/2B: độ rộng pic đo ở nửa chiều cao pic.
Yêu cầu: RS > 1; giá trị tối ưu Rs = 1,5 [4,5].
1.2.1.4. Một số phương pháp định lượng bằng HPLC
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic. Có 4 phương pháp
thường được sử dụng trong sắc ký: phương pháp chuẩn ngoại, phương pháp chuẩn

1.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học
1.2.2.1. Khái niệm
Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá
trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng
của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu khi ứng dụng phân tích
thực tế.
1.2.2.2. Một số phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong
dịch sinh học
Do dịch sinh học chứa nhiều thành phần khác nhau nên khác với định lượng
các dạng bào chế hay định lượng nguyên liệu, định lượng dược chất trong dịch sinh
học thì khâu xử lý mẫu đóng vai trò rất quan trọng, nó có tính quyết định đến kết
quả phân tích. Hiện nay thường áp dụng 3 phương pháp chính để xử lí mẫu huyết
tương là :
- Phương pháp chiết pha rắn: là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng chất
rắn, sau đó rửa giải bằng dung môi thích hợp.
- Phương pháp kết tủa protein: là quá trình loại protein trong mẫu bằng tác
nhân gây tủa protein như acid mạnh (percloric, tricloracetic, trifluoracetic) hoặc
dung môi (MeOH, MeCN).
- Phương pháp chiết lỏng - lỏng: là kỹ thuật chuyển chất phân tích hòa tan
trong một dung môi sang dung môi thứ hai không hòa tan trong dung môi thứ nhất.
1.2.2.3. Nội dung thẩm định
* Tính chọn lọc – đặc hiệu
Độ chọn lọc hay tính đặc hiệu thể hiện khả năng phương pháp phân tích có thể
xác định (định tính - định lượng) chất cần phân tích, không bị nhầm lẫn bởi các
thành phần khác có trong mẫu thử như các chất nội sinh, chuyển hóa, sản phẩm
phân hủy hay các thuốc uống cùng [7,8,13,15].
* Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của pic (diện tích hay chiều
cao) và nồng độ thuốc trong dịch sinh học. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ




11

CHƯƠNG 2 : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM
2.1.1. Nguyên liệu, hóa chất, dung môi
Các hóa chất, dung môi, mẫu huyết tương trắng dùng trong nghiên cứu được
trình bày ở bảng 2.1, bảng 2.2, bảng 2.3.
Bảng 2.1: Các chất chuẩn dùng trong nghiên cứu
Tên

Nơi sản xuất

Số kiểm soát

Hàm lượng

Pantoprazol

VKNT TP HCM

QT219011212

93,87%

Pantoprazol natri

VKNTTW

Merck, Đức

Dikali hydrophosphat

P.A

Merck, Đức

Tertbutyl methyl ether

P.A

Merck, Đức

Triethyelamin

P.A

Merck, Đức


12

Bảng 2.3: Các mẫu huyết tương trắng trong nghiên cứu
Mẫu

Lô

Nơi cung cấp


Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

05

13PN00083

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

06

13PN00228

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

07

15P006178

Viện huyết học – truyền máu TW

-35oC ± 5oC

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị
Các máy móc, thiết bị dùng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.4.


Máy lắc cơ học

GFL, Đức

Micropipet

Eppendorf, Đức

Đầu típ cho micropipet

Isolab, Đức

Ống chiết thủy tinh 15 mL

SUPELCO, Đức

Bình định mức, pipet class A

Prolabo, Pháp


13

Hệ thống máy sắc ký lỏng HPLC - Shimadzu gồm: Interface CBM - 2A; bơm
cao áp LC - 20AT; bộ phận tiêm mẫu tự động SIL - 20AC; Detector DAD SPD M20A; buồng ổn nhiệt cột CTO - 20A; phần mềm điều khiển và xử lý kết quả LC
Solution Shimadzu.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xây dựng phương pháp định lượng pantoprazol trong huyết tương bằng
HPLC: lựa chọn phương pháp xử lí mẫu, điều kiện sắc ký, lựa chọn nội chuẩn cho

VHTtrắng (L)

VCC1 (L)

VCC2 (L)

Blank

-

1000

-

-

Zero

-

1000

-

-

S1

30


0

-

1000

S5

2000

500

500

-

S6

2500

375

625

-

S7

3000


HQC

Nồng độ (ng/mL)

90

1800

3500

VHT trắng (µL)

910

550

125

VQC1 (µL)

-

450

875

VQC2 (µL)

90


gốc khác nhau và huyết tương trắng có pha chuẩn PAN ở nồng độ 30 ng/mL và IS.
So sánh các sắc ký đồ thu được từ việc phân tích các mẫu trên.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Pic của chất phân tích và IS phải đảm bảo được nhận diện rõ ràng, tách hoàn
toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu ( hệ số bất đối ~ 1; độ phân giải (Rs) giữa pic của
chất phân tích, pic IS với pic gần nhất phải lớn hơn 1,5).
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của chất phân tích, đáp ứng pic của
từng mẫu phải gấp ít nhất 5 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng.
- Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, đáp ứng pic của từng mẫu phải
gấp ít nhất 20 lần đáp ứng pic của mẫu trắng tương ứng [7,8,13,15].
2.3.3.2. Đường chuẩn và khoảng nồng độ tuyến tính
Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc với huyết tương trắng để được các dung
dịch có nồng độ như sau: 30 - 100 - 500 - 1000 - 2000 - 2500 - 3000 - 4000 ng/mL.


16

Tiến hành phân tích các mẫu, mỗi nồng độ phân tích 5 lần. Từ đáp ứng pic của
các chất tại các nồng độ, xác định tương quan giữa đáp ứng pic với nồng độ đã pha.
Xây dựng phương trình hồi quy và xác định hệ số tương quan r. Từ phương trình
hồi quy đã xây dựng, tính lại nồng độ của từng mẫu, xác định độ đúng của mỗi
nồng độ.
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Độ đúng so với giá trị thực của các nồng độ phải từ 85% - 115%, trừ tại điểm
LLOQ được chấp nhận 80% - 120%.
- Có ít nhất 75% số điểm trong dãy chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, trong đó
LLOQ và ULOQ phải đạt tiêu chuẩn.
- Khoảng tuyến tính: có hệ số tương quan r ≥ 0,98 [7,8,13,15].
2.3.3.3. Giới hạn định lượng dưới
Tiến hành khảo sát mẫu chuẩn PAN ở nồng độ khoảng 30 ng/mL. Dựa theo

2.3.3.6. Tỷ lệ thu hồi
Tiến hành sắc ký các lô mẫu QC bao gồm LQC, MQC, HQC trong dịch sinh
học, mỗi lô mẫu gồm ít nhất 6 mẫu độc lập. Song song tiến hành sắc ký các lô mẫu
QC trong pha động (phân tích định lượng trực tiếp không qua giai đoạn chiết tách).
Tỷ lệ thu hồi của nội chuẩn được xác định bằng cách so sánh đáp ứng của
PAN và IS trong các mẫu QC pha trong dịch sinh học (có qua chiết tách) với đáp
ứng của PAN và IS trong các mẫu QC pha trong pha động (không qua chiết tách).
Phương pháp đạt yêu cầu khi thỏa mãn điều kiện sau:
- Tỷ lệ thu hồi tại các nồng độ khác nhau không được quá 15%.
- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC có
qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 15%.
- Giá trị CV giữa các đáp ứng của chất phân tích và IS trong các mẫu QC
không qua chiết tách ở mỗi nồng độ phải ≤ 5% [7,8,13,15].
2.3.3.7. Độ ổn định

 Độ ổn định dung dịch nội chuẩn làm việc thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng
Chuẩn bị dung dịch nội chuẩn làm việc và bảo quản ở nhiệt độ phòng trong
một thời gian nhất định (khoảng 5 giờ). Phân tích, so sánh nồng độ của dung
dịch nội chuẩn sau bảo quản với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.
Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha
không quá 2%.

 Độ ổn định dung dịch chuẩn gốc dài ngày
Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc và bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC trong một
thời gian nhất định (khoảng 6 ngày). Phân tích, so sánh nồng độ của dung dịch
chuẩn PAN gốc sau khi bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 8oC những khoảng thời gian
nhất định (khoảng 6 ngày) với nồng độ của dung dịch mới pha tương ứng.
Nồng độ dung dịch sau bảo quản phải sai khác với nồng độ dung dịch mới pha
không quá 2%.


 Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler)
So sánh nồng độ của mẫu ở nồng độ LQC và HQC bảo quản trong autosampler sau một thời gian xác định (khoảng 25 giờ) và nồng độ của mẫu tiêm ngay
sau xử lý.
Nồng độ mẫu sau khi bảo quản một thời gian xác định trong auto-sampler sai
khác với nồng độ mẫu tiêm ngay không quá 15% và giá trị CV giữa các kết quả
định lượng ở mỗi nồng độ phải nhỏ hơn hoặc bằng 15%.