ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

PHƢƠNG

VŨ ANH

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƢƠNG NGƢỜI
BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. TS. HÀ TRẦN HƢNG

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và
TS. Hà Trần Hƣng đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân

1.1.4.2. Phân bố.................................................................................................6
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ.............................................................................7
1.1.5. Tiên lƣợng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tƣơng. .......7
1.2. Các phƣơng pháp xác định paraquat trong huyết tƣơng...................................9
1.2.1. Phƣơng pháp quang phổ .............................................................................9
1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ ............................................................10
1.2.3. Phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ ..........................................................11
1.2.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................13
1.3. Các phƣơng pháp xử lý mẫu huyết tƣơng phân tích Paraquat........................15
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................19
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................19 2.2.
Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị..........................................................................19
2.2.1 Chất chuẩn .................................................................................................19
2.2.2 Hoá chất.....................................................................................................19
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ.......................................................................................20
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................21
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lƣợng paraquat. .............................21
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn...........................................................................21
2.3.1.2. Phƣơng pháp tách PQ từ huyết tƣơng................................................21

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


2.3.1.3. Phƣơng pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lƣợng PQ trong huyết
tƣơng ...............................................................................................................21
2.3.2 Đánh giá phƣơng pháp phân tích PQ trong huyết tƣơng...........................22
2.3.2.1. Tính chọn lọc .....................................................................................22
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính................................................................23

3.1.8.2. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng ........................................42
3.1.8.3. Đánh giá phƣơng trình đƣờng chuẩn ................................................43
3.2. Khảo sát phƣơng pháp xử lý mẫu ...................................................................46
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch TCA ............................................................46 3.2.2.
Khảo sát thời gian lắc xoáy ......................................................................48 3.2.3 Khảo
sát độ ổn định mẫu phân tích ...........................................................50
3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phƣơng pháp ....................................................51
3.3.1. Đánh giá đô ̣ chon loc ̣................................................................................51
3.3.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp.........................................................51
3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của phƣơng pháp ...............................................51
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp phân tích ..................................52
3.3.2. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại...............................................................53
3.3.2.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị ..........................................................53
3.3.2.2. Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phƣơng
pháp phân tích ................................................................................................55
3.3.3 Độ ổn định .................................................................................................57
Độ ổn định trong thời gian phân tích ..............................................................58
3.4. Phân tích mẫu PQ trong huyết tƣơng bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lƣợng
bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ..........................................58 3.4.1.
Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: ...................................................58 3.4.2.
Nồng độ Paraquat huyết tƣơng trong tiên lƣợng bệnh nhân và đánh giá
hiệu quả lọc máu hấp phụ ........................................................................60
KẾT LUẬN ...............................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................68

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên




Trường ĐHKH Tự nhiên


Bảng 3.22: Kết quả xác điṇ h đô ̣ ổn điṇ h trong ngày.................................................58
Bảng 3.23: Thời gian tƣƣ lúc uống đến khi lấy mẫu xét nghiệm................................60
Bảng 3.24: Kết quả định lƣợng PQ trên 31 bệnh nhân .............................................61
Bảng 3.25: Thay đổi nồng độ Paraquat huyết tƣơng sau lọc máu hấp phụ ..............65

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH SÁCH HÌNH

Chƣơng 1.
Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat .................................................................3
Hình 1.2. Cơ chế gây độc của paraquat [15] ...............................................................4
Hình 1.3: Biểu đồ liên quan giữa nồng độ Paraquat huyết tƣơng (µg/ml), thời gian sau
uống, và khả năng sống.........................................................................................8
Chƣơng 3.
Hình 3.1: Phổ hấp thu ̣ UV của PQ ............................................................................26
Hình 3.2: Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu.............................................................27
Hình 3.3: Sắc đồ phân tích PQ với hê d ̣ ung môi A (dung dịch NaOH 0,0125M trong
nƣớc và dung dịch NaOH 0,0125M trong methanol theo tỷ lệ 90:10, v/v) ..............28
Hình 3.4: Sắc đồ phân tích PQ với hê d ̣ ung môi B ...................................................29
Hình 3.5: Sắc đồ phân tích PQ với hê d ̣ ung môi C ...................................................29
Hình 3.6: Sắc ký đồ khảo sát tỉ lê p ̣ ha đông ACN : Đêm %v/v ................................30
Hình 3.7: Sắc đồ khao sat anh hƣởng của pH ...........................................................32 ́ ́

% RSD

Tên tiếng anh

Tên Tiếng việt

% Relative standard deviation

% Độ lệch chuẩn tƣơng đối

% Reproducibility standard

% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation

tƣơng đối

Acetonitrile

Acetonitril

Asymmetry factor

Hệ số đối xứng pic

ATP

Adenosin Triphophate


GC - MS
HP
HPLC

LC - MS

Gas chromatography - Mass
spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy

Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng khối phổ

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification


MeOH

R
ROC
RP-HPLC

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


Tên viết tắt
SD
SIPP
TCA
tR
UV-VIS

Tên tiếng anh

Tên Tiếng việt

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

Severity Index of Paraquat

Chỉ số độ nặng của ngộ độc


sƣ́ dung nhƣng ở Viêṭ Nam viêc thiu
các chính sách và biện pháp quản lý sƣ́ dung hóa
̣
ế
chất nay nên trong những năm vừa qua có rất nhiều trƣờng hơp ngô ̣ đôc PQ
̣ đến cấp
cứu [1]. Trên thế giới, nhiều ca tƣ́ vong do ngộ đôc PQ
̣ đã đƣơc báo cáo [10][19][27].
Tại Trung tâm Chống độc bệnh viện Bạch Mai, trong những năm gần đây, số lƣợng
bệnh nhân ngộ độc PQ không ngừng gia tăng và trở thành một vấn nạn vô cùng nghiêm trọng,
vƣợt ngƣỡng 300 ca trong năm 2013 và năm 2014 lên tới 391 ca. Tỉ lệ tử vong
do ngô ̣ đôc PQ
̣ rất cao, thƣờng khoảng 70-80% theo nhiều nghiên cứu của cac tac giả ́ ́
nƣớc ngoai [29][32]. Tại Trung tâm chống độc (TTCĐ) bêṇ h viêṇ Bac ̣ h Mai, tỉ lệ tƣ́
vong năm 2007 là 72,5% [4], năm 2011 là 72,9% [2], nghiên cứu taị bêṇ h viêṇ Chơ ̣
Rẫy thành phố Hồ Chí Minh là85%.
Trong chẩn đoán và điều trị ngộ độc cấp PQ, xét nghiệm định lƣợng PQ
trong huyết tƣơng đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của ngộ
độc, tiên lƣợng bệnh nhân cũng nhƣ đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị, đặc
biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu các biện pháp
điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nƣớc ngoài và một số tác
giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc máu hấp phụ bằng cột than
hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cƣờng đào thải PQ cho kết quả khả quan, cứu sống một
số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét nghiệm định lƣợng nồng độ PQ huyết
tƣơng cung cấp công cụ quan trọng để đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng
thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ định
tính trong nƣớc tiểu bằng phƣơng pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

Vũ Anh Phương


CHƢƠNG 1: TỔNG
QUAN
1.1. Tổng quan về paraquat
1.1.1. Công thức paraquat
Paraquat là từ viết tắt của paraquaternary bipyridyl, tên khoa học là 1,1'dimethyl-4,4' bipyridilium là thuốc diệt cỏ phổ biến nhất hiện nay do đặc tính diệt cỏ
nhanh và triệt để. PQ thuộc nhóm hợp chất amonium bậc 4 bipyridylium, đƣợc tổng
hợp đầu tiên vào năm 1882, ứng dụng trong nông nghiệp làm thuốc trừ cỏ từ những
năm 1950 [42].
PQ có khối lƣợng phân tử tƣơng đối 186,2 có công thức hóa học nhƣ hình
1.1:

Hình 1.1: Công thức hóa học của paraquat
1.1.2. Tính chất lý, hóa học của paraquat
PQ thƣờng có màu trắng hơi vàng, không mùi, tỷ trọng ở 20oC là 1,240 1,260, điểm chảy 175 - 180oC, điểm sôi khoảng 300oC và pH của dung dịch PQ trong
nƣớc 6,5 - 7,5.
PQ thƣờng ở d ạng dimethylsulphate hoặc dichloride. Dạng dichloride tinh
thể trắng, dạng dimethylsulphate chảy rữa. PQ ổn định trong dung dịch môi trƣờng
acid hoặc trung tính và không ổn định trong môi trƣờng kiềm.
PQ tan tốt trong nƣớc (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu nhƣ
không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dƣới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề mặt
anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không bay hơi.
Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].

Vũ Anh Phương

3

Trường ĐHKH Tự nhiên

lập tức với oxy tái tạo lại PQ2+ và gốc superoxid. Có sẵn NADPH và oxy, chu trình oxy
hoá - khử của PQ xảy ra liên tục, với việc NADPH liên tục bị mất đi và không ngừng
tạo ra gốc superoxid. Gốc tự do superoxid sau đó phản ứng với bản
thân nó để tạo ra peroxid hydro (H2O2), và với H2O2 cùng Fe để tạo thành gốc tự do
hydroxyl [18] [31]. Cạn kiệt NADPH dẫn tới chết tế bào. Chu trình oxy hoá - khử
tạo thành gốc tự do hydroxyl dẫn tới nhiều cơ chế làm tổn thƣơng tế bào: phản ứng với
lipid trên màng tế bào (peroxide hoá lipid), DNA và các protein tối cần thiết cho tế bào
sống sót cũng bị các gốc tự do hydroxyl phá hủy [12] [39] [40].
Hậu quả lên tế bào do việc hình thành các gốc tự do (superoxid và các gốc tự do
khác) là đối tƣợng của rất nhiều nghiên cứu. Các thử nghiệm điều trị nhằm vào việc
thay đổi các gốc tự do bằng các chất nhƣ desferioxamin, superoxid dismutase, αtocopherol và vitamin C cùng với bài niệu cƣỡng bức. Tuy nhiên, cho đến hiện nay không có chất
nào trong số này đƣợc khuyến cáo dùng.
Mặc dù chi tiết đầy đủ về độc chất học của các gốc tự do do PQ sinh ra vẫn chƣa
đƣợc biết nhƣng những gì ngƣời ta đã biết về cơ sở để ngộ độc là sự tƣơng tác giữa PQ,
NADPH và oxy. Sau đó, ở mức độ tế bào, oxy là yếu tố tối cần thiết cho việc hình
thành bệnh lý do PQ. Đây là cơ sở cho việc hạn chế cung cấp oxy trong việc điều trị ban
đầu bệnh nhân ngộ độc PQ.
PQ có tính ăn mòn và gây tổn thƣơng giống nhƣ kiềm khi tiếp xúc với da, mắt
và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là đƣờng tiêu
hoá, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thƣơng nặng nề do tác dụng ăn mòn trực tiếp khi
bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan đào thải PQ và DQ và
có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng ở phổi, PQ vào các phế bào
týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo cơ chế vận chuyển tích cực phụ
thuộc ATP.
Do vậy PQ gây tổn thƣơng hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có liên
quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ

Vũ Anh Phương

5

phổi, thận, gan và cơ, đặc biệt là phổi , PQ sẽ bi k ̣ hƣ́ thanh daṇ g gốc tƣ ̣ do hoaṭ tinh
cao [8][22]. Thể tích phân bố của PQ là 1,2 - 1,6 l/kg.
PQ đạt đƣợc nồng độ cao và tồn tại lâu hơn trong phổi, nồng độ trong phổi có
thể cao hơn so với nồng độ huyết tƣơng gấp 50 lần. Sau uống 5-7 giờ, nồng độ PQ trong
tổ chức phổi đạt cao nhất. Tuy nhiên, lƣợng PQ huyết tƣơng cũng cần đạt đến một
ngƣỡng tới hạn để cho quá trình hấp thu ở phổi diễn ra [11].

Vũ Anh Phương

6

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ qua đƣợc nhau thai. Trong một nghiên cứu, nồng độ PQ trong dịch ối và
máu dây rốn, bào thai cao hơn nồng độ trong máu mẹ 4-6 lần [11]. Không có bào thai nào
sống sót. Tuy nhiên nếu mẹ ngộ độc PQ còn sống thì đến lần có thai sau không nguy hiểm
đến bào thai.
1.1.4.3. Chuyển hoá, thải trừ
PQ đƣợc đào thải hầu nhƣ hoàn toàn qua thận nhờ cả quá trình lọc của cầu thận
và quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên 90% PQ
đƣợc đào thải dƣới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình thƣờng
[11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nƣớc tiểu vài ngày sau do có sự tái phân
bố PQ từ các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12- 120 giờ hoặc lâu
hơn khi có suy thận. Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dƣới dạng không đổi [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lƣợng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tƣơng theo thời
gian. Nồng độ PQ phải đo trƣớc khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm giảm nồng
độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29] lần đầu tiên trình
bày biểu đồ tiên lƣợng khả năng sống từ kết quả định lƣợng nồng độ PQ huyết tƣơng tại

Năm 1988 Sawada và cộng sự [34] báo cáo chỉ số tiên lƣợng ngộ độc PQ dựa
trên nghiên cứu nồng độ PQ huyết thanh ở 30 bệnh nhân, 20 tử vong và 10 BN sống. Chỉ
số độ nặng của ngộ độc PQ (SIPP: severity index of PQ poisoning) tính bằng thời gian
từ khi uống (giờ) cho đến khi bắt đầu điều trị nhân với nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)
khi vào viện.
SIPP = [nồng độ PQ huyết thanh (µg/ml)] × [thời gian từ uống đến bắt đầu điều trị (h)]
Khi điểm SIPP ít hơn 10, bệnh nhân có thể sống sót; điểm 50 phân biệt tử vong
muộn do suy hô hấp (10 < SIPP 50). Mặc dù đây là nghiên cứu quan trọng, Sawada xét nghiệm định
lƣợng dùng huyết thanh không phải huyết tƣơng. Suzuki và cộng sự (1991) đã so sánh
SIPP với đồ thị tiên lƣợng sống trên 167 BN nhập viện trong vòng 24 h sau uống PQ.
Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1 trƣờng hợp tử vong
và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10 trƣờng hợp tử vong. Những
khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận rằng dựa trên nồng độ PQ trong
24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên lƣợng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các phƣơng pháp xác định paraquat trong huyết tƣơng
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lƣợng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi trƣờng kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bƣớc sóng 600nm
trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời, có
thể chiết đƣợc bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lƣợng PQ

bƣớc sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lƣợng nồng độ PQ
trong huyết tƣơng dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật
Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch nƣớc chuẩn PQ 10 µg/ml đƣợc quét bƣớc sóng từ
200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nƣớc cất. Huyết tƣơng sạch và các dung dịch huyết
tƣơng chuẩn PQ 50 và 10 µg/ml đƣợc thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v). Lắc xoáy, ly tâm
13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bƣớc sóng từ 200 đến
300 nm. Sau khi xử lý mẫu nhƣ trên, dịch trong phần trên đƣợc chuyển vào ống
Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trƣớc khi đo, 400 µl mẫu đƣợc lắc trộn nhẹ
nhàng và hoàn toàn với 100 µl hỗn hợp đồng thể tích
Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tƣơng tự với mẫu huyết tƣơng trắng đối chiếu và
đo độ hấp thụ quang trong khoảng bƣớc sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bƣớc
sóng ∆λ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể đƣợc tính toán theo công thức ∆2Abs/(∆λ)2
(khoảng bƣớc sóng dẫn xuất ∆λ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phƣơng pháp GC-MS là phƣơng pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao,
từ lâu đã đƣợc sử dụng để định lƣợng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và Almeida
R. M. [5] cùng sử dụng phƣơng pháp GC-MS để định lƣợng PQ. Trong cả hai nghiên
cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion monitoring - SIM) để
nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn, khí He đƣợc dùng nhƣ là
khí mang để đƣa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu

Vũ Anh Phương

10

Trường ĐHKH Tự nhiên


phân tích đều đƣợc khử bằng NaBH4 trƣớc khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.


Trường ĐHKH Tự nhiên


photodiode Water 996 hoạt động từ bƣớc sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm.
Độ hấp thụ UV đƣợc đo ở 258 nm.
Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile.
Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH 3,7
bằng acid formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc độ dòng
0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20% trong 0,5
phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng thời gian chạy
là 3 phút. Thì tác giả Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và đệm ammonium
formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc độ 300 µl/phút.
Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dƣơng để ion hóa PQ và
chuẩn nội nhƣng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY
BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ƣu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm
dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250 mM
(40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h ở 350oC.
Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là 4,0 V và điện
áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lƣợng bằng kỹ thuật quét ion (multi- reaction
monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản phẩm có m/z
155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản phẩm có m/z 158
và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) đƣợc thực hiện trên máy
khối phổ tƣ́ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lƣợng
ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan) 0,1s.
Đƣờng chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu

giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bƣớc sóng hấp thụ 258 nm. Pha động gồm
acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nƣớc khử
khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile nồng độ 10% (v/v). Kết
quả: Thời gian lƣu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút. Giới hạn phát hiện (LOD)
0,1 µg/ml, giới hạn định lƣợng (LOQ) 0,4 µg/ml trong huyết tƣơng và huyết thanh. Độ
đúng trong ngày không vƣợt quá 3,5%; 3,2% đối

Vũ Anh Phương

13

Trường ĐHKH Tự nhiên


với huyết tƣơng, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vƣợt quá 4,7%; 3,1%
đối với huyết tƣơng, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tƣơng và huyết thanh lần
lƣợt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lƣợng đồng thời PQ và DQ trong huyết tƣơng bằng
phƣơng pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm mẫu
(20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS đƣợc tách trên cột pha đảo Capcell PaK C18
UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung dịch rửa
giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và sodium 1heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5 ml/phút và nhiệt
độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC đƣợc trộn với dung dịch kiềm
của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Hỗn hợp đƣợc
dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và đƣợc làm ấm trong bể nƣớc SB-9 (EYELA, Tokyo,
Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bƣớc sóng 391 nm bằng detector UV Hitachi L- 7405. Độ
cao của pic đƣợc dùng để định lƣợng bằng máy C- R6A Chromatopak (Shimadzu,
Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol)
trên ml huyết tƣơng.
Định lƣợng PQ trong huyết tƣơng sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo