BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
LÊ VĂN THUYÊN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
HỢP CHẤT HYPOPHYLLANTHIN TRONG
MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Vinh, 2015
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
LÊ VĂN THUYÊN
NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
HỢP CHẤT HYPOPHYLLANTHIN TRONG
MỘT SỐ CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)
Chuyên ngành: HÓA HỮU CƠ
Mã số: 60.44.01.14
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐINH THỊ TRƯỜNG GIANG
Trang
MỞ ĐẦU........................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN.............................................................................4
1.1. Tổng quan về chi phyllanthus..................................................................4
1.1.1. Đặc điểm thực vật..................................................................................4
1.1.2. Thành phần hóa học..............................................................................4
1.1.3. Hoạt tính sinh học của chi Phyllanthus.................................................5
1.1.3.1. Tác dụng dược lí.................................................................................5
1.1.3.2. Một số công trình nghiên cứu về dược lý của cây diệp hạ châu........7
1.2. Giới thiệu về hợp chất lignan...................................................................9
1.2.1.Phyllanthin ...........................................................................................9
1.2.2.Hypophyllanthin
...............................................................................10
1.3. Những nghiên cứu về hypophyllanthin và loài phyllanthus...................11
1.3.1. Ở nước ngoài.......................................................................................11
1.3.2. Ở Việt Nam.........................................................................................12
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.....................................14
1.4.1. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.......................14
1.4.1.1. Cơ sở lí thuyết của phương pháp......................................................14
1.4.1.2. Phân loại sắc ký và ứng dụng...........................................................15
1.4.1.3. Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ.............................................17
1.4.2. Hệ thống HPLC...................................................................................20
1.4.3. Chọn điều kiện sắc ký.........................................................................21
1.4.3.1. Lựa chọn pha động...........................................................................21
1.4.3.2. Lựa chọn pha tĩnh.............................................................................22
1.4.3.3. Detector............................................................................................24
1.4.4. Tiến hành đo sắc ký.............................................................................26
.......................................................................43
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp phân tích....................................................................................48
3.2.2.1. Giới hạn phát hiện LOD...................................................................48
3.2.2.2. Giới hạn định lượng LOQ................................................................49
3.2.3. Kết quả phân tích hypophyllanthin trong các mẫu chế phẩm.............50
3.2.4. Đánh giá phương pháp xác định hypophyllanthin ............................51
3.2.4.1. Đánh giá độ lặp lại của phương pháp...............................................51
3.2.4.2. Xác định độ thu hồi..........................................................................55
3.2.5. Các sắc đồ của hypophyllanthin trong phép đo HPLC.......................60
KẾT LUẬN..................................................................................................64
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................66
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
AOAC
Tên đầy đủ
Tên tiếng anh
Hiệp hội hóa học phân Association
ACN
MeOH
FLD
LOD
LOQ
Limit of quantitation
Molecular weight
High
Performance
thường
performance
Sắc ký hấp phụ pha đảo
chromatography
Reversed
phase
performance
chromatography
Liquid
–
High
liquid
–
High
liquid
DANH MỤC CÁC BẢNG
Hình 2.5: Mẫu M5.........................................................................................34
Hình 2.6: Mẫu M6.........................................................................................35
Hình 2.7: Mẫu M7.........................................................................................35
Hình 3.1: Phổ khối lượng ESI-MS của hợp chất 1.......................................40
Hình 3.2: Phổ 1H-NMR của hợp chất 1..........................................................41
Hình 3.3: Phổ 13C-NMR của hợp chất 1.........................................................41
Hình 3.4: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 0,5ppm.....................44
Hình 3.5: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 1 ppm.......................44
Hình 3.6: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 2 ppm.......................45
Hình 3.7: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 5 ppm.......................45
Hình 3.8: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 10 ppm.....................46
Hình 3.9: Sắc đồ chuẩn hypophyllanthin có nồng độ 50 ppm.....................46
Hình 3.10: Đường chuẩn hypophyllanthin ..................................................47
Hình 3.11: Sắc đồ mẫu M1- VRXOGA-PV..................................................60
Hình 3.12: Sắc đồ mẫu M2- Diệp hạ châu BPV...........................................60
Hình 3.13: Sắc đồ mẫu M3- Diệp hạ châu- DANAPHA..............................61
Hình 3.14: Sắc đồ mẫu M4- Chancapiedra Diệp hạ châu.............................61
Hình 3.15: Sắc đồ mẫu M5- Diệp hạ châu V................................................62
Hình 3.16: Sắc đồ mẫu M6- Diệp hạ châu phylanthus unirania....................62
Hình 3.17: Sắc đồ mẫu M7- L’ANGFARM Diệp hạ châu sấy khô..............63
1
MỞ ĐẦU
1.
Lí do chọn đề tài:
Việt Nam với số lượng phong phú. Dựa trên các nghiên cứu khoa học và kinh
nghiệm dân gian, cây “ Diệp hạ châu” ngày càng được dùng nhiều trong công
nghiệp dược. Các nghiên cứu cho thấy chất phyllanthin và hypophyllanthin
có mặt như nhứng thành phần chính của cây. Các chất này có tác dụng làm
gia tăng lượng glutathion là chất bảo vệ và phục hồi tế bào gan. Làm giảm
men gan do ức chế men ADN polymerase của virus viêm gan B. Vì vậy Diệp
hạ châu có tác dụng rất tốt để hỗ trợ điều trị viêm gan, viêm gan B, gan nhiễm
mỡ, xơ gan, giải độc men gan do uống rượi bia, ... trên thị trường trong nước
hiện nay xuất hiện rất nhiều dòng sản phẩm có nguồn gốc từ Diệp hạ châu.
Các sản phẩm hết sức đa dạng về cả hình thức và chất lượng, chúng được bào
chế dưới dạng: trà tan, viên nang cứng, viên nén bao phim, viên bao đường, ...
như Diệp hạ châu, Bình can ACP, Bibina, Hamega, ... Thực tế cho thấy việc
kiểm tra , kiểm soát chất lượng các chế phẩm này phải được thực hiện chặt
chẽ hơn, đặc biệt là việc kiểm tra chất lượng vì đó là yếu tố chính quyết định
hiệu quả điều trị của thuốc. Tuy nhiên hầu hết các sản phẩm này mới chỉ được
đánh giá trên các tiêu chí về hình thức, đồng đều về khối lượng, độ rã, định
tính dược liệu, ... mà hầu như chưa có tiêu chuẩn về định tính, định lượng các
hoạt chất chính trong các chế phẩm này. Trong đó cũng có một số công trình
nghiên cứu và định lượng về chất phyllanthin trong cây Diệp hạ châu và một
số dược phẩm khác.
Để góp phần vào công tác kiểm tra, đánh giá chất lượng của các chế
phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên, chúng tôi chọn đề tài “ Nghiên cứu
xác định hàm lượng hợp chất hypophyllanthin trong một số chế phẩm
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”.
2. Đối tượng nghiên cứu:
3
- Hợp chất hypophylanthin trong một số loại thuốc thảo dược và chế
5
Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về chi Phyllanthus:
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Các loài thực vật thuộc chi Phyllanthus L. họ Thầu dầu phân bố hầu hết
ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài được
chú ý nhiều hơn cả là P. niruri L (chó đẻ thân xanh), P. amarus Schum (chó
đẻ đắng = diệp hạ châu đắng), P. urinaria L. (chó đẻ răng cưa). Trên thế giới
các loài này đã được Y học cổ truyền sử dụng từ lâu để chữa bệnh gan, bệnh
thận, bệnh tiểu đường vv... Cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L.)
trong y học dân tộc được nhân dân dùng để chữa viêm họng, đinh râu, mụn
nhọt, viêm da, lở ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, chàm má, tưa lưỡi, rắn rết
cắn, liều lượng không hạn chế .
Về mặt hoá học thực vật, từ cây chó đẻ răng cưa đã phân lập được một số chất
có tác dụngsinh học cao như các flavonoit, các steroit, các tanin, các glycozit,
gần đây người ta đã phân lập được 4 lignan mới có tác dụng chữa bệnh từ cây
chó đẻ răng cưa Đài Loan. Ở Việt Nam, cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus
urinaria L.) đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh từ lâu, nhưng các nghiên
cứu hoá học thực vật thì mới chỉ bắt đầu từ vài năm gần đây.
1.1.2. Thành phần hóa học: [14],[16], [19],[22],[26]
Thành phần hóa học của Chi Phyllanthus rất đa dạng và phong phú,
bao gồm :
+ Nhiều hợp chất triterpenoid như: phyllanthol, β-amyrin… (từ P.
acidus), lupeol, lupenon (từ P. emblica), friedelan-3-β-ol, friedelin, βsitosterol, betulinic acid, glochidonol, 21-α-hydroxy-friedelan-4(23)-en-3-one
(từ P. reticulatus), β-amyrin, β-sitosterol, tricontanol… (từ P. urinaria).
+ Các hợp chất flavonoid như: quercetin-3-glucosid, rutin (từ P.
amarus), quercetin, kaemferol, astragalin (từ P. emblica)…
triển của virus HIV và chống suy giảm miễn dịch.
1.1.3.1. Tác dụng dược lý: [38], [39],[40]
Điều trị viêm gan:
Tại Việt Nam, khá nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng điều trị
viêm gan của Diệp hạ châu đã được tiến hành, chẳng hạn: nhóm nghiên cứu
7
của Lê Võ Định Tường (Học Viện Quân Y - 1990 - 1996) đã thành công với
chế phẩm Hepamarin từ Phyllanthus amarus.
Tác dụng trên hệ thống miễn dịch:
- Vào năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã khám phá tác
dụng ức chế sự phát triển HIV-1 của cao lỏng Phyllanthus niruri thông qua sự
kìm hãm quá trình nhân lên của virus HIV.
- Năm 1996, Viện nghiên cứu Dược học Bristol Myezs Squibb cũng đã
chiết xuất từ Diệp hạ châu được một hoạt chất có tác dụng này và đặt tên là
“Nuruside”.
Tác dụng giải độc:
- Người Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc dùng Diệp hạ châu để trị các
chứng mụn nhọt, lở loét, đinh râu, rắn cắn, giun. Nhân dân Java, Ấn Độ dùng
để chữa bệnh lậu. Theo kinh nghiệm dân gian Malaysia, Diệp hạ châu có thể
dùng để trị các chứng viêm da, viêm đường tiết niệu, giang mai, viêm âm
đạo,...
- Công trình nghiên cứu tại Viện Dược liệu - Việt Nam (1987 - 2000)
cho thấy khi dùng liều 10 - 50g/kg, Diệp hạ châu có tác dụng chống viêm cấp
trên chuột thí nghiệm.
Điều trị các bệnh đường tiêu hóa:
Cây thuốc có khả năng kích thích ăn ngon, kích thích trung tiện. Người
Ấn Độ dùng để chữa các bệnh viêm gan, vàng da, kiết lỵ, táo bón, thương
của HBV, làm giảm hoạt độ HbsAg và Anti- HBs. Theo các nghiên cứu, cây
diệp hạ châu chứa một số enzyme và hoạt chất có tác dụng chữa viêm gan
9
như: Phyllanthine, hypophyllanthine, alkaloids và flavonoids... Người ta cho
rằng chó đẻ răng cưa có tác dụng ức chế mạnh HBV- DNA (virut viêm gan B
trên hệ mã di truyền) và làm cho virut bị đào thải, không bám vào được ADN
của người. Những bệnh nhân viêm gan do HBV sau khi sử dụng thuốc có chó
đẻ răng cưa, được phục hồi enzym transaminase từ 50-97%, bilirubin toàn
phần trở về bình thường.
Một nghiên cứu cho thấy, 50% yếu tố lây truyền của virus viêm gan B
trong máu đã mất đi sau 30 ngày sử dụng loại cây này (với liều 900 mg/ngày).
Trong thời gian nghiên cứu, không có bất kỳ sự tương tác nào giữa Diệp hạ
châu với các thuốc khác.
Theo một nghiên cứu tiến hành năm 1995, cây thuốc này có tác dụng lợi
tiểu, giảm huyết áp tâm thu ở người không bị tiểu đường và giảm đáng kể
đường huyết ở bệnh nhân tiểu đường.
Thí nghiêm trên chuột cống trắng cho thấy: Phyllanthin và
hypophyllanthin
chống lại tính độc hại tế bào gây ra bởi carbontetraclorid
và galactosami; chất triterpen triacontanol có tác dụng bảo vệ gan chống lại
tính độc hại tế bào gây ra bởi galactosamin.
Trên in vitro: cây chó đẻ có tác dụng kháng virus viêm gan B.
Một loạt những acid phenolic phân lập từ các lào Phyllanthus có tác dụng ức
chế DNA polymerase của virus viêm gan B.
Cây chó đẻ có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ
trên các bệnh nhân mang viruts viêm gan B,
Phyllanthus amarus đã làm giảm các kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B.
Dịch chiết nước của cây có khả năng ức chế men tổng hợp DNA nội sinh của
virus viêm gan B và gắn vào bề mặt kháng nguyên của virus trong ống
nghiệm. Ở mức độ tế bào , dịch chiết nước của Phyllanthus amarus có tác
dụng ức chế HbsAg trong 48 giờ trên các tế bào ung thư gan ở nồng độ 1
mg/ml.
- Tác dụng chống độc gan: bột Phyllanthus amarus có khả năng khôi phục lại
bình thường các mức cholesterol, triglyceride và phospholipids ở các con
chuột bị gây ngộ độc gan bằng rượu. Các thông số men gan như AST, ALT
cũng trở lại bình thường. Nghiên cứu trên chuột bị gây ngộ độc bằng CCl 4
cũng cho kết quả tương tự. Trên tế bào gan chuột nuôi cấy bị ngộ độc bằng
CCl4 hay galactosamine, dịch chiết n- hexan của cây Phyllanthus niruri và các
chất phân lập từ dịch chiết này là: Phyllanthin , hypophyllanthin
và
triacontanal có tác dụng bảo vệ tế bào rất tốt.
- Năm 1988( Lancet Oct.1.1988) Blumberg và Thiogarajan công bố đã điều
trị 37 bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng Diệp hạ châu đắng( phyllathus
amarus) với liều dùng hằng ngày 200 mg cao toàn cây Diệp hạ châu
13
đắng( loại bỏ rễ) trong 30 ngày. Kết quả 22/37 bệnh nhân điều trị đã mất
kháng nguyên bề mặt của viêm gan B khi làm xét nghiệm ở 15-20 ngày sau
khi kết thúc điều trị. Một số đối tượng được theo dõi 9 tháng, không có trường
hợp nào kháng nguyên bề mặt trở lại. Tuy vậy, hiệu quả của diệp hạ châu
18%; 04 mẫu thuộc loài phyllathus urinaria không có Phyllanthin . Điều này
khác với một số công bố trước đâycho rằng loài phyllathus urinaria có cả hai
hợp chất phyllanthin và hypophyllanthin [14] .
- Đề tài : “ sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp của cây diệp hạ châu
đắng nuôi cấy quang tự dưỡng trong điều kiện môi trường giàu” của các tác
giả: Phạm Minh Duy, Nguyễn Như Hiến, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Du
Sanh, Nguyễn Thị Quỳnh được đăng trên Tạp chí sinh học, số 34, 2012. Đề
tài nghiên cứu vai trò của CO 2 lên sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp
của cây diệp hạ châu đắng invitro không chỉ có lợi cho việc sản xuất cây
invitro, mà còn cho việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ cây invitro. Kết quả
nghiên cứu cho thấy: Cây diệp hạ châu đắng nuôi cấy invitro trong môi
trường giàu CO2 tăng trưởng tốt hơn và tạo ra được nhiều hợp chất
phyllanthin , hypophyllanthin
và niranthin hơn so với cây nuôi cấy ở điều
kiện CO2 không khí thấp. Khi đưa ra vườn ươm, cây được nuôi cấy invitro ở
nồng độ CO2 cao tiếp tục duy trì sự tăng trưởng tốt hơn so với cây này ở nồng
độ CO2 thấp.
- Công trình nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc
Hạnh, Nguyễn Quang Trung, Phạm Ngọc Thành, Trần Thị Huệ, Viện công
nghệ hóa học TP Hồ Chí Minh và Đại Học Cần Thơ, đăng trên tạp chí Hóa
học,T40, Số 4, năm 2012, đã trình bày nghiên cứu của các tác giả “ Khảo sát
thành phần lignan của các loại phyllanthus thuộc họ thầu dầu
(EUPHORBIACEA). Kết quả nghiên cứu thu được: Từ cây chó đẻ
(PHYLLANTHIN .niruri) đã tách được 3 hợp chất lignan và xác định được
3 hợp chất đó là: Phyllanthin , hypophyllanthin
hypophyllanthin
- Thường không phân hủy mẫu trong quá trình phân tích.
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh và pha
động. Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch. Khi tiến
hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha tĩnh và
pha động. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất
hóa học của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha
Copyright: Tài liệu đại học ©