Header Page 1 of 126.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRẦN TRỌNG HIẾU

PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH CỦA
VI KHUẨN NỘI SINH Ở CÂY TRINH NỮ
(Mimosa pudica L.) TẠI TỈNH TRÀ VINH

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số ngành: 60 42 02 01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

2015
Footer Page 1 of 126.


Luận văn Tốt nghiệp Cao học khóa 20 - 2015

Trường ĐHCT

Header Page 2 of 126.

TÓM TẮT
Từ lâu thuốc kháng sinh được sử dụng điều trị các bệnh do vi khuẩn. Sau
một thời gian, các nhóm vi khuẩn đã kháng lại thuốc. Tuy nhiên, nhiều cây

Footer Page 2 of 126.

iii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn Tốt nghiệp Cao học khóa 20 - 2015

Trường ĐHCT

Header Page 3 of 126.

ABSTRACT
Synthetic antibiotics have been used for a long time to treat bacterial
pathogen. After sometime bacteria could resist to antibiotics. However,
several medicinal plants have been used instead of synthetic antibiotics but
they did not have this problem. Therefore, isolation and examine
characteristics of endophytic bacteria from Mimosa pudica L. cultivated in
Tra Vinh province was carried out. Conduct examine nitrogen fixation ability
of endophytic bacterial strains followed by Indolphenol blue method, Indole-3Acetic acid (IAA) synthesis followed by Salkowski method, solubilize insoluble
phosphate to soluble and antibacterial activity by blotter diffusion method.
Forty-four endophytic bacterial strains were isolated from samples of Mimosa
pudica L. cultivated of Tra Vinh province. Almost bacterial cells had rod
shape, Gram negative, motile. All strains were able to fix nitrogen, synthesized
IAA and could solubilize insoluble phosphate to soluble. The results showed
that these endophytes could produce ammonium and IAA in the medium after
2nd days. The highest amount of ammonium and IAA were produced at day
fourth and considerably decreased at 6th days. The strain TH4 had the highest
ability of N-fixing with 0,68 µg/mL, while strain RH5 gave highest amount of

Header Page 4 of 126.

MỤC LỤC
Trang
CHẤP THUẬN CỦA HỘI ĐỒNG..................................................................... i
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................... ii
TÓM TẮT ......................................................................................................... iii
ABSTRACT...................................................................................................... iv
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ ........................................................................ v
MỤC LỤC ........................................................................................................ vi
DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................ x
DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................ xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... xii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ............................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu của đề tài ....................................................................................... 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
2.1 Sơ lược về tỉnh Trà Vinh ............................................................................. 3
2.1.1 Vị trí địa lý ................................................................................................ 3
2.1.2 Điều kiện đất đai ....................................................................................... 4
2.1.3 Điều kiện sông ngòi .................................................................................. 4
2.1.4 Điều kiện thời tiết, khí hậu ....................................................................... 5
2.2 Sơ lược về cây Trinh nữ .............................................................................. 5
2.2.1 Nguồn gốc, phân bố và phân loại ............................................................. 5
2.2.2 Mô tả thực vật ........................................................................................... 6
2.2.3 Một số công dụng theo kinh nghiệm dân gian .......................................... 7
2.2.4 Một số nghiên cứu khoa học trong nước .................................................. 8
2.2.5 Một số nghiên cứu khoa học ngoài nước .................................................. 8
2.2.6 Thành phần hóa học của cây Trinh nữ .................................................... 10
2.2.7 Tính kháng khuẩn của cây Trinh nữ ....................................................... 14

3.2.1 Vật liệu .................................................................................................... 29
3.2.2 Dụng cụ ................................................................................................... 30
3.2.3 Trang thiết bị ........................................................................................... 30
3.2.4 Hóa chất .................................................................................................. 31
3.3 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 33
3.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn nội sinh ................................................ 33
3.3.2 Quan sát và đo kích thước tế bào vi khuẩn nội sinh ............................... 36
3.3.3 Nhuộm Gram vi khuẩn nội sinh.............................................................. 37
3.4 Khảo sát một số đặc tính của vi khuẩn nội sinh ........................................ 38
3.4.1 Khảo sát khả năng cố định đạm của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập
được ở cây Trinh nữ ......................................................................................... 38
3.4.2 Khảo sát khả năng tổng hợp IAA của các dòng vi khuẩn nội sinh phân
lập được ở cây Trinh nữ ................................................................................... 41
3.4.3 Khảo sát khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh
phân lập được ở cây Trinh nữ .......................................................................... 43
3.4.4 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập
được ở cây Trinh nữ ......................................................................................... 44
3.5 Tuyển chọn, định danh những dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng ............ 45
3.5.1 Chiết tách DNA của những dòng vi khuẩn nội sinh triển vọng ............. 45
3.5.2 Định danh các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật Sinh học Phân tử 46
3.6 Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................... 47
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 48
4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh ........................................................... 48
4.1.1 Đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội sinh .............................. 50

Ngành Công nghệ Sinh học

Footer Page 5 of 126.

vii

sinh ................................................................................................................... 68
4.4.1 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở nốt rễ
(nhóm 1) ........................................................................................................... 68
4.4.2 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở rễ (nhóm
2) ...................................................................................................................... 69
4.4.3 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở thân
(nhóm 3) ........................................................................................................... 70
4.4.4 Khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh ở lá (nhóm
4) ...................................................................................................................... 71
4.4.5 So sánh khả năng hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh
triển vọng ......................................................................................................... 72
4.5 Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh . 73
4.5.1 Khả năng kháng với vi khuẩn Aeromonas hydrophila ........................... 74
4.5.2 Khả năng kháng với vi khuẩn Escherichia coli ...................................... 75
4.5.3 Khả năng kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus ........................... 77
4.6 Kết quả định danh các dòng vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật Sinh học Phân
tử ...................................................................................................................... 80
Ngành Công nghệ Sinh học

Footer Page 6 of 126.

viii

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn Tốt nghiệp Cao học khóa 20 - 2015

Trường ĐHCT


Bảng 3.2: Thành phần môi trường PDA .......................................................... 32
Bảng 3.3: Thành phần môi trường NBRIP ...................................................... 33
Bảng 3.4: Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR ............................... 46
Bảng 3.5: Quy trình nhiệt độ của phản ứng PCR ............................................ 46
Bảng 4.1: Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trường PDA ....... 49
Bảng 4.2: Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường PDA sau 24 giờ .................... 51
Bảng 4.3: Đặc điểm tế bào vi khuẩn được phân lập trên môi trường PDA ..... 53
Bảng 4.4: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở nốt rễ .. 55
Bảng 4.5: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở thân ..... 58
Bảng 4.6: Hàm lượng ammonium (µg/mL) của các dòng vi khuẩn triển vọng
.................................................................................................................. 60
Bảng 4.7: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở nốt rễ .............. 62
Bảng 4.8: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn ở thân ................ 64
Bảng 4.9: Hàm lượng IAA (µg/mL) của các dòng vi khuẩn triển vọng .......... 67
Bảng 4.10: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn ở nốt rễ .......... 69
Bảng 4.11: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn ở thân ............ 71
Bảng 4.12: Hiệu quả hòa tan lân (E%) của các dòng vi khuẩn triển vọng ...... 72
Bảng 4.13: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) các dòng VKNS kháng
A.hydrophila ............................................................................................. 74
Bảng 4.14: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) của các dòng VKNS kháng
S.aureus .................................................................................................... 77

Ngành Công nghệ Sinh học

Footer Page 8 of 126.

x

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Hình 4.12: Đường kính vòng vô khuẩn (mm) các dòng VKNS kháng E.coli . 76
Hình 4.13: Vòng vô khuẩn của dòng TH13 và LH10 kháng với E.coli .......... 76
Hình 4.14: Vòng vô khuẩn của dòng TH2 và TH3 kháng với S.aureus.......... 78
Hình 4.15: Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng NH11 .......................... 81
Hình 4.16: Trình tự gen mã hóa 16S-rRNA của dòng TH10 .......................... 83

Ngành Công nghệ Sinh học

Footer Page 9 of 126.

xi

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học


Luận văn Tốt nghiệp Cao học khóa 20 - 2015

Trường ĐHCT

Header Page 10 of 126.

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
- 16S-rRNA

16S ribosomal Ribonucleic acid
(Vùng gen mã hóa 16S-rRNA)

- A.hydrophila

Aeromonas hydrophila

- dNTPs

Deoxynucleotide Triphosphates
(Hỗn hợp chứa 4 loại nucleotides)

- E.coli

Escherichia coli
(Vi khuẩn Escherichia coli)

- IAA

Indole-3-Acetic acid
(Kích thích tố tăng trưởng thực vật, Auxin tự nhiên)

- kb

Kilo base pairs
(1.000 cặp bazơ nitơ)

- NBRIP

National Botanical Research Institute’s Phosphate
(Môi trường chứa lân khó tan NBRIP)

- NCBI

National Center for Biotechnology Information
(Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học của Mỹ)


- PDA

Potato Dextrose Agar
(Môi trường dinh dưỡng PDA)

- S.aureus

Staphylococcus aureus
(Vi khuẩn Staphylococcus aureus)

- Stt

Số thứ tự

- Taq polymerase

Thermus aquaticus polymerase
(Men polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus)

- UV

Ultra violet
(Tia cực tím, tia tử ngoại)

- VK

Vi khuẩn

- VKNS


hoặc tình trạng không dung nạp thuốc thường xảy ra. Loại phản ứng này
thường ảnh hưởng đến một số hệ thống cơ quan của cơ thể như da, niêm mạc,
gan, tế bào máu,... đã dẫn đến những tai biến nguy hiểm do nhiều loại kháng
sinh gây ra, có khi dẫn đến tử vong. Trong thời đại ngày nay, con người có xu
hướng sử dụng nguồn thảo mộc mà thiên nhiên ban tặng để tăng cường sức
khỏe, chữa bệnh hiệu quả mà không gây tác dụng phụ lại vừa có lợi về mặt
kinh tế.
Thuốc thảo dược có chứa các hoạt chất tự nhiên đóng vai trò quan trọng
trong việc phòng chống bệnh tật, duy trì sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc
sống cho con người với nhiều thành phần có hoạt tính sinh học và dược lý
quan trọng, có giá trị được chế tạo ra thành các loại thuốc, gia vị, thức uống,
mỹ phẩm,.... Việc sử dụng kháng sinh có nguồn gốc thiên nhiên đang được
nhiều người hướng đến vì có đặc điểm nổi bật là rất ít độc, không gây ra
những tai biến nguy hiểm. Cho đến nay chưa có tài liệu nghiên cứu nào cho
thấy hiện tượng kháng thuốc khi sử dụng các loại thuốc có nguồn gốc thiên
nhiên. Mặc dù hiệu lực kháng khuẩn của chúng không mạnh bằng các loại
kháng sinh tân dược nhưng cũng đủ để chữa khỏi bệnh. Vì thế, trong thời gian
gần đây, việc tập trung nghiên cứu các loại kháng sinh có nguồn gốc thảo mộc
đang có xu hướng tăng trên thế giới đã cho thấy tiềm năng to lớn mà chúng
mang lại.
Nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và quý giá, đó
luôn là đề tài hấp dẫn các nhà khoa học trong nước và trên thế giới. Trong đó,
cây Trinh nữ là một trong những cây dược liệu phổ biến đã được Đông y cổ
truyền sử dụng để điều trị các vấn đề về bệnh lý. Theo Azmi et al. (2011) thì
Ngành Công nghệ Sinh học

Footer Page 12 of 126.

1


pudica L.) tại tỉnh Trà Vinh có các đặc tính tốt như tính kháng khuẩn, khả
năng cố định đạm, tổng hợp IAA, hòa tan lân khó tan nhằm để ứng dụng sản
xuất phân vi sinh thay thế phân bón hóa học phục vụ trong lĩnh vực nông
nghiệp, vừa tăng năng suất cây trồng lại vừa giảm chi phí phân bón và công
lao động, đồng thời giúp hạn chế ô nhiễm môi trường đất canh tác. Mặt khác
còn có ứng dụng hiệu quả trong lĩnh vực y vi sinh nhằm sản xuất các loại
thuốc kháng sinh thảo dược thay thế một phần thuốc kháng sinh tân dược có
nguồn gốc hóa học, giúp điều trị bệnh ở người và vật nuôi mà không gây ra
tình trạng kháng thuốc hay tác dụng phụ.

Ngành Công nghệ Sinh học

Footer Page 13 of 126.

2

Viện NC&PT Công nghệ Sinh học