ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN
VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4
Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------*

*------------

Nguyễn Tiến Đạt

PHÂN TÍCH ĐA HÌNH DI TRUYỀN
VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN CỦA GENOsHKT2;4
Ở LÚA (Oryza sativa)
Chuyên ngành :

Di truyền học

Mã số:

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người
thân, những người đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện tốt
nhất để tôi học tập. Cảm ơn mọi người đã luôn động viên, khuyến
khích tôi trong quá trình học tập và thí nghiệm.
Hà Nội, tháng 11 năm 2016

Nguyễn Tiến Đạt


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1
CHƢƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................3

1.1.

Giới thiệu về cây Lúa (Oryza sativa) .............................................. 3

1.2.

Giới thiệu về họ protein vận chuyển ion xuyên màng HKT ở

thực vật và ở lúa...................................................................................... 4
1.2.1.

Họ protein HKT ở thực vật ....................................................... 5

1.2.2.


1.4.2.

RT-PCR và Real-time PCR ..................................................... 17

1.4.3.

Các phƣơng pháp sử dụng chip ............................................... 19

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................20
2.1.

Đối tƣợng nghiên cứu, hóa chất và thiết bị ................................... 20

2.1.1.

Đối tƣợng nghiên cứu .............................................................. 20

2.1.2.

Vật liệu, hóa chất và thiết bị.................................................... 21

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................. 22

2.2.1.

Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình gen

OsHKT2;4 ............................................................................................. 22

Phân tích biểu hiện gen ................................................................. 43

3.2.1.

Kết quả trồng lúa thủy canh và xử lý mặn .............................. 43

3.2.2.

Kết quả tách chiết RNA và tổng hợp cDNA ........................... 43

3.2.3.

Phản ứng Real-time PCR và phân tích mức độ biểu hiện

gen OsHKT2;4 ...................................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................50
KẾT LUẬN .............................................................................................. 50
KIẾN NGHỊ .............................................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................51
Phụ lục 1
Phụ lục 2
Phụ lục 3
Phụ lục 4


DANH MụC BảNG
Bảng 1.1. Các protein họ HKT đã đƣợc biết ........................................................ 6
Bảng 1.2. Họ gen HKT ở lúa (Oryza sativa) ........................................................ 9
Bảng 2.1. Các giống lúa trong nghiên cứu ......................................................... 20
Bảng 2.2. Các cặp mồi đặc hiệu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu ...................... 21

Hình 3.7. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 53 và 253 ............39
Hình 3.8. Cấu trúc phân tử của các amino acid đa hình vị trí 342 ......................40
Hình 3.9. Mô hình dự đoán cấu trúc xuyên màng ...............................................41
Hình 3.10. Filter pore của protein OsHKT2;4 ở hai nhóm giống lúa .................42
Hình 3.11. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số ..............................................44
Hình 3.12. Biểu đồ Association curve thể hiện nhiệt độ gắn mồi .......................45
Hình 3.13. Biểu đồ Amplification curve các mẫu gen OsHKT2;4......................46


Hình 3.14. Đồ thị biểu hiện mức độ thay đổi nồng độ mRNA của các mẫu
xử lý mặn so với mẫu đối chứng ở giống Nipponbare (A) và giống
Pokkali (B). ....................................................................................................48


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

HKT

High-affinity Potassium Transporter

DNA

Deoxyribonucleic Acid

RNA

Ribonucleic acid

cDNA


Rv

Reverse


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt

MỞ ĐẦU
Tình hình biến đổi khí hậu trên thế giới đang diễn ra ngày càng phức tạp.
Việt Nam là một trong những nƣớc chịu các tác động tiêu cực nặng nề của biến đổi
khí hậu. Với đƣờng bờ biển dài hơn 3.260 km, cùng với hệ thống sông ngòi chằng
chịt đổ ra biển qua rất nhiều cửa sông, tình hình xâm nhập mặn, một trong những hệ
quả của biến đổi khí hậu đang ảnh hƣởng mạnh đến tình hình sản xuất nông nghiệp
của nƣớc ta. Ở đồng bằng sông Cửu Long tình hình xâm nhập mặn lấn sâu vào đất
liền qua các con sông đến 70 km, và dự báo đến tiếp tục tăng. Hạn hán và đất nhiễm
mặn đã và đang ảnh hƣởng đến trên 30 tỉnh thành của nƣớc ta.
Đất nhiễm mặn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sự sinh trƣởng và phát triển
của cây trồng, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cƣờng peroxide
lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy nhƣ các gốc superoxide và
hydroxyl.
Để cải thiện năng suất trong điều kiện stress mặn ở thực vật nói chung và ở
lúa nói riêng, việc hiểu đƣợc các cơ chế phân tử của các đáp ứng stress mặn là hết
sức quan trọng. Khả năng chịu mặn là tính trạng đƣợc kiểm soát bởi nhiều gen.
Việc tìm hiểu mối liên hệ giữa gen quan tâm và khả năng đáp ứng với stress mặn có
vai trò rất quan trọng trong lai tạo giống chịu mặn.
Có rất nhiều kênh vận chuyển trên màng tế bào thực vật giữ vai trò chính
trong các cơ chế chống chịu mặn. Trong số các kênh vận chuyển Na+ và K+ liên
quan đến tính trạng chống chịu mặn, họ protein HKT (High-affinity potassium
transporter) có vai trò quan trọng trong đáp ứng với stress mặn. OsHKT2;4 thuộc

châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa, hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại
thuộc chi này và 2 loài lúa đã đƣợc thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa
châu Phi (Oryza glaberrima) [70,73].

Hình 1.1. Cây lúa (Oryza sativa) và các bộ phận của cây lúa [73]

QH.2014.T.CH - 60420121
3


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Lúa (Oryza sativa) có nguồn gốc tại khu vực xung quanh vùng Đông Nam
Á; sau đó đƣợc nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và
Japonica. Japonica đƣợc trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới và ôn
đới trong khi Indica đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á. Hai nhóm sinh thái
này đƣợc phân biệt bởi các đặc điểm về hình thái (Hình 1.1.), sinh lý và đặc điểm
sinh thái; Indica có lá bản rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài mảnh,
còn Japonica có lá hẹp và xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung
bình, hạt tròn ngắn.
Lúa (Oryza sativa) có rất nhiều giống thích nghi với nhiều điều kiện môi
trƣờngvà đƣợc gieo trồng làm cây lƣơng thực trên khắp thế giới [70].Với tầm quan
trọng trong cung cấp lƣơng thực toàn cầu, việc nghiên cứu tăng năng suất của cây
lúa đang ngày càng đƣợc chú trọng; nghiên cứu đáp ứng mặn ở cây lúa là một trong
những hƣớng nghiên cứu đầy tiềm năng.

1.2. GIớI THIệU Về Họ PROTEIN VậN CHUYểN ION XUYÊN
MÀNG HKT ở THựC VậT VÀ ở LÚA
Đất nhiễm mặn là một trong những vấn đề thách thức nền nông nghiệp các
quốc gia trên thế giới.Cây trồng bị ảnh hƣởng nghiêm trọng bởi đất nhiễm mặn ở


QH.2014.T.CH - 60420121
5


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Các nghiên cứu về chức năng đã chỉ ra rằng protein vận chuyển HKT có
chức năng vận chuyển các cation hóa trị 1, với sự chọn lọc cation khác nhau giữa
các thành viên cụ thể trong họ gen HKT [51;57]. Một số protein HKT có tính chọn
lọc cao với Na+, trong khi một vài protein HKT có khả năng vận chuyển cả Na+ và
K+; thậm chí, một số protein HKT có thể thay đổi tính chọn lọc của nó tùy thuộc
vào các ion trong môi trƣờng [57].

Bảng 1.1.Các protein họ HKT đã đƣợc nghiên cứu [57]
Protein

Loài

Mã số

AtHKT1;1

Arabidopsis thaliana

Q84TI7.1

BdHKT1

Brachypodium distachyon


AFH37929.1

DfHKT

Diplachne fusca

AEM55592.1

EcHKT1;1

Eucalyptus camaldulensis

AF176035_1

EcHKT1;2

Eucalyptus camaldulensis

AF176036_1

EsHKT1

Eutrema salsugineum

AFJ23835.1

GmHKT1

Glycine max


AF367366_1

McHKT1;2

Mesembryanthemum crystallinum

AAO73474.1

MtHKT1;5

Medicago truncatula

AES77170.1

OgHKT1

Oryza glumipatula

ABD15858.1

QH.2014.T.CH - 60420121
6


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
OrHKT1

Oryza rufipogon


Q93XI5.1

OsHKT2;3

Oryza sativa

Q8L481.1

OsHKT2;4

Oryza sativa

Q8L4K5.1

PaHKT1

Phragmites australis

BAE44384.1

PtHKT1

Populus trichocarpa

EEF03794.1

PutHKT2;1

Puccinellia tenuiflora


EFJ18587.1

SsHKT1

Suaeda salsa

AAS20529.2

TaHKT1;5-D

Triticum aestivum

ABG33949.1

TaHKT2;1

Triticum aestivum

AAA52749

TaHKT1;5-B1

Triticum aestivum

ABG33947.1

TaHKT1;5-B2

Triticum aestivum


AEK27028.1

ScTRK1

Saccharomyces cerevisiae

AAA34728

ScTRK2

Saccharomyces cerevisiae

AAA35172

VpTrkH

Vibrio parahaemolyticus

Q87TN7.1

QH.2014.T.CH - 60420121
7


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
Dựa vào khả năng vận chuyển đặc hiệu ion, họ protein HKT đƣợc chia thành
hai nhóm: nhóm vận chuyển chọn lọc với Na+ (nhóm I) và nhóm đồng vận chuyển
Na+ và K+ (nhóm II) [16;18;57].

Mã số Nucleotide

Nhóm

Mã số protein

OsHKT1;1

AJ491816

Nhóm I

CAD37183

OsHKT1;2

AJ506745

Nhóm I

-

OsHKT1;3

AJ491818

Nhóm I

CAD37185


BAB61791

OsHKT2;3

AJ491820

Nhóm II

CAD37187

OsHKT2;4

AJ491855

Nhóm II

CAD37199

1.2.3. GenOsHKT2;4
GenOsHKT2;4 nằm trên nhiễm sắc thế số 6, dài 1749 bp, trình tự mã hóa
CDS dài 1530 bp mã hóa cho chuỗi 509 amino acid [1;2;74].Gen OsHKT2;4 ít biểu
hiện ở rễ và bông con, chủ yếu đƣợc biểu hiện ở các mô lá, bẹ lá, các chồi phân
sinh. Gen OsHKT2;4 thuộc nhóm II họ gen HKT, quy định các protein đồng vận
chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ khi ion này ở nồng độ cao [31;32].

QH.2014.T.CH - 60420121
9


Luận văn thạc sĩ khoa học

ếch,OsHKT2;4 biểu hiện khiến các tế bào trứng có khả năng thẩm thấu K+ mạnh
mẽ. Tuy nhiên các tế bào trứng biểu hiện OsHKT2;4 thẩm thấu K+ không yêu cầu
sự kích thích ngoại bào bởi Na+, điều này không giống với các protein vận chuyển
HKT lớp II khác. Hơn nữa, OsHKT2;4 thể hiện khả năng thẩm thấu cả Mg2+ và
Ca2+ khi không có sự cạnh tranh của ion K+, nhƣng khả năng thẩm thấu các cation
hóa trị 2 là không đáng kể khi có mặt K+. Điều này chứng tỏ OsHKT2;4 giống với
một kênh vận chuyển K+ chuyên biệt, không phụ thuộc vào ion Na+, khác với các
kênh vận chuyển HKT nhóm II khác, vốn là kênh đồng vận chuyển ion K+/Na+ [32].
Hiện nay chƣa có nghiên cứu về gen OsHKT2;4 thực hiện trên các giống lúa
Việt Nam. Do đó những thông tin về đa hình hay mức độ biểu hiện của gen
OsHKT2;4để phục vụ cho nghiên cứu chọn giống lúa ở Việt Nam còn rất hạn chế.

1.3. MộT Số PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CứU ĐA HÌNH
NUCLEOTIDE
1.3.1. Phƣơng pháp RFLP-PCR
Phƣơng pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length PolymorphismPolymerase Chain Reaction) sử dụng kỹ thuật phát triển trên cơ sở phản ứng PCR
(Polymerase Chain Reaction) nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA.
1.3.1.1.

Phản ứng PCR

PCR là phƣơng pháp đƣợc xây dựng bởi Kary Mullis vào những năm 1980.
Phản ứng đƣợc thực hiện dựa trên khả năng tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với
trình tự khuôn DNA ban đầu của DNA polymerase. Enzyme này chỉ có khả năng
kéo dài mạch nhờ gắn thêm một nucleotide vào nhóm chức3’-OH tự do của

QH.2014.T.CH - 60420121
11



Nguyễn Tiến Đạt
1.3.1.2.

RFLP-PCR

RPLP-PCR là phƣơng pháp phát triển trên cơ sở phản ứng PCR thƣờng đƣợc
sử dụng trong nghiên cứu đa hình di truyền. Phƣơng pháp sử dụng phản ứng PCR
nhằm khuếch đại có chọn lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt
đoạn DNA bằng enzyme cắt giới hạn. Đa hình di truyền của các mẫu DNA đƣợc
phân tích dựa trên sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sản phẩm
cắt bằng enzyme cắt giới hạn [72].Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy
điện di sẽ cho biết sự đa hình đoạn DNA phân tích.

Hình 1.4.Phƣơng pháp RFLP-PCR sử dụng trong nghiên cứu
di truyền phân tử [79]
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là ít tốn kém, thao tác đơn giản, dễ thực hiện,
có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn nucleotide. Tuy nhiên, nhƣợc điểm là
không xác định đƣợc chính xác trình tự gen, trình tự và vị trí đa hình. Mỗi enzyme

QH.2014.T.CH - 60420121
13


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
giới hạn thƣờng chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc hiệu nên sẽ khó có thể phân
tích đƣợc các gencó tính đa hình cao, do đó phƣơng pháp không thích hợp cho phân
tích các gen có mức độ đa hình cao, đòi hỏi sử dụng nhiều enzyme cắt.
1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự
Kỹ thuật giải trình tự là một trong những công cụ mạnh mẽ trong nghiên cứu

khác cũng đƣợc sử dụng để xác định trình tự các đoạn nucleotide trong nghiên cứu
di truyền [27].
Vào năm 1977, hai nhà khoa học ngƣời Mỹ Allan Maxam và Walter Gilbert
đã phát minh ra một phƣơng pháp hóa học có thể xác định đƣợc trình tự các
nucleotide trongchuỗi DNA. Theo phƣơng pháp này, trƣớc hết phân tử DNA đƣợc
đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’, tạo ra những đoạn có thể đƣợc phát
hiện bằng hình ảnh phóng xạ. Sau đó các nucleotide trong phân tử DNA đƣợc đánh
dấu sẽ đƣợc xử lý với các hóa chất khác nhau làm biến đổi và cắt phân tử DNA tại
những vị trí nucleotide khác nhau. Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C,
và C. Kết quả sẽ tạo thành những đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau 1
base [41]. Các đoạn này đƣợc điện di trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng máy
phóng xạ tự ghi, huỳnh quang hay các phản ứng màu nhờ enzyme [4;53].
Tổng hợp các kết quả, ta thu đƣợc trình tự các nucleotide trên mạch đơn
DNA, từ đó ta biết đƣợc trình tự sắp xếp các nucleotide của gen.
Ngày nay, việc giải trình tự đƣợc thực hiện dễ dàng nhờ có sự hỗ trợ của
máy giải trình tự tự động. Máy giải trình tự hoạt động dựa theo nguyên lý của
phƣơng pháp Sanger có cải biến. Trong đó các ddNTP không đƣợc đánh dấu phóng
QH.2014.T.CH - 60420121
15


Luận văn thạc sĩ khoa học
Nguyễn Tiến Đạt
xạ mà đƣợc đánh dấu bằng chất huỳnh quang có màu khác nhau cho mỗi loại
ddNTP. Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính nhƣ: hệ mao quản,
hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu. Các vạch điện di trong mao quản sẽ
đƣợc phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Hệ thống nhận diện tín hiệu màu
sẽ ghi lại và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G [73].

1.4. PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH MứC Độ BIểU HIệN CủA