PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.ĐẶT VẤN ĐỀ:
Nhu cầu trồng chuối từ cây giống
Riêng ở nước ta việc đáp ứng nhu cầu thưởng thức hoa chưa cao do
việc trồng lan chưa được tổ chức một cách khoa học và chưa có đầu tư thích
đáng, yếu tố hạn chế là các giống lan được nhân lên với tốc độ chậm. Vì thế
công tác nhân giống in vitro cây lan lai bằng phương pháp nuôi cấy mô thực
sự cần thiết vì hệ số nhân giống cao, có thể nhân nhanh được hàng loạt các
cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt như các cây bố mẹ đã chọn lọc,
đồng thời sẽ làm giảm tác nhân gây hại cho cây giống và đem lại hiệu quả rất
thiết thực trong việc nâng cao chất lượng giống cây con. Vì thế việc ứng
dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân nhanh các giống lan lai là rất cần thiết và
có thể tìm ra được nhiều màu sắc khác lạ trên các loài hoa lai tạo với nhau.
Hoa lan sinh sản một số lượng lớn, vì hạt lan rất nhỏ giống như hạt bụi có thể
có đến cả triệu hạt trong mỗi quả lan. Trước thực trạng trên chúng tôi đã tiến
hành đề tài “Nghiên cứu nhân giống in vitro cây lan Dendrobium lai qua
phương pháp thụ phấn” được thực hiện nhằm xác định khả năng sinh trưởng
và phát triển của hạt lan lai qua thụ phấn.
2. Mục tiêu của đề tài:
- Tạo ra giống lan Dendrobium lai có khả năng sinh trưởng phát triển
tốt, cho hoa đẹp và lâu tàn.
- Nhân nhanh cây lan lai để có số lượng lớn cây con phục vụ cho vườn
trồng lan.
3. Giới hạn của đề tài:
Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn nên chúng tôi đã thực hiện được
từng giai đoạn trong phòng thí nghiệm. Riêng phần ngoài vườn chúng tôi đã
chuẩn bị trước thí nghiệm thụ phấn.
1
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Một số đặc tính đại cương về họ lan (Orchidaceae)
2.1.1 Đặc điểm sinh học:

2.2 Đặc điểm sinh học của lan Dendrobium
2.2.1 Sự phân bố
Dendrobium là một giống lan có nhiều loài trong họ Orchidaceae,
giống Dendrobium gồm hơn 1600 loài phân bố trên các vùng thuộc Châu Á
nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc Châu. Nếu như các
nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp của mình, thì
các nước Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Dendrobium vô cùng
phong phú. Điều kiên sinh thái cũng rất đa dạng, có nhiều loài chỉ mọc và ra
hoa ở vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài trung gian, cũng có loài thích
nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
 Rễ:
Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp
với nhiều điều kiện sống như:
- Khi sống ở đất thì rễ mập, thân rễ bò dài hay ngắn (Trần hợp, 2000).
- Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên võ thân cây gỗ khác, nên
thân rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm
lại thành các bụi dày. Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, muối khoáng trên vỏ
cây gỗ, hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi một lớp mô hút ẩm dày,
3
bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu
xám bạc. Ngoài ra, nó còn có nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cây khỏi
bị gió cuốn đi. Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung
của cả cơ thể. (Trần hợp, 2000; Nguyễn Công Nghiệp, 2000).
- Ở loài sống hoại thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặc các vòi hút ngắn hút
chất dinh dưỡng từ đám xác thực vật (sau khi được nấm phân hủy). Nhiều
loài lại có hệ rễ đan thẳng thành một búi chằng chịt, nó là nơi thu gom mùn
của vỏ cây để làm nguồn dự trữ chất dinh dưỡng. (Trần hợp, 2000; Nguyễn
Công Nghiệp, 2000).
 Thân :

bình từ 1÷2 tháng. (Trần Hợp, Nguyễn Công Nghiệp, 1998).
 Quả:
Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3-6 đường nứt dọc. Khi
chín quả mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc. Ở
một số loài quả chỉ mở theo 1-2 khía dọc, thậm chí không nứt ra, và hạt chỉ ra
khỏi vỏquả khi vỏ này mục nát.
 Hạt:
Hạt chỉ cấu tạo bởi một phôi chưa phân hoá, trên một máng lưới nhỏ,
xốp chứa đầy không khí. Hạt rất nhiều và nhỏ bé, trọng lượng toàn bộ hạt
trong một quả nặng chỉ bằng 1 phần mười đến một phần ngàn milligam.
(Trần Hợp)
2.2.3 Giá trị kinh tế, tình hình sản xuất và tiêu thụ hoa lan
trong nước và quốc tế.
* Trong nước:
Việt Nam được đánh giá là nước có tiềm năng lớn trong sản xuất
phong lan. Nhưng một thực tế hiện nay là: trong khi nhu cầu hoa lan nội địa
và nhu cầu xuất khẩu đang ở mức cao thì Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ
5
đồng mỗi năm để nhập phong lan từ các nước láng giềng để đáp ứng nhu cầu
nội địa. Trong những tháng đầu năm 2007, mặc dù kim ngạch nhập khẩu lan
cắt cành đã giảm đáng kể so với những tháng trước nhưng vẫn ở mức khá
cao. Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải Quan, kim ngạch nhập khẩu
phong lan cắt cành qua đường chính ngạch của nước ta trong tháng 2/2007 là
26,515 nghìn USD, giảm 20,17% so với tháng 1/2007 nhưng vẫn tăng
51,76% so với tháng 12/2006. Thị trường nhập khẩu lan cắt cành chính của
Việt Nam trong thời gian qua là Thái Lan với gần 100% lượng lan cắt cành.
Trên thực tế, tình hình sản xuất phong lan hiện nay ở Việt Nam còn
chưa tương xứng với tiềm năng. Qua khảo sát, hiện mới chỉ có một số công
ty lớn, trong đó có những công ty nước ngoài trồng phong lan tại Đà Lạt,
Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện tích khoảng 50-60ha/một doanh

cơ sở, với lượng phong lan tiêu thụ trung bình mỗi năm lên tới 1 triệu cây.
Riêng phong lan mỗi năm ở thành phố này cũng đã tiêu thụ trên triệu cây
(nguồn:TTXVN).
Ở Việt Nam lan là họ thực vật đa dạng, phong phú trải dài từ Bắc vào
Nam, từ vùng đồng bằng thấp lên vùng núi cao và khu đảo (Trần Hợp, 2000)
nên lan đã được trồng từ lâu để làm cảnh trong nhà. Nhưng gần đây một số
nhà vườn bước đầu trồng lan dạng cắt cành chủ yếu cung cấp cho thị trường
trong nước nhưng cung vẫn chưa đủ cầu do sản xuất vẫn còn mang tính nông
nghiệp, trong đó nổi cộm là vấn đề giống không đủ chất lượng. Tuy nhiên,
hiện nay bình quân thu nhập lan cắt cành tại thành phố Hồ Chí Minh là 1
tỷ/ha/năm. (www.vnn.vn/kinhte).
Ngày nay, các nhà phong lan học và các nhà vườn trồng lan đang nổ
lực lai chéo các giống lan để tạo ra các giống mới nhằm đáp ứng được nhu
cầu ngày càng đa dạng của thị trường tiêu thụ hoa trong nước và ngoài nước,
mở ra hướng phát triển cho ngành hoa của địa phương.
Giá thành sản phẩm cây lan nuôi cấy mô tương đối thấp và lượng sản
phẩm tạo ra tương đối đồng loạt, độ đồng đều cao. Nếu tính giá thành một
chậu lan cấy mô (tính giai đoạn đang ươm ngoài nhà lưới khoảng 12.000 –
20.000đ/chậu lan, mỗi vò có 01 cây giống và chiều cao cây khoảng 10-
20cm). Trong đó giá thành sản xuất 01 cây lan con giai đoạn trong phòng thí
7
nghiệm có chiều cao trung bình 6 - 8cm, cây có 03 lá trở lên thì giá thành
khoảng 1.500đ/cây, còn một số nôi cung ứng và nhân giống gia công khoảng
2.000đ/cây. Qua chiết tính trên cho thấy công nghệ sản xuất và nhan giống
lan nuôi cấy mô là rất cần thiết, và có thể áp dụng phương pháp này nhằm tạo
ra nhiều giống lan mới, giá thành rẽ để đáp ứng như cầu trong tỉnh nói riêng,
cả trong nước và quốc tế nói chung.
Việt Nam là nước nằm gọn trong vành đai nhiệt đới Bắc bán cầu, chiều
dài theo hướng Bắc-Nam là 1.650km cho nên tạo được sự đa dạng về các
vùng khí hậu, từ đó dẫn đến đa dạng các loài hoa lan. Phát triển Nuôi trồng

Văn Huân và Văn Tích Lượm, 2002).
Ở châu Á, năm 1987 Hồng Kông đứng đầu về xuất khẩu mặt hàng này,
nhưng thực tế Hồng Kông lại nhập hoa của các nước khác chuyên xuất nhiều
hơn là tự sản xuất để xuất khẩu. Thái lan và Nhật về kim ngạch xuất khẩu
tính đến năm 1987 đứng vào hàng thứ 8 của Châu Á. Nhưng hai nước này
đang phát triển mạnh sản xuất hoa, lan, cây cảnh. Tại Nhật, năm 1990 thu
nhập mặt hàng này gần 9 tỷ USD, dự kiến năm 1995 sẽ đạt 15 tỹ USD. Thái
Lan là nơi nổi tiếng sản xuất hoa lan, năm 1987 kimh ngạch xuất khẩu là
108,9 triệu USD, riêng hoa lan là 21 triệu USD, năm 1990 lên 26 triệu USD,
(Phan Thúc Huân).
Riêng Thái Lan đã xuất khẩu lên đến 610 loại hoa lan khác nhau
trong từng năm một. Nhiều giống hoa lan được nhân giống từ lan rừng cho
thấy Thái Lan là một trung tâm phân phối và sưu tập hoa lan của vùng Đông
Nam Á. Sự phát triển công nghệ sinh học nông nghiệp đạt được nhiều kết quả
trong sản xuất nông nghiệp đã đưa Thái Lan trở thành quốc gia hàng đầu thế
giới sản xuất về hoa đặc biệt là hoa lan. Thái Lan là quốc gia xuất khẩu đứng
thứ tư trên thế giới về hoa cắt cành trong năm 1993-1994.
Đối với các nước đang phát triển, kim ngạch xuất khẩu và kim ngạch
nhập khẩu hoa, lan, cây cảnh chỉ chiếm khoảng 25-30% tổng kim ngạch xuất
9
nhập khẩu của toàn thế giới. Tuy nhiên, một số nước đang phát triển đã có cơ
sở sản xuất và đã có bạn hàng tiêu thụ vững vàng như Thái land, Singapore,
Colombia, Kenya, Nam Phi. Inđônêxia, Côsta Rica. Đặc biệt Colombia trong
những năm gần đây đã phát triển ngành hoa lan, cây cảnh xuất khẩu một cách
nhảy vọt và đã đứng hàng thứ hai trên thế giới, chỉ sau Hà Lan.
Xếp
hạng
1992 1993 1994
Nước Triệu
USD

Ý
Khác
1,456.24
415.61
115.26
65.37
60.57
48.39
318.94
Hà Lan
Colombia
Israel
Thailand
Kenya
Ecuador
Khác
1,586.40
431.71
134.15
68.20
67.57
52.88
400.95
Tổng 3,323.82 Tổng 2,480.37 Tổng 2,741.86
(Nguồn: International Floriculture Trade Statistics 1995)
Năm 1994 khối lượng hoa cắt cành của Thái Lan xuất khẩu đến Nhật
Bản, Ý, Mỹ, Đức, Đài Loan và Hà Lan là 11.897 tấn. Bên cạnh hoa lan, Thái
Lan cũng xuất khẩu các loài hoa cắt cành khác.
2.3 Phương pháp vi nhân giống
2.3.1 Mục đích vi nhân giống

- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo
- Nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh.
- Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp
(nguồn dinh dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con
quanh năm.
- Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro làm cây mẹ cho các bước
nhân giống tiếp theo.
11
2.4. Kỹ thuật nhân giống phong lan
Để tạo cây giống lan lai phục vụ cho công tác nuôi trồng có thể nhân
giống bằng hai cách: nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính.
2.4.1 Nhân giống hữu tính
Trong nhiên nhiên sự thụ phấn của lan do côn trùng thực hiện, cấu trúc
của hoa lan hoàn toàn thích ứng với sự thụ phấn đó. Hoa lan là một loại hoa
lưỡng tính, cấu trúc của hoa và sự chín của các cơ quan sinh dục trong hoa
không đều nên sự giao phấn nhờ sâu bọ có tính cách bắt buộc. Sự thụ phấn
của hoa trong môi trường tự nhiên được côn trùng thực hiện trên cơ sở của
mùi thơm và ánh sáng hấp dẫn và những cấu tạo của hoa là những dấu hiệu
chỉ dẫn cho côn trùng trong quá trình thực hiện.
Ở vườn nuôi trồng lan để đảm bảo kết quả của sự giao phấn cao và tạo
ra các giống lan lai theo ý muốn, con người phải tiến hành thực hiện. Sự thụ
phấn của lan có thể cùng cây, có thể khác cây. Đối với lan ở các vườn nuôi
trồng, việc thụ phấn do con người thực hiện đuợc tiến hành như sau:
Dùng kim hay một cái kẹp nhỏ để làm dụng cụ thụ phấn.
Lấy và loại bỏ hai khối phấn bọc nhụy của cây lan được chọn làm cây
mẹ (cây cho phấn là cây cha, cây được thụ phấn là cây mẹ).
Lấy hai khối phấn của hoa cây được chọn làm cây cha, khối phấn hoa
lan thường có cấu tạo gót dính hay sáp cho nên khi thụ phấn cần dùng một
cái kim hay một cái kẹp nhỏ làm dụng cụ để lấy khối phấn ra khỏi hoa cây
cha cho dễ.

sản xuất một số lượng cây con gần như không tưởng khoảng 4 triệu cây/năm
(Nguyễn Công Nghiệp, 1998)
Bảng 2.1. Một số kết quả đạt được trong nhân giống một số loài
Dendrobium bằng phương pháp nuôi cấy mô (theo George, 1993)
13
Tên loài Mẫu cấy Kết quả Tác giả
Dendrobium
bigibbum Lindl
Các đoạn thân Tái sinh các chồi
bên
Kukylezanka and
Wojciechowska
(1983)
Dendrobium
laciniosum
Đỉnh sinh trưởng
của chồi ngọn và
chồi bên
Tạo sự khởi đầu
và nhân nhanh
tiền củ
(protocorm)
Lim-Ho (1982)
Dendrobium
superbiens
var.superba
Đỉnh sinh trưởng
chồi ngọn
Tạo protocorm và
nhân nhanh

chồi bên
Ball and Arditti
(1976)
2.5 Các yếu tố của môi trường cấy ảnh hưởng đến các giai đoạn
trong nuôi cấy in vitro.
Trong nuôi cấy in vitro sự tăng trưởng của cây phần lớn được xác định
bởi các thành phần của môi trường cấy. Thành phần chính của hầu hết môi
trường nuôi cấy mô là các thành phần khoáng, đường được xem là nguồn
cung cấp carbon và nước. Những thành phần khác có thể được bổ sung bao
gồm các chất hữu cơ, các chất điều hoà sinh trưởng, chất làm đặc môi trường.
14
Mặc dù các thành phần khác nhau trong môi trường thay đổi theo các giai
đoạn cấy và loài cây, môi trường MS (Murashige and Skoog) hầu hết được sử
dụng phổ biến nhất.
2.5.1. Khoáng đa vi lượng
Các khoáng cung cấp cho cây trong nuôi cấy mô đều ở dạng các muối
vô cơ, cây lan có thể thích nghi phổ rộng các hổn hợp muối vô cơ.
Đạm là thành phần của acid nucleic đóng vai trò quan trọng trong trao
đổi chất, là thành phần chủ yếu của chất nguyên sinh của tế bào (Moxolov,
1987), do đó có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây.
Đạm được sử dụng trong nuôi cấy mô thường ở dạng ammonium (NH
4
+
) và
nitrate (NO
3
-
).
Lân tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein,
acid nucleic và tham gia vào cấu trúc của màng. Lân thường được sử dụng ở

quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô. Các lĩnh vực vi nhân giống cho
rằng sự hiện diện của đường trong môi trường cấy là quan trọng vừa cho sự
phát triển rễ và nhân chồi, vừa làm tăng chiều cao của cây con. Nồng độ
sucrose (20g/l và 30g/l) thường được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực
nuôi cấy mô lan. Sucrose thông thường được thêm vào môi trường để đẩy
mạnh sự tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. Theo
(Debergh,1991), sự vắng mặt của đường làm giảm những vấn đề về nhiễm
môi trường cấy và cho phép các cây tăng trưởng một cách tự dưỡng trong
điều kiện in vitro khi nồng độ CO
2
và mật độ ánh sáng tăng lên.
2.5.6 Các chất hữu cơ
Nước dừa (CW-coconut water) được dùng thông dụng trong nuôi cấy
mô. Nước dừa cung cấp bổ sung cho môi trường các loại đường, amino acid,
chất sinh trưởng và các chất trao đổi khác. Nước dừa chỉ kích thích những tế
bào hay mầm còn non chưa trưởng thành và sự phát triển phôi, nước dừa
thường dùng ở nồng độ 15%. Từ việc sử dụng nước dừa, nhiều mô thực vật
được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng
kích thích sự phát triển cây như chà là, chuối, mầm lúa mì... nhưng thông
thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng
nguồn gốc. (Trần Văn Minh - Viện Sinh học Nhiệt Đới)
2.5.7 Than hoạt tính
Than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó có tác
dụng hấp thu các chất hữu cơ ngoại trừ đường. Sự kết hợp của 0.3% than
hoạt tính trong môi trường đã được tìm thấy là có lợi cho sự tăng trưởng cả
chồi. Ngoài ra việc bổ sung than hoạt tính vào môi trường còn góp phần làm
tăng nhanh protocorm và sự phát triển của cây con. (Nguyễn Đức Lương và
16