Nội dung
I. Mở đầu
II. Cơ sở khoa học của việc chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật
chuyển gen sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi
1. Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT)
1.1: Khái niệm
1.2: Lịch sử phát hiện chuyển gen ngang
2. Cơ chế của HGT
2.1: Biến nạp
2.2: Tải nạp
2.3: Tiếp hợp
3. Bằng chứng chứng minh HGT xảy ra trong tự nhiên
III. Khả năng chuyển đoạn DNA tái tổ hợp ở sinh vật chuyển gen vào hệ
vi sinh của người và đông vật
1. DNA tái tổ hợp
2. Nguy cơ của việc chuyển thành công đoạn DNA tái tổ hợp từ GMO
sang hệ vi sinh ở người và động vật
3. Các rào cản của quá trình chuyển đoạn DNA tái tổ hợp vào hệ vi sinh
vật ở người và động vật
4. Phương pháp để phát hiện đọan DNA tái tổ hợp đã được chuyển nạp
thành công vào vi sinh vật
5. Ví dụ kiểm tra về khả năng chuyển gene ngang
IV. Kết luận
I. Mở đầu
Như chúng ta đã biết, dân số thế giới đang ngày một tăng, diện tích
đất lại ngày một giảm, bệnh tật thì ngày một nhiều và phong phú hơn…
Bởi vậy, con người đang phải ngày ngày đối mặt với rất nhiều vấn đề


cấp bách hiện nay như : an ninh lương thực-thực phẩm, bệnh tật,
nguyên-nhiên liệu…

chuyển gen sang hệ vi sinh vật ở người và vật nuôi
Đây chính là nguyên nhân bắt nguồn cho việc nghi ngờ DNA tái tổ
hợp có khả năng được chuyển từ GMO sang hệ vi sinh vật ở người và
động vật
1. Hiện tượng chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT)
1.1: Khái niệm
Chuyển gen ngang (horizontal gene transfer-HGT) hay trao đổi
gen theo hàng ngang là sự chuyển các gen giữa các sinh vật không phải
họ hàng hoặc không thông qua giao phối. Trao đổi gen hàng ngang khác
với trao đổi gen hàng dọc (vertical gene transfer), tức là sự tiếp nhận các
gen từ thế hệ cha mẹ (hay gọi là di truyền).

Chuyển gen
ngang rất phổ
biến ở các
loài vi sinh
vật

HGT đã được chứng minh là một yếu tố quan trọng trong sự phát
triển của nhiều sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn. Chúng có khả năng tiếp
nhận gen từ các sinh vật khác để thích nghi với môi trường thay đổi


nhanh chóng xung quanh. Sự thay đổi nhanh chóng của vi khuẩn tạo cho
chúng một khả năng gây ra bệnh mới, hoặc tái phát bệnh cũ.
1.2. Lịch sử phát hiện chuyển gene ngang
Chuyển gen ngang đã được mô tả đầu tiên ở Seattle vào năm 1951:
sự chuyển giao một gen của virus vào Corynebacterium diphtheriae đã
tạo ra mối nguy hiểm từ một chủng không độc hại.
Chuyển gen giữa vi khuẩn đã được mô tả lần đầu tiên ở Nhật Bản

bị phân hủy. Kết quả thu được là vi khuẩn thể hiện một hoặc vài tính
trạng mới, tính trạng này ổn định và có khả năng di truyền.

Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dưỡng hay nồng độ oxy
giảm đến mức tối thiểu ảnh hưởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế
bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng như đặc tính sinh lý sinh hóa, màng


tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng
lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và
nhận được sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào.
Hệ thống vận chuyển này được hình thành trên cơ sở enzym gây
biến tính một số protein màng.
+ Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein
ComG của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một
protein màng, từ đó chúng được hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với
ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận
với ComEA.
+ ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào
+ ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó
DNA đi vào tế bào
+ ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với
ComEA và ComEC để đưa sợi DNA mạch đơn vào tế bào
Trong quá trình chuyển nạp, sợi DNA mạch đôi bám vào đầu
Carboxyl của ComEA và được phân ra thành những đoạn dưới tác
động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu
cuối mới được cắt ra này được đưa tới ComEC và ComEA để chúng vận
chuyển vào tế bào.
Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn
kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng như các yếu tố

Khi ly giải tế bào, những virion bị đóng gói nhầm có thể gắn vào
một vi khuẩn khác và bơm phần DNA được đóng gói vào tế bào, và như
vậy vô tình đã chuyển DNA vi khuẩn từ tế bào này sang tế bào khác.
c) Tiếp hợp
Tiếp hợp chuyển giao DNA qua trung gian plasmid hoặc
transposon , đòi hỏi sự tiếp xúc giữa tế bào với tế bào. Tuy nhiên, tiếp
hợp cũng có thể xảy ra giữa các vi khuẩn có quan hệ xa hay thậm chí
giữa vi khuẩn với các tế bào Eukaryotic, phương pháp này có thể chuyển
các đoạn DNA dài.
Tuy nhiên, các trình tự di động mà hỗ trợ cho việc chuyển gen từ
thực vật bậc cao sang vi khuẩn lại chưa được biết đến và những
transposons có chức năng trong cả thực vật và vi sinh vật cũng chưa
được xác định nên khả năng chuyển gen ngang từ thực vật sang vi sinh
vật được xem là rất thấp.


Trong tế bào cho, ADN của plasmid được mở bung ở điểm
mầm oriV, sau đó 1 sợi ADN (sợi dương) được chuyển giao qua cầu tiếp
hợp sang tế bào nhận theo chiều kim đồng hồ (sợi 5’ luồn qua trước).
Cùng đúng với thời điểm chuyển giao sợi dương, ngay trong vi
khuẩn cho, sợi ADN còn lại (sợi âm) chịu trách nhiệm làm khuôn để
tổng hợp ngay lập tức sợi bổ sung cho nó (tổng hợp sợi dương) để tạo
nên vòng plasmid mới. Trong tế bào nhận, sợi ADN vừa được chuyển
sang (sợi dương), cũng ngay lập tức làm khuôn để tổng hợp sợi bổ sung
(tổng hợp sợi âm) để hình thành vòng ADN của plasmid mới cho tế bào
nhận.
ADN được tổng hợp theo cơ chế bổ sung ở cả 2 tế bào theo chiều
trượt 5´-->3´.
3. Bằng chứng chứng minh HGT xảy ra trong tự nhiên
Trong thiên nhiên, việc hoán chuyển gen giữa các sinh vật cùng

vào hệ vi sinh của người và đông vật
Vậy, DNA tái tổ hợp là gì? Nếu nó được chuyển vào hệ vi sinh của
người và động vật thì điều gì sẽ xảy ra? Có rào cản nào ngăn cản quá
trình này hay không?
1. DNA tái tổ hợp


DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tạo thành từ hai hay nhiều
trình tự DNA của các loài sinh vật khác nhau.
Trong kỹ thuật di truyền, DNA tái tổ hợp thường được tạo thành từ
việc gắn những đoạn DNA có nguồn gốc khác nhau vào trong vectơ tách
dòng.
Về mặt lý thuyết, kỹ thuật DNA tái tổ hợp cho phép đưa bất kỳ
một gen nào đó từ một sinh vật này vào một sinh vật khác. Vấn đề quan
trọng là làm sao để gen ngoại lai có thể biểu hiện trong cơ thể vật chủ.
Để biểu hiện được gen ngoại lai, DNA tái tổ hợp phải có đầy đủ
các cấu trúc cần thiết sau:
+ Gen chỉ thị: để xem gen đã được chuyển vào chưa
+ Promoter: kiểm soát quá trình phiên mã, cho phép sản xuất một
lượng lớn mRNA từ các gen được tạo dòng
+ Polylinker (vị trí cắt của enzyme giới hạn): đưa gen ngoại lai
vào trong theo một hướng chính xác với promoter ( nếu đoạn gên ngoại
lai không nằm giữa trình tự promoter và trình tự kết thúc thì gen sẽ
không được phiên mã)
2. Nguy cơ của việc chuyển thành công đoạn DNA tái tổ hợp từ
GMO sang hệ vi sinh ở người và động vật
Về lý thuyết, nếu quá trình này thành công thì sẽ gây ra rất nhiều
hậu quả:
Thứ 1: Nếu gen chỉ thị là các gen kháng kháng sinh => tạo ra các
loại vi sinh vật kháng kháng sinh

chế độ ăn uống của mình (Doerfler,2000). Các gene chuyển có trong 1
cây CNSH lại không phải là một loại vật liệu mới đối với hệ thống tiêu
hóa cho nên chúng cũng bị tiêu hóa như bình thường.
Các test invitro về khả năng tiêu hóa được tiến hành trên protein
CP4 EPSPS cho thấy enzyme này bị phân hủy nhanh chóng trong các
phản ứng kiểm tra trong hệ tiêu hóa (Harrison và cs.,1996) (30 giây ở
dịch ruột và dịch tiêu hóa của người).


Trong điều kiện invitro, DNA plasmid mang gen kháng ampicilin
được xử lý với nước bọt của cừu có khả năng chuyển vào E.coli sau 24h.
Tuy nhiên, DNA nhiễm sắc thể của ngô bị phân hủy chỉ trong vòng 1
phút khi ủ với dịch dạ cỏ.
Tất cả những điều này cho thấy, DNA tái tổ hợp chưa kịp chuyển
ngang sang hệ vi sinh vật đã bị tiêu hóa hết.
* Rào cản thứ 2: Các vi khuẩn nhận chỉ có khả năng mang và gắn
đoạn DNA lạ dạng mạch thẳng (đòi hỏi sự tương đồng cao về trình tự)
hoặc hình thành vùng tái bản độc lập
Trong trường hợp, những đoạn DNA may mắn vượt qua rào cản
thứ nhất, thì nó sẽ ngay lập tức gặp phải rào cản thứ 2. Trong cơ thể mỗi
sinh vật đều có cơ chế tự đào thải, cho nên mức độ sai khác càng cao thì
càng làm hạn chế khả năng chuyển gen ngang thành công.
Tuy nhiên, những sự tái tổ hợp bất thường vẫn xảy ra nhưng với
tần số thấp hơn (Ehrlich và cs., 1993), đặc biệt là ở những vi khuẩn bị
đột biến hoặc thiếu sót do tác động của môi trường. Những vi khuẩn đột
biến này thường chứa các đột biến ở gen đầu mút, liên quan tới sự sửa
chữa của methyl-directed DNA, sự sửa chữa sai dẫn tới khả năng tái tổ
hợp với DNA các loài khác tăng lên (Rayssiguier và cs., 1989, Matic và
cs.,v1995, 1997, Vulic và cs., 1997, Taddei và cs., 1997). Khi đó, chúng
sẽ phải vượt qua rào cản thứ 3.

loại chuyển gen mà sử dụng gen kháng kháng sinh để chọn lọc)
Chiết tách DNA, PCR với mồi đặc hiệu để phát hiện ra đoạn DNA
tái tổ hợp
Lai southerm blot ( lại DNA của tế bào với mẫu dò DNA) để kiểm
tra sự có mặt của gen chuyển trong tế bào
Lai western blot ( lai giữa protein với protein hay kháng nguyên
với kháng thể) để phát hiện ra loại protein mà DNA tái tổ hợp mã hóa
5. Ví dụ kiểm tra về khả năng chuyển gene ngang
Dryzga và cs.,(2007) đã đánh giá an toàn của giống bông chuyển
gene kháng côn trùng có tên Widesstrike chứa 2 độc tố BT là
Cry1F/Cry1Ac, sử dụng đối chứng là các giống ngô truyền thống


PHY72, PHY78 và 98M-2983-một dòng đối chứng không chuyển gene
PSC355.
Thức ăn được chuẩn bị cho chuột nghiên cứu trog 90 ngày với
lượng hạt bông chuyển gene chiếm 10% trong khẩu phần, tương đương
7,235mg/kg/ngày đối với chuột đực và 7,935mg/kg/ngày đối với chuột
cái.
Động vật được đánh giá thông qua các thông số về trọng lượng cơ
thể và tiêu thụ thức ăn chăn nuôi. Kiểm tra chức năng, hoạt động động
cơ và khám mắt trước khi tiếp xúc và trước khi kết thúc thí nghiệm. Tiêu
chuẩn huyết học, hóa học lâm sàng, thời gian prothrombin và các thông
số phân tích nước tiểu cũng được đánh giá. Tất cả các con chuột được
khám nghiệm xác chết và các cơ quan mục tiêu được kiểm tra.
Sau 90 ngày kể từ ngày cho ăn, không có tác dụng phụ nào được
phát hiện trong quá trình tiến hành quan sát lâm sàng hoặc trong bất kỳ
các thông số đo được trong nghiên cứu này.
Nghiên cứu này đã chứng minh rằng chế độ ăn với 10% hạt bông
chuyển gene không gây tác động có hại nào, bao gồm cả khả năng