MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, việc tìm kiếm, phát hiện và nghiên cứu các hợp chất thiên
nhiên có hoạt tính sinh học cao từ nguồn tài nguyên thực vật phong phú
của nước ta là mối quan tâm chung của các ngành Hoá, Sinh, Y, Dược.
Việc khai thác, sử dụng nguồn tài nguyên này trong các ngành công nghiệp
thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm có hiệu quả kinh tế cao.
Trong vô số loài thực vật ở Việt Nam, cây me thuộc chi
Tamarindus của họ Đậu (Fabaceae) có giá trị sử dụng cao, các bộ phận của
cây me đều được dùng trong cuộc sống quả me mà thành phần hóa học chủ
yếu là polysaccharide được sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp thực
phẩm và dược phẩm.
Cho đến thời điểm này tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu
về mặt hóa học của các thành phần có trong quả me, do vậy quả me là một
đối tượng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học và thực tế.
Trên những cơ sở phân tích trên, tác giả và tập thể hướng dẫn lựa
chọn đề tài nghiên cứu của luận án là: "Nghiên cứu thành phần hóa học
và khảo sát hoạt tính sinh học của polysaccharide từ hạt me
(Tamarindus indica L.) Việt Nam".
2. Mục tiêu của luận án: Xác định thành phần hóa học, cấu trúc và đánh
giá hoạt tính sinh học của Tamarind Seed Polysaccharide (TSP) có trong
quả me. Điều chế được các dẫn xuất sulfate hóa và acetyl hóa có hoạt tính
sinh học cao hơn TSP tự nhiên từ đó góp phần sáng tỏ ảnh hưởng của mức
độ sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học.
3. Phương pháp nghiên cứu: Luận án được thực hiện trên cơ sở các kết
quả nghiên cứu thực nghiệm và hệ thống các phương pháp nghiên cứu đã
được công bố. Cụ thể, phương pháp sắc ký gel (GPC), phổ hồng ngoại, phổ
khối, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, tán xạ ánh sáng tĩnh và động, tán xạ tia
X góc nhỏ, kính hiển vi điện tử quét, phương pháp thử hoạt tính sinh học…
4. Ý nghĩa khoa học của luận án: Lần đầu tiên cấu trúc của TSP từ quả
me được nghiên cứu hoàn chỉnh bao gồm cấu trúc hóa học, cấu trúc không

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
Phần này tổng hợp các nghiên cứu trên thế giới và trong nước về các
nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là polysaccharide phân lập từ quả
me (Tamarind Seed Polysaccharide TSP). Quả me được thu hái tại huyện
Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng 10 năm 2013 và tại huyện Cần Giuộc,
Long An vào tháng 11 năm 2014.
Cây me có tên khoa học là Tamarindus indica.L. thuộc họ đậu chi
Tamarindus, loài T.indica

2


2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp chiết tách
Chiết tách polysaccharide từ quả me bằng các phương pháp chiết tách
thông thường, kết hợp các phương pháp tinh chế, làm sạch đồng thời tham
khảo các công bố trên thế giới để đưa ra một phương pháp chiết tách tối ưu,
phù hợp với đối tượng và mục đích nghiên cứu của luận án.
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc
2.2.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
Gel Permeation Chromatography (GPC) là một kỹ thuật sắc ký để
phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên
cột. GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm
trọng lượng trung bình Mw, trọng lượng phân tử trung bình số Mn, và đặc
trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố trọng lượng phân tử của
nó.
2.2.2.2 Phương pháp phổ IR.

nhỏ (SAXS)
Hiện nay các phương pháp tán xạ (LS) là rất hữu hiệu để nghiên cứu
cấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung dịch. Phương pháp
này dựa vào đường cong tán xạ ta có thể biết được các thông số cấu trúc
như trọng lượng, kích thước và hình dạng của phân tử chất tan.
2.2.3 Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.2.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào.
Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành để đánh giá khả năng ức chế
sự phát triển tế bào ung thư và không ung thư in vitro của các mẫu chiết,
cũng như để kiểm tra độc tính của thuốc với các dòng tế bào ung thư và
không ung thư. Phép thử này dựa vào khả năng nhuộm màu của SRB
(Sulforhodamine B) bám vào protein của tế bào đã được cố định bởi acid
trichloroaxetic (TCA). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế
bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi
thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB).
Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein,
do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD
càng lớn.
2.2.3.2 Hoạt tính chống oxy hóa
Những phép thử đo hoạt tính chống oxy hóa có liên quan đến chuyển
nguyên tử hydrogen hay chuyển e độc thân. Cơ chế hai phép thử này xảy ra
đồng thời phụ thuộc vào cấu trúc của chất chống oxy hóa và pH. Phép thử
theo cơ chế chuyển nguyên tử hydrogen đựa theo việc đo khả năng của
chất chống oxy hóa để quét những gốc tự do bởi sự cho hydrogen.
Trong phép thử dựa trên cơ chế chuyển e độc thân, phản ứng được xác
định bởi sự khử proton và khả năng ion hóa của nhóm chức (IP), phép thử
này phụ thuộc vào pH, pH càng cao thì giá trị IP càng thấp và tăng sự khử
proton. Những hợp chất có IP  45kcal/mol cơ chế phản ứng thường là
chuyển e độc thân. Phản ứng chuyển e độc thân thường chậm và chịu ảnh
hưởng âm tính bởi những hợp phần vết, chất nhiễu đặc biệt là kim loại

bằng sự chênh lệch về khối lượng trước và sau ly giải cục máu đông.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1. Thu hái, định danh và xử lý mẫu quả me
3.1.1 Thu hái và định danh
Quả me được thu hái tại vùng Thủy Nguyên, Hải Phòng vào tháng 5
năm 2013 và tại Cần Giuộc –Long An vào tháng 12 năm 2014. Cây me (có
tên khoa học là Tamarindus indica L. trong chi Tamarindus thuộc họ Đậu
(Fabaceae)) được giám định bởi TS. Bạch Thị Như Quỳnh - Khoa Kỹ thuật
Y học - Trường Đại học Y Dược Hải Phòng. Tiêu bản số 56891 và số
56891A của mẫu quả me được lưu giữ tại Khoa Kỹ thuật Y học - Trường
Đại học Y Dược Hải phòng.
5


3.1.2 Xử lý mẫu
Quả me sau khi thu hái được rửa sạch chất bẩn thô dưới vòi nước, rồi
sấy tại 60-700C trong 48h, sau đó tách bỏ vỏ, tách riêng phần hạt me và thịt
me. Thịt và hạt me được sấy lại tại 600C đến khối lượng không đổi, hạt me
được tách bỏ vỏ cứng sau đó được nghiền nhỏ và giữ trong bình hút ẩm.
Thịt và hạt me được dùng để chiết tách TSP.
3.2. Chiết tách và tinh chế Tamarind Seed Polysaccharide (TSP)
từ thịt và hạt me
3.2.1. Xác định thành phần hóa học của thịt và hạt me
Xác định hàm ẩm, protein, chất béo, lượng tro, cacbonhydarate và sợi
thô được tiến hành theo phương pháp AOAC thực hiện 03 lần và lấy kết
quả trung bình.
Hàm ẩm được xác định bằng phương pháp khối lượng.
Chất béo thô được phân tích bằng cách chiết mẫu bột hạt me khô với
ether dầu hỏa trong bình chiết Soxhlet.
Lượng protein thô có trong mẫu được xác định bằng phương pháp

được các mẫu TSPS có mức độ sulfate hóa (DS) khác nhau
Bảng 3.1. Ký hiệu mẫu và tỉ lệ số mol các chất tạo tác nhân sulfate hóa
STT

Mẫu

nNaHSO3

nNaNO2

1

TSPS1

0.050

0.086

2

TSPS2

0.050

0.059

3

TSPS3



Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp TSPS

Xác định mức độ sulfate hóa: Xác định hàm lượng sulfate của TSP
bằng phương pháp phân tích khối lượng.
3.3.2 Acetyl hóa
Tamarind seed polysacchride acetyl hóa (TSPA) được tổng hợp theo
phương pháp của Xiao-xiao Liu và cộng sự theo sơ đồ Hình 3.3

Hình 3.3. Sơ đồ tổng hợp TSPA

Tiến hành tổng hợp TSPA có mức độ acety hóa (DA) khác nhau bằng
các cho TSP tác dụng với tác nhân acetyl có nồng độ khác nhau trên Bảng
3.2.
8


Bảng 3.2. Ký hiệu mẫu và nồng độ tác nhân acetyl hóa
STT
1

Mẫu
TSPA1

n(CH3CO)2O
0.011

2
3
4

3.4.3 Phổ IR
Phổ hồng ngoại FT-IR được ghi trên máy FT-IR Affinity-1S
Shimadzu tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại
học Quốc gia Hà Nội, trong vùng số sóng 4000-400 cm-1. Mẫu được ép
viên với KBr.
3.4.4. Phổ NMR
Phổ NMR được ghi trên máy Bruker Avance III 500MHz tại Trung
tâm các phương pháp phổ ứng dụng -Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu được pha trong dung môi D2O +1%
CD3COOD với nồng độ 3 mg/ml. DSS được sử dụng làm chất nội chuẩn,
đo ở nhiệt độ 70oC với kỹ thuật đo khử tín hiệu nước.

9


3.4.5. Phổ MS
Để tiến hành đo phổ khối, mẫu TSP được thủy phân trong TFA 2M
tại nhiệt độ 800C trong thời gian 4h để tạo các oligosaccharide.
Phổ ESI-MS được ghi trên thiết bị LTQ Orbitrap XLTM của hãng
Thermo SCIENTIFIC tại Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, với nguồn ion hóa phun mù điện tử và
kiểu ion hóa dương.
3.4.6. Phương pháp SEM
Ảnh SEM được thực hiện trên hệ thiết bị Nova nano SEM 450 tại
Khoa Vật lý - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà
Nội.
3.4.7. Phương pháp LS
Thí nghiệm được tiến hành đo tại mỗi 5° trong dải đo từ 30-150
trên thiết bị SLS-6500 & EDLS-9000 tại Đại học Điện- Truyền thông
Osaka, Nhật Bản.

bào theo công thức sau:
% ức chế tế bào = 100% - % sống sót
3.5.2 Hoạt tính chống oxy hóa
Hoạt tính chống oxy hóa được tiến hành tại Viện Nghiên cứu và Ứng
dụng Công nghệ Nha Trang và Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Xác định khả năng khử sắt: tiến hành theo phương pháp Zhu và cộng
sự [122]. Lấy 0,2 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm hỗn hợp gồm 0,2 ml
đệm phosphate pH= 7,2 và 0,2 mL dung dịch kali ferricyanide 1%. Hỗn
hợp được giữ ở 500C trong 20 phút. Sau đó, thêm tiếp 0,2mL CCl3COOH
10%. Sau cùng, lấy 0,125 ml hỗn hợp trên và 0,125ml nước cất được đặt
vào giếng 96 lỗ cùng với 0,02 mL FeCl3. Độ hấp thụ của hỗn hợp tăng tại
bước sóng 655 nm chỉ ra khả năng khử của hỗn hợp.
Xác định hoạt tính oxy hóa tổng số theo phương pháp Huimin và cộng
sự [42]. Lấy 0,3 ml mẫu có nồng độ 6 mg/ml thêm vào 3 ml chất phản ứng
bao gồm (0,6 M acid sulfuric, 28 mM natri phosphate và 4 mM amoni
molybdate). Để phản ứng tại 950C trong 3 giờ, để nguội đo tại bước sóng
695 nm. Hoạt tính oxy hóa tổng số tính theo axid ascorbic.
Xác định hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào[26]:
Tách não chuột (chuột thuần chủng dòng BALB/c) và nghiền đồng thể
trong dung dịch đệm phosphate (pH 7,4), theo tỉ lệ 1:10 ở nhiệt độ 0-50C.
Phản ứng bao gồm 1ml dịch đồng thể thêm vào 0.2ml các nồng độ mẫu thử
và 0.8ml đệm phosphate. Ủ ở 370C/15 phút (tự oxy hóa) hoặc ủ ở 370C
trong 5 phút với hệ Fenton (FeSO4 0,1 mM: H2O2 15 mM theo tỉ lệ 1:1).
Kết thúc phản ứng bằng 1ml dung dịch acid tricloroacetic 10%. Li tâm lấy
dịch trong. Bổ sung 1ml acid thiobarbituric 0.8% ở 1000C trong 15 phút.
Cuối cùng làm lạnh các ống nghiệm và tiến hành đo cường độ màu bằng
máy quang phổ ELISA ở bước sóng 532 nm. Chất đối chứng là malonyl
dialdehyd (Sigma, USA). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
3.5.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

hình thành). Tiến hành cân các ống eppendof có cục máu đông trước ly giải
để xác định trọng lượng cục máu đông theo công thức: “khối lượng cục
máu đông trước ly giải = khối lượng của ống chứa cục máu động – khối
lượng của ống”. Với mỗi ống eppendof chứa cục máu đông đã được cân
trước, thêm vào 100 μl mẫu TSPS (nồng độ 50 mg/ml) TSP (nồng độ 25
mg/ml). Mẫu đối chứng là 100 μl DMSO 100%; đối chứng tham khảo là
streptokinase (5 IU). Tất cả các ống đem ủ ở 37°C trong 90 phút và quan
sát sự ly giải của cục máu đông. Sau khi ủ, hút loại bỏ chất lỏng và tiến
hành cân ống để xác định khối lượng cục máu đông không bị ly giải. Phần
trăm ly giải cục máu đông tính bằng sự chênh lệch về khối lượng trước và
sau ly giải cục máu đông. Tiến hành lặp lại thí nghiệm 3 lần với máu của
hai chuột cùng loại.
12


CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định thành phần hóa học của hạt và thịt quả me
Thành phần hóa học của quả me bào gồm cacbonhydrate, protein, chất
béo, lượng tro, sợi thô, axit tổng... các thành phần này bị ảnh hưởng của
môi trường phát triển. Kết quả nghiên cứu thành phần chính của thịt và hạt
me được đưa ra trên Bảng 4.1
Bảng 4.1 Thành phần chính của quả me
Thành phần (% khối
lượng)

Me tại Hải Phòng

Me tại Long An

Hạt me


0,6

3,1

0,4

Sợi thô

3,0

3,0

4,6

3,7

Tro

2,5

2,4

2,2

3,2

Carbohydrate

66,4

Theo quy
Theo quy
trình 1
trình 2
trình 3
28,0
39,3
38,7
TSP từ hạt me
14,5
17,5
16,8
TSP từ thịt quả me
26,2
36,0
35,7
TSP từ hạt me
12,6
16,5
16,2
TSP từ thịt quả me

13

Ghi chú
Thủy Nguyên,
Hải Phòng
Cần Giuộc,
Long An


chọn TSP chiết tách từ hạt làm đối tượng nghiên cứu của luận án.

Hình 4.2. Sắc đồ GPC của mẫu TSP chiết từ a) hạt me, b) thịt quả me

Thành phần đường của mẫu TSP chiết từ hạt me của 2 mẫu thu hái tại
2 vị trí được đưa ra trên Bảng 4.4. Kết quả cho thấy thành phần đường của
hai mẫu TSP chiết tách từ hạt me có nguồn gốc tại Hải Phòng và Long An
14


là gần giống nhau. Do vậy cho các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi lựa chọn
mẫu hạt me thu hái tại Hải Phòng.
Bảng 4.4. Thành phần đường của TSP
TSP
(chiết
tách từ
hạt me)

Mẫu me tại Hải Phòng
(% mol)
Glucose
Xylose
Galactose
1
0,33
0,22

Mẫu me tại Long An
(% mol)
Glucose

Mw
6
1,16x10 Da

Mw/Mn
4,46

Thành phần đường
(%mol)
Glucose
Xylose Galacstose
1
0,33
0,22

Phổ IR của TSP từ hạt me (Hình 4.4) thể hiện dao động đặc trưng
của các nhóm có mặt trong phân tử TSP, dao động tại 3325 cm-1 thể hiện
đặc trưng dao động hóa trị của nhóm -OH; tại số sóng 1417 cm-1 và 1396
cm-1 thể hiện đặc trưng dao động δ CH2 trong của glucose và galactose; tại
số sóng 1078cm-1 thể hiện đặc trưng dao động (C-O), (C-C) đặc trưng
của vòng pyranose, tại số sóng 999 cm-1 thể hiện dao động (C-O), (C-C),
tại số sóng 943cm-1 thể hiện dao động của vòng pyranose, tại số sóng 895
cm-1 thể hiện dao động của nhóm δ (C-1-H) -amomeric [51]. Kết quả
phân tích phổ IR được đưa ra theo Bảng 4.6.
15


Bảng 4.6. Kết quả phân tích thành phần phổ IR của TSP
-1


H-NMR cho thấy phổ rất phức tạp với độ rộng vạch lớn và trùng chập,
điển hình cho mẫu polymer có cấu trúc phức tạp. Tại vùng anomer của
phổ 1H-NMR (δ 4,56 - 5,11 ppm) và 13C-NMR (δ 101,4 - 106,9 ppm) đều
có 4 pic. Các tín hiệu từ δ3.39-4.51 ppm trên phổ 1H-NMR và δ 69,077,7ppm trên phổ 13C-NMR là thuộc về proton và carbon vòng pyranose.
Các pic ở khoảng δ 62,9-64,2ppm là của carbon ở vị trí C6 của glucose
và galactose và C5 của xylose. Các phổ thu được không có các tín hiệu
của tạp chất và tín hiệu đặc trưng của protein tại vùng 6,0-7,0 ppm, điều đó
chứng tỏ protein đã được loại khỏi mẫu nghiên cứu [24,25].
Phổ COSY của TSP được đưa ra ở Hình 4.6. Trên phổ 1H-NMR
cho thấy có 4 tín hiệu ở vùng anomer tại δ 5,12; 4,93; 4,56 và 4,55 ppm
được ký hiệu tương ứng là A, B, C và D. Sự cộng hưởng từ H1 đến H6 của
nhóm C, D và H1 đến H5 của nhóm A, B được gán cho các tín hiệu như
được chỉ ra trên phổ COSY. Kết hợp với kết quả từ phân tích thành phần
đường là TSP gồm 3 loại đường là glucose, galactose và xylose, có thể kết
luận rằng C và D là thuộc về glucose và galactose; A và B là thuộc về
xylose. Trên cơ sở độ dịch chuyển hóa học của proton, độ dịch chuyển hóa
học của tất các cacbon của các đường A, B, C và D đều được gán dựa trên
phổ HSQC (Hình 4.7). Trên phổ HSQC, các tín hiệu của C1/H1 tại
(106,96/4,56ppm); (105,05 /4,55 ppm) và C6/H6 tại (64,50/3.75–3,95
ppm) là thuộc về C và D (-glucose và -galactose) và C6 của D tồn tại ở
cả 2 dạng tham gia và không tham gia liên kết glycoside như được chỉ ra có
2 tín hiệu tại 69,00/3,95ppm và 65,50/3,75ppm. Tín hiệu của C5/H5 tại
(64,50/3,60 ppm) được gán cho -xylose. Tín hiệu của C4 (81,00 ppm) và
của C6 (69,50 ppm) của -glucose hoặc -galactose, cũng như tín hiệu tại
82,00 ppm của C2 của -xylose đều bị dịch chuyển về phía trường thấp so
16


với các carbon khi không tham gia liên kết glycoside, điều đó chứng tỏ
xylose tham gia liên kết glycoside tại vị trí C2 còn glucose và/hoặc

C
-Galactose
D
-Glucose

C-2/H2
82.00/
3.65

C-3/H-3

C-4/H-4

72.00/
3,92

74.50/
3.65

13

C NMR của TSP
C-5/H5

C-6/H-6

64.50/
3.60

101.50/

3.75

105.05/
4.55

76.00/
3.40

75.50/
3.67

81.00/
3.60

76.00/
3,80

64.50; 69.00/
3.75; 3,95

Để nghiên cứu chuỗi trúc của TSP chiết từ hạt me chúng tôi tiến
hành phân tích phổ khối ESI-MS của TSP-oligosacharide thu được bằng
phương pháp thủy phân TSP được nêu trong phần thực nghiệm. Phổ ESIMS của TSP-oligosaccharide được đưa ra trên Hình 4.10. Pic cơ sở tại
mảnh m/z 413 là của [Glc-Glc-Glc-5H2O+H]+1 điều này một lần nữa khẳng
định TSP có mạch chính là tạo thành từ glucose. Pic tại mảnh m/z 457
được gán cho [Glc[Xyl]-Glc+H]+1 hay của nhóm [Glc[Xyl-Gal]+H]+1, pic tại
mảnh m/z 615 là của [Glc-Glc-Glc-Glc+H]+1. Pic tại mảnh m/z 1011 gán cho
+1
[Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc[Xyl] ]-Glc+H] . Pic tại mảnh m/z 1077 là của [Glc[Xyl]+1
Glc[Xyl-Gal]-Glc-Glc]+H] và pic tại mảnh m/z 1224 là của: [Glc[Xyl]-Glc[XylGal]-Glc[Xyl-Gal]+H]

Phổ ESI-MS/MS của mảnh m/z 1011 thu được trên Hình 4.13. Theo
hình pic cơ sở tại mảnh m/z 545 được gán cho nhóm [Glc[-Xyl-Gal]+1
4H2O+H] , pic tại mảnh m/z 879 được gán cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-Glc+1
Glc-H2O+H] , pic tại mảnh m/z 929 được gán cho nhóm [Glc[Xyl]-Glc[Xyl]+1
Glc-Glc+H] , pic tại mảnh m/z 945 được gán cho nhóm [Glc-Glc[Xyl]-Glc[Xyl]+1
Glc[Xyl]-3H2O+4H] , pic tại mảnh m/z 992 được gán cho nhóm [Glc-Glc[-Xyl]+
Glc[Xyl]-Glc[Xyl]-H2O+H] .
Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 457 được đưa ra trên Hình 4.14, pic
tại mảnh m/z 200 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc-Glc -6H2O+H]+1, pic tại
mảnh m/z 309 thể hiện đặc trưng nhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1, pic tại mảnh
m/z 337 đặc trưng cho nhóm [Glc-Glc-Glc -6H2O+3H]+1, pic tại mảnh m/z
397 thể hiện đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc-4H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z 439
thể hiện đặc trưng nhóm [Glc-Glc-Glc+3H]+1.
Phổ ESI-MS/MS mảnh m/z 413 được đưa ra trên Hình 4.15, pic
tại mảnh m/z 181 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc+2H]+1, pic tại mảnh
m/z 254 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc[Xyl] -3H2O+3H]+1, pic tại mảnh
m/z 309 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc-Glc -H2O+H]+1, pic tại mảnh m/z
311 thể hiện đặc trưng của nhóm [Glc[Xyl]+H]+1, pic tại mảnh m/z 386 thể
hiện đặc trưng của nhóm [Glc-Glc-Glc-3H2O+3H]+1.
Các kết quả từ phổ ESI-MS cho phép xác định TSP là một
galactoxyloglucan có các tập hợp mảnh chính là -Glc-Glc-Glc-, -Glc-Xyl18


Glc, -Glc-Xyl-Gal-... Kết hợp với kết quả phân tích NMR, cấu trúc hóa học
của monomer của TSP được đưa ra trên Hình 4.16, theo danh pháp của lớp
chất xyloglucan, cấu trúc chuỗi của TSP có dạng GXL.
Xy l
GlcGlcGlc
GalXy l



211.7

229.4

0.92

Giá trị  của TSP là 0,92 điều đó cho thấy phân tử TSP có dạng hình
cầu, đặc điểm hình dạng này tương tự như polysaccharide từ hạt đậu tương
và hạt lanh [89,119]. Mô phỏng hình dạng của TSP được đưa ra trên Hình
4.19

Hình 4.19. Mô phỏng hình dạng của phân tử TSP

Vậy TSP chiết tách từ hạt me là polysaccharide phân nhánh có trọng
lượng phân tử là 1,15 x106Da. Trong dung dịch nước phân tử TSP có dạng
hình cầu.
Cấu trúc không gian của TSP ở kích thước cỡ nano được xác định
bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS). Kết quả đo SAXS của
dung dịch TSP 0,5% trong nước được biểu diễn qua đường tán xạ và 2 biểu
đồ Kratky và Guinier (Hình 4.20 a, b,c). Các dạng biểu đồ là điển hình của
polysaccharide trung tính.
19


Qua biểu đồ Guinier, xác định được bán kính từ hồi chuyển
Rgc=1,3nm, với các polysaccharide mạch thẳng không phân nhánh như
carrageenan hay heparin thì giá trị Rgc khoảng 0,4-0,53nm [104,105] điều
này cho thấy TSP có mạch nhánh tương đối dài, kết quả này cũng phù
hợp với cấu trúc hóa học xác định được theo các phương pháp phổ IR,

5-6 ppm). Ngoài ra trên phổ còn xuất hiện pic tại vùng δ 80-84ppm thể
hiện thế sulfate tại vị trí C4, trong khi đó với mẫu không sulfate tại vùng δ
74-78 ppm. Kết quả phổ 13C NMR khẳng định TSP đã bị thế sulfate ở một
vài vị trí: C6 của galactose và/hoặc glucose, và C4 của galactose và/hoặc
xylose.
20


Kết quả đo tán xạ ánh sáng của 2 mẫu TSP và TSPS4 được đưa ra
trên bảng 4.17.
Bảng 4.17. Kết quả từ phép đo GPC và LS của TSP và TSPS
Sample
TSP
TSPS4

dn/dc
(ml/g)
0.137
0.161

Mw x 10
11.55
2.69

-5

Mw/Mn
4.36
1.52


Qua biểu đồ Kratky thấy sự khác nhau, mẫu TSPS4 có pic ở khoảng
góc tán xạ nhỏ q


các mẫu này đã thể hiện khả năng kháng các các chủng loại vi khuẩn E.
coli, B. cereus, P. aeruginosa, S. faecalis, các mẫu TSPS1, TSPS3, TSPS5
còn thể hiện khả năng kháng chủng vi khuẩn L.mono, S. aureu. Tất cả các
mẫu đều không kháng chủng nấm Candida albicans. Trong khi đó mẫu
TSP tự nhiên và mẫu TSPA không thể hiện hoạt tính này.
Các dẫn xuất sulfate hóa của TSP tự nhiên đều thể hiện được khả
năng kháng vi sinh vật kiểm định tốt, điều này mở ra hướng mới trong
nghiên cứu tạo ra loại dược phẩm có nguồn gốc tự nhiên để sử dụng trong
y học.
Kết quả chống đông tụ máu của các mẫu TSPS với các mức độ
sulfate hóa khác nhau ở nồng độ 150g/ml được đưa ra trên Bảng 4.23. Kết
quả cho thấy các mẫu TSPS có thời gian đông tụ máu trong khoảng 40-55
phút cao hơn so với thời gian 35 phút của mẫu TSP. Do vậy, có thể kết
luận dẫn xuất sulfate hóa làm tăng khả năng chống đông tụ máu, tuy nhiên
trong khoảng DS nghiên cứu thì chúng tôi không thấy mối tương quan tỷ lệ
giữa mức độ sulfate hóa và khả năng chống đông tụ máu.
Kết quả đánh giá khả năng ly giải cục máu đông của các mẫu
TSPS được đưa ra trên Bảng 4.24. Kết quả cho thấy mẫu TSPS1 và TSPS4
ở nồng độ nghiên cứu ly giải được 8,26 và 8,88% cục huyết khối so với đối
chứng còn các dẫn xuất acetyl không thể hiện hoạt tính này, vậy mẫu
sulfate hóa đã làm tăng hoạt tính ly giải cục máu đông so với mẫu tự nhiên.
KẾT LUẬN
Qua thời gian nghiên cứu chúng tôi đã thu được các kết quả sau:
1. Đã thu thập và xác định được tên khoa học của 02 mẫu me ở các
vùng Thủy Nguyên (Hải Phòng) và Cần Giuộc (Long An)- là hai địa
phương có khí hậu, thổ nhưỡng tương đối khác nhau. Đã xác định được độ
ẩm, hàm lượng tro và thành phần hóa học chủ yếu có trong hạt và thịt của
quả me là protein thô, chất béo thô, tro, sợi thô và carbohydrate. Với luận

a. Về mặt cấu trúc: sự sulfate hóa có ảnh hưởng đến cấu trúc không
gian và cấu trúc bề mặt của mẫu tự nhiên.
b. Về mặt hoạt tính sinh học: sự sulfate hóa làm tăng đáng kể hoạt
tính sinh học so với mẫu tự nhiên. Tuy nhiên mức độ tăng này
không tỷ lệ với mức độ sulfate hóa.
Đây là một điểm mới của luận án so với các nghiên cứu trong
nước ở cùng lĩnh vực
KIẾN NGHỊ
Trên cơ sở các kết quả thu được từ luận án, chúng tôi có một số kiến nghị
như sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của
polysaccharide từ các cây khác thuộc họ đậu của Việt Nam nhằm tìm
kiếm các hợp chất mới có hoạt tính sinh học cao từ đó làm cơ sở cho
việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên thực vật Việt
Nam.
2. Tiếp tục nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính để làm rõ hơn sự
ảnh hưởng của cấu trúc polysaccharide và các dẫn xuất đến hoạt tính
sinh học, làm cơ sở để tạo ra các dẫn xuất có hoạt tính cao hơn mẫu tự
nhiên.

24