MỞ ĐẦU
Ở nước ta, tam thất được trồng và mọc tự nhiên ở: Hà Giang, Cao
Bằng, Lào Cai, Kon Tum, Quảng Nam… Tuy nhiên việc khai thác và sử
dụng tam thất trong nước còn hạn chế vì chưa có nhiều nghiên cứu khoa học
so sánh về thành phần hoá học các hoạt chất và tác dụng sinh học của chúng
với loài tam thất khác, đặc biệt là loài tam thất trồng của Trung quốc. Tam
thất Việt Nam chủ yếu được khai thác để xuất khẩu tiểu ngạch sang Trung
Quốc làm thuốc chữa bệnh. Nước ta chủ yếu nhập khẩu Tam thất trồng ở
Trung Quốc (tên khoa học Panax notoginseng) về làm thuốc chữa bệnh, pha
chế mỹ phẩm và làm thực phẩm bổ dưỡng cơ thể. Cho tới ngày nay, việc
khai thác hoạt chất saponin và polyacetylen trong củ tam thất đã và đang
được nghiên cứu theo các phương pháp chiết tách khác nhau, phương pháp
nghiên cứu chiết tách với sự hỗ trợ của thiết bị siêu âm cho lượng chất tổng
số lớn với đầy đủ các hoạt chất. Phương pháp sắc ký hiện đại tinh sạch được
các chất có độ tinh sạch cao, từ đó nghiên cứu được những hoạt tính sinh học
của chúng, mở ra khả năng ứng dụng công nghệ để sản xuất sản phẩm tốt
hơn, với chất lượng cao hơn. Xuất phát từ thực tế và sự cấp thiết trên, đề tài:
“Nghiên cứu chiết tách một số hoạt chất trong củ tam thất trồng ở Sapa,
Việt Nam và khả năng ứng dụng trong công nghệ thực phẩm” đã được lựa
chọn để nghiên cứu với mục tiêu và nội dung sau:
* Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu, xác định các loài tam thất trồng ở Sapa, Việt Nam.
- Nghiên cứu thu nhận cao chiết từ tam thất, thành phần dinh dưỡng,
đồng thời đánh giá các hoạt chất có hoạt tính sinh học của cao chiết từ tam
thất trồng ở Sapa, Lào Cai.
- Đánh giá khả năng ứng dụng củ tam thất trong một số sản phẩm
công nghệ thực phẩm.
* Nội dung nghiên cứu
- Xác định tên khoa học ba loài tam thất trồng tại Sapa, Lào Cai, Việt
Nam là: Panax stipuleanatus, Panax bipinnatifidus, Panax notoginseng.
- Nghiên cứu thành phần hoá học của ba loại củ tam thất trồng ở

trang, danh mục công trình công bố 1 trang, tài liệu tham khảo 13 trang.
Luận án có 50 bảng, 44 hình, 160 tài liệu tham khảo.
1.TỔNG QUAN
2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu của luận án là 3 loài tam thất thu hái tại Sapa - Lào Cai.
Mẫu tam thất được giám định tên khoa học bằng hình thái là Panax notoginseng F. H.
Chen ex C. Y. Wu et K. M. Feng (tam thất Trung Quốc), Panax bipinnatifidus Seem.
(sâm Vũ diệp) và Panax stipuleanatus H. Tsai et K. M. Feng (tam thất hoang), thuộc họ
Ngũ gia bì (Nhân Sâm) (Araliaceae).
- Luận án sử dụng các phương pháp và thiết bị nghiên cứu sau:
+ Phân tích định lượng saponin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao
HPLC; thành phần axit béo xác định bằng GC-MS; amino axit được xác
định bằng HPLC với detector huỳnh quang; hàm lượng nguyên tố đa lượng
2


và vi lượng xác định bằng thiết bị quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS).
Hàm lượng flanonoid, phenol tổng… được xác định bằng phương pháp
quang phổ (UV-Vis).
+ Các chất được tinh sạch bằng sắc kí bản mỏng (TLC), sắc kí cột nhồi
silica gel, sephadex LH-20, sắc kí lỏng điều chế (Prep. HPLC) với cột pha
thường và pha đảo (RP-18). Cấu trúc của chúng được xác định bằng các phương
pháp phổ HR-ESI-MS và 1D, 2D NMR.
+ Hoạt tính kháng vi sinh vật xác định theo hai phương pháp là phương
pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật trên
môi trường lỏng. Hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp môi trường thạch
(MTT).
+ Nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tam thất trong ngành công nghệ
thực phẩm bằng phương pháp phân tích cảm quan sản phẩm, phân tích
phương sai (ANOVA). Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê.


P.

stipuleanatus

notoginseng

bipinnatifidus

Aspartic

437,5

394,6

414,7

2

Serine

309,9

284,5

299,5

3

Glutamic


346,4

312,4

343,6

7

Alanine

142,3

132,5

139,4

8

Proline

31,4

27,9

30,2

9

Tyrosine


292,8

272,0

287,5

13

Isoleucine

128,3

132,4

131,9

14

Leucine

327,7

309,2

328,7

15

Phenylalanine

P.

P.

stipuleanatus

notoginseng

bipinnatifidus

1

C12:0 (decanoic)

3,4

13,6

32,6

2

C14:0 (myristic)

11,7

30,5

30,3


6

C18:2 (linoleic)

783,9

587,0

743,5

7

C18:1 (oleic)

251,3

350,2

354,3

8

C18:0 (stearic)

82,6

98,4

98,3


12

C22:0 (behenic)

8,3

4,6

-

13

C23:0 (tricosanoic)

0,9

-

-

14

C24:0 (lignoceric)

2,2

2,2

-


Pb
Cr
Ni
Mn
Cd

P.
bipinnatifidus
12,6933
1,3543
4,7186
6,2865
7,4905
1,0769
10,4556
0,0487

P.
stipuleanatus
14,0271
1,2716
4,0570
7,0323
7,4484
0,5786
9,3159
0,0382

P.
notoginseng

6


Viện Kiểm nghiệm, Bộ Y tế, kết quả ở bảng sau:
Bảng 3.10. Định lượng saponin trong bột củ ba loài tam thất.
Mẫu
Bột TTH
Bột SVD
Bột NOTO

Khối
lượng (g)
0,6
0,6
0,6

Thể tích
(ml)
50
50
50

R1 (%)

Rb1 (%)

Rg1 (%)

0,015
0,008

lại dung môi.
Các thí nghiệm được tiến hành như sau: cho khoảng 2 gam bột mẫu
tam thất và lượng dung môi theo tỉ lệ dung môi/nguyên liệu là 50/1(thể
tích/khối lượng; v/m). Các phương pháp chiết sau:
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát các phương pháp chiết tách và nồng độ
dung môi chiết
Phƣơng pháp
tách

Chiết Soxhlet
Trong 3 giờ

Nồng độ
ethanol
(% V)
99,6
95
90
85
80
75
70
65
60

Khối lƣợng mẫu
(g)

Cao chiết tổng
(% chất khô)

25,86
25,75
25,91
25,78
25,95


Ngâm ở nhiệt
độ thường
Trong 48 giờ

Siêu âm 30
phút

Siêu âm 1 giờ

99,6
90
80
70
60
50
40
30
90
80
70
60
50
40

10,608
11,49
14,04
13,59
13,08
13,07
7,60
9,25
10,36
10,34
10,01
10,13
9,06
11,07
14,17
13,19
12,36
12,32

25,92
26,02
26,61
26,28
26,65
26,08
26,41
26,51
26,56
25,89
26,35

siêu âm và nhiệt độ chiết đến lượng cao chiết tổng thu được.

Hình 3.2: Khảo sát tỉ lệ dung môi/nguyên liệu (v/m).

9


Hình 3.3: Khảo sát nồng độ dung môi ethanol (%)
c, Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết (hỗ trợ rung siêu âm)
Ngâm khoảng 2 gam mẫu trong 100 ml dung môi ethanol có nồng độ
cồn 65% rồi rung siêu âm duy trì nhiệt độ trong khoảng từ 350C đến 400C.
Khảo sát thời gian ngâm mẫu chiết hỗ trợ siêu âm trên máy Powersonic 405
- Hàn Quốc (tần số 33 - 40 kHz) ở các mức thời gian từ 30 phút đến 90
phút. Kết quả thu được tại hình 3.4 như sau:

Hình 3.4: Khảo sát thời gian chiết (thời gian rung siêu âm)

10


Kết quả: nồng độ dung môi 65%, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 55/1 (v/m)
và thời gian siêu âm 75 phút. Với điều kiện tối ưu này thì mục tiêu về lượng
cao chiết tổng đạt được cao nhất là: 15,00 ± 0,02%. Đạt tỷ lệ lượng cao chiết
lớn nhất cho mục đích chiết tách cao tam thất.
Mẫu tam thất
2,0419g (qui khô)

- Nghiền thành bột ø 0,2-1mm
- Nồng độ dung môi 65%
- Tỷ lệ dm/bột (55/1)


Rb1 (%)

Rg1 (%)

Saponin
tổng (%)

0,6

50

0,046

0,190

0,187

0,423

R1: Notoginsenosid R1 Rb1: Ginsenosid Rb1 Rg1: Ginsenosid Rg1

3.3. Hoạt tính sinh học của các phân đoạn chiết xuất từ củ tam thất hoang
3.1.1. Hoạt tính chống oxy hóa – quét gốc tự do DPPH
Bảng 3.21: Hoạt tính chống oxy hóa của các cao phân đoạn
từ củ tam thất hoang

Mẫu
n-hexane
Ethyl acetat

0,1
0,5
(mg/ml)
(mg/ml) (mg/ml) (mg/ml)
(mg/ml)
0,32
1,61
37,07
80,92
88,15

Từ kết quả bảng 3.21 cho thấy hoạt tính chống oxy hóa các phân đoạn
của củ tam thất hoang là rất thấp. Hoạt tính chống oxy hóa cao nhất ở phân
đoạn n-butanol là 11,53% với 2 mg/ml mẫu thử. Trong khi đó ở chất đối chứng
axit ascorbic ở 0,05 mg/ml đã đạt 37,07%.
3.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật
Chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của các
cao phân đoạn củ tam thất hoang theo hai phương pháp là phương
pháp khuếch tán lỗ thạch và phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh
vật trên môi trường lỏng.
12


Bảng 3.22: Hoạt tính kháng vi sinh vật của các cao phân đoạn
từ củ tam thất hoang trên môi trường thạch.
Kích thƣớc vòng kháng khuẩn (mm)
Tên vi khuẩn

n-hexane


22,8 ± 1,6

-

-

-

14,4 ± 0,5

E. coli

23,4 ± 1,6

-

16,3 ± 4,0

-

12,0 ± 2,2

P. aeruginosa

21,4 ± 1,6

-

19,0 ± 1,4


củ tam thất hoang trên môi trường lỏng.
Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của vi sinh vật
IC50 (g/ml)
Mẫu

Gram (+)

Gram (-)

Nấm

S.

B.

L.

S.

E.

P.

C.

aureus

subtilis

fermentum


> 128

> 128

> 128

> 128

> 128

3.3.3. Hoạt tính ức chế sinh tổng hợp melanin
Tyrosinase là enzyme có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng
hợp melanin. Tyrosinase là enzyme đầu tiên xúc tác cho quá trình phân giải
tyrosine và dopaquinon tạo ra melanin.
13


Bảng 3.25: Nồng độ ức chế 50% hoạt tính tyrosinase (IC50) của các
cao phân đoạn từ củ tam thất hoang.
Mẫu và chất chuẩn

IC50 (mg/ml)

n- hexane

0,4312 ± 0,0332

n-butanol


0,26

0,26

2

n-butanol

39,34

Ellipticin

0,45

Đối
chứng

SK-

MCF-7

KB

0,21

0,51

0,86

54,03

3.Thu hồi dung môi dưới áp suất
giảm 5 - 10 mbar

n- hexane (15,0g)

n-butanol (48,98g)

Nước (135,01g)

Hình 3.10: Quy trình chiết xuất phân đoạn từ cao chiết tổng
củ tam thất hoang
3.4.2. Xác định cấu trúc các hợp chất tinh sạch từ cao phân đoạn
3.4.2.1. Hợp chất H3C2 (T1)
Cấu trúc của T1 được xác định bằng phổ 1H NMR và so sánh với tài
liệu, chúng tôi kết luận T1 là stigmasterol (Hình 3.15).

Hình 3.15: Cấu trúc của hợp chất T1 (stigmasterol)
3.4.2.2. Hợp chất H5A1 (T2)
Hợp chất T2 được xác định bằng phổ 1H NMR và GC-MS. Kết quả
T2 là axit 5-dodecenoic.
O

HO

5

Hình 3.17: Cấu trúc của hợp chất T2 (axit 5-dodecenoic)
15



- 4 nguyên tử cacbon của nối ba (-C≡C-) cộng hưởng ở 71,0 ppm; 73,7
ppm; 77,3 ppm và 83,0 ppm (nằm trong vùng từ 70 - 100 ppm).
- 2 nguyên tử cabon của nối đôi (-CH=CH-) cộng hưởng ở 108,2
ppm; 149,7 ppm (nằm trong vùng từ 110 - 150 ppm).
- 2 nguyên tử cacbon đính với nhóm OH cộng hưởng ở 64,3 ppm và 72,1 ppm.
→ có 2 nhóm CH3, 8 nhóm CH2, 4 nhóm CH và 4 nguyên tử C.

17


Hình 3.20: Phổ HMBC của hợp chất T3.
Phổ HMBC trên hình 3.20 cho thấy các tương tác xa C-H trong
phân tử:
Proton của 1 nhóm metyl (-CH3) (0,88 ppm) có tương tác với 2C của 2
nhóm metylen (-CH2-) (22,6 ppm và 31,8 ppm). Proton của nhóm metyl (CH3) còn lại (1,03 ppm) có tương tác với C của nhóm metylen (-CH2-) (30,72
ppm) và tương tác với C của nhóm CH-OH (64,3 ppm).
Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,29 ppm) có tương tác với C của
nhóm metyl (-CH3) (14,1 ppm), C nhóm metylen (-CH2-) (31,8 ppm).
Proton nhóm metylen (-CH2-) (1,57 ppm) có tương tác với C của nhóm
metylen (-CH2-) (29,4 ppm) và C nhóm CH-OH (72,1 ppm). Proton nhóm
metylen (-CH2-) (1,75 ppm) có tương tác với C của nhóm metyl (-CH3)
(9,33 ppm), C nhóm CH-OH (64,3 ppm) và 2 nhóm -C≡C- (77,3 ppm và
83,0 ppm).
Proton của 1 nhóm CH-OH (4,19 ppm) có tương tác với C của nhóm
olefin –CH=CH- (108,2 ppm).
Proton của nhóm –CH=CH- có tương tác với C của nhóm CH-OH và -C≡C-.
Từ sự phân tích trên đây, chúng tôi xác định cấu tạo của T3 là Heptadeca8-en-4,6-diyne-3,10-diol, đây là một chất mới và tiến hành quy kết các giá trị
phổ bảng 3.30. Chúng tôi chưa xác định được cấu hình của hai trung tâm bất đối
ở C-3 và C-10. Mặc dù đã cố gắng sử dụng phương pháp Mosher cải tiến nhưng
không thể tinh sạch được sản phẩm este mong muốn.

OH

Hình 3.21: Heptadeca-8-en-4,6-diyne-3,10-diol
Bảng 3.30: Các giá trị phổ của hợp chất T3.
1

13

H NMR (H, J in Hz)
1,05, t, 6,0
1,57, m; 1,74, m
4,42, t, 6,5
5,76, d, 16,0
6,32, dd, 5,5, 16,0
4,19, d, 6,5
1,57, m
1,29, m
1,29, m
1,29, m
1,29, m
1,29, m
0,88, t, 7,0

1
2
3
4
5
6
7

3.4.2.4. Hợp chất H6A2 (T4)
Hợp chất T4 được xác định là 1,8-octadecadiene-4,6-diyn-3,10-diol
(stipudiol) bằng phổ 1D và 2D NMR với cấu trúc sau.
OH
Ha

1
2

Hb

3

12
4

5

6

7

8

10
9

11

13


6

7

8

14

12

3

9

OH

OH

16

10
11

13

15

17


>128
>128
T5
25,6
>128
>128
>128 >128
>128
>128
T6
>128
128
>128
>128 >128
>128
>128
Bảng 3.35. Kết quả kháng dòng tế bào KB của các chất tinh sạch trong
củ tam thất hoang

Mẫu

STT
1
2
3
4
5

Tên mẫu
T3

1,0
2,5
5,0

(%) chuột chết
6,7
30,0
56,7
100

Từ kết quả bảng trên xác định được LD50 của mẫu thử là 1,65g/kg
thể trọng. Khi xác định được LD50 thì liều an toàn để thử nghiệm dược lý sẽ
là 1/10 LD50 ở cùng một loại động vật và cùng một đường dùng thuốc. Vậy
ta xác định được liều tương đối an toàn dùng cho thử nghiệm dược lý ban
đầu là 0,16g/kg thể trọng. Liều dùng an toàn đưa ra là 0,16g/kg/ngày.
3.6. Ứng dụng tam thất hoang trong sản xuất thực phẩm
Từ bột và cao chiết tổng trong củ tam thất hoang đưa vào ứng dụng
sản xuất thử nghiệm 04 sản phẩm: bánh cookie tam thất, nước tam thất mật
ong, kẹo cứng tam thất và trà tam thất hoa cúc. Kết quả thu thập được xử lý
bằng thuật toán ANOVA phân tích phương sai cho hai yếu tố để kiểm tra
thị hiếu và chọn ra công thức tối ưu cho sản phẩm.
*Nghiên cứu bổ sung chế phẩm cao tam thất vào sản phẩm
kẹo cứng
Sử dụng công thức làm kẹo cứng để tiến hành bổ sung cao tam thất
vào sản phẩm. Tiến hành đánh giá cảm quan so sánh cặp để tìm, xác định
ngưỡng phân biệt cũng như lượng cao tối thiểu bổ sung vào sản phẩm kẹo
để người thử cảm nhận được mùi cũng như vị đặc trưng nhất. Đánh giá cảm
quan trên 10 người cho bảng tổng hợp xử lý kết quả bảng 3.45.
21



7
13
5
15
8
12
5
15

13
7
15
5
12
8
15
5

Giá
Giá trị
trị
χ2tc
χ2

Kết luận

3,6

Không phân

2,0g

Giá trị (p)

Vị đắng

3,82a 5,32b

6,20c

4,42a

3,17.10-12

Vị ngọt

4,72a 5,70c 6,17b 6,32b

8,34.10-12

Trạng thái

3,75a 4,18a 4,77b 4,77b

7,66.10-9

4,12a 5,67b

6,80c 7,65d


tam thất ở Sapa, Lào Cai là tam thất hoang (Panax stipuleanatus, TTH),
tam thất Trung Quốc (Panax notoginseng, NOTO) và Sâm vũ diệp (Panax
bipinnatifidus, SVD) như sau:
- Hàm lượng protein trong nguyên liệu tam thất, TTH là: 7,04 ± 0,29%;
SVD 8,02 ± 0,15%; NOTO 10,16 ± 0,24%. Hàm lượng lipid trong TTH
10,35 ± 0,80%; SVD 9,12 ± 0,3%; NOTO 6,72 ± 0,5%. Hàm lượng
carbohydrate TTH 50,62 ± 3,74%; SVD 43,28 ± 0,23%; NOTO 48,15 ±
0,42%.
- Trong củ của 3 loài tam thất đều chứa đầy đủ 15 axit amin (trong đó có
8 loại axit amin thiết yếu) và 14 axit béo. Đặc biệt TTH có chứa hàm
lượng axit béo không no là 73,98%.
- Hàm lượng 8 nguyên tố đa lượng và vi lượng trong 3 loài tam thất
SVD, TTH và NOTO cho thấy sắt là nguyên tố có hàm lượng lớn nhất
lần lượt 12,6933 mg/kg; 14,0271 mg/kg và 12,0173 mg/kg. Hàm lượng
nhỏ nhất là cadimi 0,0487 mg/kg; 0,0382 mg/kg và 0,0422 mg/kg.
- Hàm lượng phenol tổng trong cao chiết của 3 loài tam thất là: TTH
12,04 ± 0,08 mg/g; SVD 11,00 ± 0,17 mg/g và NOTO 11,29 ± 0,11
mg/g. Hàm lượng flavonoid trong cao chiết của 3 loài tam thất nghiên
cứu là: TTH 1,03 ± 0,12 mg/g; SVD 1,19 ± 0,07 mg/g và NOTO 1,29 ±
0,10 mg/g.
- Củ 3 loài tam thất đều chứa saponin. Các saponin thuộc cả hai nhóm
saponin triterpen và saponin steroid. Kết quả định lượng 3 saponin
thành phần Notoginsenosid (R1); Ginsengnosid (Rg1); Ginsengnosid
(Rb1), cho thấy cao ethanol của TTH chứa 0,423%; bột TTH chứa
0,134%, bột SVD chứa 0,080% và bột NOTO chứa 10,12%.

23


2. Lần đầu tiên xây dựng qui trình chiết tách cao chiết tổng trong củ

24