1/ Đặ t v ấ n đề :
Công nghệ sinh học là một ngành khoa học mũi nhọn, đang phát triển trên cơ sở
các kó thuật mới mẻ: kó thuật di truyền, kó thuật dung hợp tế bào; kó thuật nuôi cấy mô; kó
thuật nuôi cấy tế bào; kó thuật cấy chuyển phôi….Những thành tựu này đang chuẩn bò cho
một cuộc cách mạng sinh học trong các ngành kinh tế-kó thuật.
Phương pháp nuôi cấy mô đã được áp dụng từ lâu bởi các nhà trồng hoa và các nhà
chọn giống muốn nhân nhanh những giống đặc cấp, cải thiện hiệu quả của từng thời kì
chọn lọc.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được tiến hành ở Việt Nam từ giữa những năm
70. Hiện nay, trong cả nước đã có vài chục phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào.
Phần lớn các phòng thí nghiệm đang tiến hành những nghiên cứu ứng dụng: chủ yếu là vi
nhân giống trong ống nghiệm. Nuôi cấy mô và tế bào thực vật còn có những khả năng
đóng góp cho nnhững nghiên cứu và ứng dụng xa hơn thế nữa, đặc biệt là trong cải biến
di truyền (chọn dòng tế bào, đột biến tế bào, nuôi cấy bao/hạt phấn, lai tế bào, chuyển
gen) và trong công nghệ thu nhận các chất có hoạt tính sinh học. Đề tài “Các hướng
nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật” giúp cho người viết có được
những kiến thức cơ bản về nuôi cấy mô tế bào thực vật, về các hướng nghiên cứu và ứng
dụng đã được tiến hành thành công tại các phòng thí nghiệm.
2/ Đối tượng và phạm vi nghiên cứu :
Đối tượng nghiên cứu: là mô và tế bào thực vật, thành phần môi trường và các chất
kích thích sinh trưởng.
Phạm vi nghiên cứu: chỉ đề cập đến các hướng nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy
mô và tế bào thực vật.
3/ Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu đề tài là phương pháp tổng hợp các tài liệu được lấy từ
các nguồn thông tin như thư viện, báo đài, internet. Dựa vào sự phân tích, tổng hợp, so
sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Mặc dù đề tài được chuẩn bò khá công phu, nhưng chắc chắn vẫn còn sơ suất, rất
mong được sự góp ý của q thầy hướng dẫn và các bạn đồng nghiệp. Tác giả chân thành
biết ơn.
4/ Cấu trúc tiểu luận:

I. Một số vấn đề chung về chuyển gen ở thực vật........................................21
II. Các phương pháp chuyển gen..................................................................22
1. Chuyển gen bằng Agrobacterium........................................................22
2. Phương pháp nhiễm Agrobacterium bằng virus...................................23
3. Phương pháp chuyển gen trực tiếp.......................................................23
4. Phương pháp bắn gen...........................................................................23
5. Phương pháp vi tiêm.............................................................................24
Phần 6: Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô và tế bào thưc vật ở
Việt Nam……………………………………………………………………………………………………………………………………………..25
KẾT LUẬN............................................................................................................….27
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………………………………………………………28
- 2 -
.
Phần 1: VI NHÂN GIỐNG IN VITRO.
Vi nhân giống in vitro gọi tắt là vi nhân giống là hệ thống sử dụng sự phát triển
nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng tồn tại hoặc mô phân sinh trong cây.
Chọn nguyên liệu ban đầu cho vi nhân giống là rất quan trọng, nó không những
quyết đònh sự thành công ban đầu mà cả quá trình nhân tiếp theo. Các công trình của
D.Amato (1977) cho thấy chỉ có đỉnh sinh trưởng của chồi mới bảo đảm sự ổn đònh về di
truyền. Tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kích thước nhỏ, kết hợp với xử lý nhiệt để làm
sạch bệnh là nguyên liệu tốt để nhân.
Các chồi nhân ban đầu thường được tạo từ đỉnh chồi hoặc đỉnh mô phân sinh trên
môi trường thạch chứa các muối khoáng, cabonhydrat, vitamin và các chất điều hòa sinh
trưởng. Vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây
đònh nhân sau đó khử trùng và đưa vào nuôi cấy ở môi trường phù hợp. Sự phát triển
nhanh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào ánh sáng và nhiệt độ. Chồi được nhân lên sau 3
đến 4 tuần. Các chồi hình thành lại được tách ra chuyển sang môi trường mới và qui trình
cứ thế được lặp lại. Trong một số trường hợp, rễ có thể tạo ngay trên môi trường nhân,
trong một số trường hợp khác, chồi nhân phải chuyển sang môi trường có auxin hoặc
không có auxin để tạo rễ. Đây là phương pháp nhân cho hệ số nhân thấp hơn phương

Một vấn đề hiện nay là giá cây trồng nhân bằng phương pháp vi nhân còn cao
(2500 – 3000 đ/cây) vì vậy cần phải cải tiến các qui trình nhân để làm hạ giá thành, đặc
biệt là cơ giới hóa các khâu nhân hoặc chỉ nhân những giống cây thật q hiếm và có giá
trò kinh tế cao. Trên thực tế cây nhân bằng phương pháp vi nhân bao giờ cũng đắt hơn cây
giống từ hạt.
Hiện nay nhân giống đã thành công trên nhiều giống cây như lan, hoa cúc, hoa
hồng, cẩm chướng, dứa, mía, dâu tây, chuối, cam, quýt, thông….
Vi nhân giống ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh một số giống cây còn có thể rút
ngắn thời gian đưa các cây lai và các loài cây nguyên chủng tự nhiên có các đặc điểm tốt
vào sản xuất hoặc nhân nhanh bố mẹ của các cặp lai trong sảnh xuất hạt lai.
Phần 2: TẠO CÂY ĐƠN BỘI VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN
CỨU VÀ THỰC TIỄN.
Có nhiều phương pháp tạo cây đơn bội, nhưng từ những năm 60, việc tạo cây đơn
bội bằng nuôi cấy bao phấn và hạt phấn được phát triển. Cây đơn bội có thể nhận bằng
nuôi cấy bao phấn hoặc hạt phấn trên môi trường thạch (Keller & cs, 1975; Wenzell & cs,
1977) hoặc môi trường lỏng (Wernicke & cs, 1976). Trong quá trình nuôi cấy, hạt phấn
phân chia, tạo mô sẹo hoặc phôi và tiếp theo có thể tạo cây.
I.Các yếu tố ảnh hưởng lên sự hình thành phôi và mô sẹo.
1.Các yếu tố liên quan đến nguyên liệu nuôi cấy.
Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn hay hạt phấn ảnh hưởng rất lớn đến hạt
phấn nuôi cấy in vitro. Tuổi của cây, sự thay đổi chu kỳ quang cũng như nhiệt độ là
những yếu tố ảnh hưởng đáng kể đến nuôi cấy tạo cây đơn bội. Kết quả nghiên cứu của
Dunwell (1976) cho thấùy tỉ lệ phôi cao nhận được khi sử dụng những nụ hoa hình thành
sớm và cây phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cường độ chiếu sáng cao cho tỉ
lệ tạo phôi từ hạt phấn cao hơn.
Ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở
một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu
gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấùn của các cây khoai tây nhò bội tạo từ
cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ.
Ngoài ra xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 – 10

300-500 lux. Nhiệt độ bình thường từ 25-28
o
C là thích hợp đối với nuôi cấy bao phấn và
hạt phấn của hầu hết các giống cây.
II.Tái sinh cây.
Việc tái sinh cây từ bao phấn thuốc lá và một số cây họ cà khác tương đối dễ,
thậm chí cây có thể tái sinh ngay trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo phôi. Đối với một
số loài cây khác, nhất là cây một lá mầm (lúa, ngô, mì), trên môi trường nuôi cấy ban
đầu chứa chất sinh trưởng và đường cao không thể tái sinh cây, muốn tái sinh cây phải
chuyển sang môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Một số trường hợp phải
dùng zeatin và nước dừa mới có thể tái sinh cây.
Trong trường hợp tạo cây qua mô sẹo, việc tái sinh cây cũng có thể xảy ra trên
môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng, nhưng thường thì phải chuyển sang môi
trường có nồng độ auxin thấp và nồng độ cytokinin. Các cytokinin thường hay dùng là
BAP và kinetin. Cho thêm các chất như casein, lactoabumin thủy phân và nước dừa
thường làm gia tăng tỉ lệ tái sinh cây nhất là đối với các cây ngũ cốc.
Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thường cho tỉ
lệ tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc
thường có hiện tượng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977)
thấy rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao.
Ngoài ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-
Ping, 1978).
Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhưng ở một số loài cây có cả cây
nhò bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhò
bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự
phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
III.Ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn.
Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghóa thực tiễn lớn, trước hết là làm nguyên liệu
để tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lương bội hóa các cây đơn bội bằng xử
lí consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Như đã nói


Cây lưỡng bội Dòng thuần Dòng siêu chủng
Phần 3: CHỌN DÒNG TẾ BÀO THỰC VẬT (CDTBTV).
I.Cơ sở khoa học.
Cơ sở khoa học đầu tiên của CDTBTV là tế bào thực vật mang tính toàn năng. Mỗi
loài thực vật có khả năng tái sinh khác nhau.
Cơ sở thứ hai là mô hoặc quần thể tế bào nuôi cấy bao gồm một số lượng lớn các
tế bào không đồng nhất. Vì thế quần thể tế bào nuôi cấy có thể xem như quần thể thực
vật ở đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào
được tái sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những
quần thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhưng trong suốt quá trình sinh trưởng
và phát triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay
đổi về di truyền do ảnh hưởng của các yếu tố trong môi trường nuôi cấy, đặc biệt là các
chất điều hòa sinh trưởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh
lý, di truyền và phát triển, những quần thể tế bào này là đối tượng hết sức lí tưởng trong
việc sử dụng các chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghóa. Cũng như cây
trồng, trong nuôi cấy mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một
- 6 -
loại là kết quả của sự thay đổi gen, được gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại
không liên quan đến thay đổi gen, được gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài
gen không di truyền được.
Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tượng
phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào
có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phương pháp chọn lọc nào.
Hiện tượng này gọi là hiện tượng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ
tế bào nuôi cấy là “calliclones” (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái
sinh từ protoplast là “protoclones” (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981)
đưa ra một đònh nghóa có tính chất khái quát hơn “somaclonal variation’ để chỉ tất cả
những thay đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào.
II.Vật liệu và phương pháp chọn dòng.

- 7 -
mất hẳn. Hầu hết các dòng chọn lọc thông qua hệ thống tế bào dòch lỏng đều không nhận
đïc cây (Dix, 1990). Vì thế hệ thống tế bào dòch lỏng có thể sử dụng để chọn các dòng
có khả năng tổng hợp và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trường hợp này
thì tế bào dòch lỏng đáp ứng được mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là
việc sử dụng các công nghệ nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng được nhiều mặt
trong CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào được phát
triển đồng đều trong môi trường, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô
sẹo, cuối cùng là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh được
hiện tượng khảm. Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs,
1988; Hamill & cs, 1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs,
1985) đã được chọn lọc nhờ sử dụng hệ thống protoplast.
Trước đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất
là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghóa kinh tế, nên việc sử dụng hệ
thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bò hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy
protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng như
khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã được công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật
liệu lý tưởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tượng quan
trọng trong cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là
dung hợp tế bào và chuyển gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dòch lỏng
và protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên
liệu CDTBTV. Một trong những mô phân hóa được sử dụng là phôi từ hạt (Kueh &
Bright, 1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr &
cs (1985) đã chọn được dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs
(1989) cũng nhận được dòng kháng thuốc khi xử lí mảnh lá.
Bên cạnh việc sử dụng các phương pháp chọn lọc in vitro đối với mô sẹo , tế bào
dòch lỏng, prptoplast và mô phân hóa có thể kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến để
làm tăng dần số đột biến và các kiểu đột biến. Miller & cs (1985) xử lí protoplast sau khi

– 10
-6
thì ở quần thể cây tái sinh (R
o
) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5%
(Larkin & Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy
in vitro có thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chòu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần
nghiên cứu giải quyết như vấn đề tương hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tượng
lây nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác
nhân gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dòng chòu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc
tố gây bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã được sử dụng là virus và đối tượng được lây nhiễm
là protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo được quần thể tế bào bò nhiễm đồng đều và
phân biệt được tế bào chòu bệnh với tế bào không bò nhiễm vì cả hai đều có khả năng
phát triển trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard
(1975), Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bò lây nhiễm liên tục, sau
đó nuôi vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum)
có màu vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trường phù
hợp cho sự sinh trưởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô
từ tế bào sạch virus sinh trưởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh
trưởng chậm hơn và có màu vàng.
Một số nấm và vi khuẩn gây bệnh như Phoma lingam, Plamidomonas brassicae
(Sacristan, 1955; Sacristan và Hoffman, 1979; Pullman và Rappaport, 1983; Prasad & cs,
1984), Fusarium oxysporum, Selerospora graminicola, Selerpspora sacchari (Chen & cs,
1979), Puecinia melanocepha (Peros, 1984), Phytophthora parasitica varnicotianae
(Deaton & cs, 1982), Helminthosporium sacchari (Bronson & Schffor, 1977),
Xanthomonas oryzae (Sun & cs, 1986) cũng đã được sử dụng để chọn dòng chòu bệnh.
Prasad và cs (1984) đã chọn được dòng kê ngọc kháng bệnh mốc sương bằng

bệnh. Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã được công bố khi sử dụng ĐTGB thô như khoai
tây kháng P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci,
thuốc lá kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng
F.oxysporum f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke
(1985) đã nhận được dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae
khi sử dụng độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.
Ngoài phương pháp chọn dòng chòu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế
bào, mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc
ĐTGB, ứng dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể
chọn được dòng chòu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter
& cs, 1980; Hartan & cs, 1984; Pullman & cs, 1983; Sacristan, 1982) đã chọn các dòng
chòu bệnh theo phương pháp này. Giống mía chòu bệng Fiji (Krishnamurthi & Tlalka,
1974) và giống lhoai lang “Sarlet” chòu bệnh (Moyer & Collins, 1983) đã được chọn và
đưa vào sản xuất. Hiện nay khi việc tái sinh cây từ tế bào hoặc mô đã trở nên dễ dàng
đối với hầu hết các giống cây thì chọn lọc theo hướng này có nhiều hứa hẹn và trên thực
tế đã có các giống chòu bệnh đïc đưa vào sản xuất nhưng có một số mặt hạn chế của
phương pháp này: Thứ nhất là phải thử nghiệm một quần thể lớn cây tái sinh trong điều
- 10 -
kiện tự nhiên; thứ hai là phân dòng sôma làm thay đổi nhiều đặc điểm khác nên nhiều
khi chọn được dòng chò bệnh nhưng lại ảnh hưởng đến đặc điểm kinh tế (Bidney &
Shepard, 1981).
Nhìn chung đã có nhiều công trình mở ra triển vọng trong việc sử dụng nuôi cấy
mô và tế bào để chọn dòng chòu bệnh ở cây trồng nhưng cho đến nay vẫn còn nhiều vấn
đề cần giải quyết như cơ chế tương hợp giữa chủ (mô hoặc tế bào) với các tác nhân gây
bệnh, liên quan đến vấn đề này là cơ chế nhiễm bệnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro.
Một vấn đề quan trọng nữa là xác đònh được vai trò của các ĐTGB trong quá trình chọn
lọc in vitro. Một số vấn đề liên quan về mặt kó thuật trong nuôi cấy mô và tế bào là rút
ngắn thời gian nuôi cấy và tái sinh cây để tránh những thay đổi về hình thái và một số
đặc điểm khác. Việc chọn lựa đối tượng để áp dụng kó thuật nuôi cấy mô và tế bào vào
chọn dòng chòu bệnh cũng rất quan trọng. Một số tác giả khác cho rằng nuôi cấy mô, tế