18
z
Công nghệ sinh học
ĐộngVât


ĐỀ TÀI
Công nghệ sinh học động vật
Giáo viên h
Giáo viên h
ướng dẫn
ướng dẫn
: Ths Quan Quốc Đăng
: Ths Quan Quốc Đăng
Sinh viên thực hiện
Sinh viên thực hiện
:
:
18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât
LỜI CẢM ƠN
Với nhu cầu tìm tòi, học hỏi và trao đổi kinh nghiệm, nhóm chúng em đã cùng
nhau thảo luận và hình thành nên một bài tiểu luận về đề tài thuộc Công nghệ sinh học
động vật. Nhóm sẽ không thể hoàn thành nếu không có sự giúp đỡ cũng như sự hướng
dẫn tận tình của thầy Quan Quốc Đăng – Thạc sĩ và cũng là giáo viên phụ trách bộ
môn Công nghệ sinh học động vật. Đồng thời toàn thể nhóm cũng muốn gửi lời cảm
ơn về phía trường Đại học Công nghiệp TpHCM đã hỗ trợ cho chúng em trong quá
trình hoàn thành bài tiểu luận bằng cách cung cấp những kiến thức cơ bản thông qua
sự trao đổi trực tiếp giúp chúng em định hướng được mình nên làm những gì.
Tuy nhiên đây là lần đầu tiên chúng em được tiếp cận với môn học này cho nên

2.3.4.1 Việc sử dụng các tế bào tế bào toàn năng(pluripoten) và thế hệ của
chimaerae
Các tế bào tế bào toàn năng có thể tạo ra tất cả các bộ phận cơ thể của một sinh
vật (Hình 2,1).Phương pháp thu nhận các tế bào tế bào toàn năng đang được sử dụng là
đưa nó vào phôi sớm khi đang ở giai đoạn cầu morula hoặc phôi nang, sau đó sẽ phát
triển tới chimaeric. Cần nhớ lại rằng một Chimaera được hình thành bởi các tế bào hỗn
hợp từ động vật khác nhau. Mỗi tế bào Chimaera, bao gồm các giao tử, bắt nguồn từ
người cho hoặc người nhận phôi. Đây là những khác biệt cơ bản của cơ thể lai, do bộ
gen từ hai sinh vật đang ở trong cùng một tế bào sau quá trình thụ tinh.
Dòng tế bào tế bào toàn năng đã được thiết lập ở chuột. Các dòng tế bào có
nguồn gốc từ phôi sớm được gọi là tế bào ES (tế bào gốc phôi thai).
Các tế bào tế bào toàn năng thu được từ tuyến sinh dục của bào thai được gọi là các tế
bào EG (tế bào phôi mầm). Các tế bào toàn năng là dòng tế bào đầu tiên được bắt
nguồn từ một teratocarcinoma (một dạng u ác tính ở tinh hoàn) và do đó được gọi là
EC (tế bào phôi ung thư biểu mô). Các tế bào EC có thể tham gia vào sự phát triển của
phôi chimaeric nhưng không tham gia sự hình thành giao tử.
Chỉ có một số lượng nhỏ dòng tế bào ES có thể sử dụng. Tất cả đều là tế bào
gốc thu được từ một hay hai dòng chuột. Pluripotency có thời gian tồn tại rất ngắn.
Các tế bào Tế bào toàn năng có công suất cao để nhân giống in vitro nhưng chúng tự
phát sinh những điểm khác biệt và trở thành các tế bào multipotent (tế bào đa chức
năng). Điểm khác biệt của các tế bào tế bào toàn năng lá ở chỗ có thể tham gia vào sự
18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât
phát triển của phôi ở một mức độ nào đó nhưng không thể trở thành giao tử. Do đó các
tế bào ES phải được duy trì ở trạng thái tế bào toàn năng trong suốt toàn bộ quá trình
nhằm tạo ra các động vật chimaeric có khả năng di truyền gen của chúng cho con
cháu.
Các pluripotency của các tế bào ES được duy trì bằng cách thêm vào những
nhân tố của môi trường tự nhiên. Đã có rất nhiều nỗ lực nhằm tạo ra dòng tế bào ES từ


Ưu điểm
của
phương
pháp nối
gen là nó
dễ dàng
được
nhân
rộng. Có
thể sử
dụng số
lượng
cừu ít
hơn từ 2
đến 5 lần
so với
phương
pháp vi
tiêm để
tạo ra số
lượng
cừu
chuyển gen tương ứng. Gen hợp nhất có thể được khảo sát trong tế bào trước khi
chuyển nhân vào . Những tế bào có gen ngoại bị thay đổi hoặc có nhiều bản sao sẽ bị
loại bỏ. Giới tính động vật hoặc kiểu hình của gen cho sẽ được chọn ra. Những động
vật không thích hợp sẽ không được sử dụng cho quá trình chuyển gen. Mặc dù nhân
18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât

18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât
Những đoạn DNA không chứa các chuỗi vòng thực hiện liên kết tương đối
chậm. Và vì một số nguyên nhân chưa được làm rõ, một số DNA được thêm vào mang
đến cho chúng ta 1 số lượng lớn những loài động vật chuyển gen hơn là những DNA
cùng loại khác. Một mặt, những DNA này có thể được sinh ra bởi sự xuất hiện của
những chuỗi có khả năng nhận dạng các đoạn gen thường gặp trong đoạn thêm vào.
Mặt khác, vài đoạn được nối có thể chứa những chuỗi thiên về sao chép, và sự hiện
diện của chúng trong phôi hỗ trợ đáng kể cho quá trình liên kết.
2.3.5.2 Những vectơ mang trình tự gen được lặp đi lặp lại
Cơ chế của quá trình tích hợp được mô tả ở mục 2.3. dẫn đến phát hiện sự lien
quan giữa những trình tự của đoạn chêm vào và trong bộ gen. Sự kết hợp này thường
nên được tối ưu hóa bằng sự có mặt của cả 2 bộ ba kết thúc, mà 1 nằm trong đoạn
chêm được sao chép 1 cách gần như hoàn chỉnh từ bộ gen ban đầu, ngay cả khi chúng
bị làm cho kém đi hoặc thoái hóa hơn.Từ một số thí nghiệm, ta thấy điều này là đúng.
Ở bò, 1 trình tự xuất hiện nhiều lần tại trung đoạn và được gắn vào trung đoạn để thúc
đẩy cho quá trình liên kết. Trong trường hợp cá biệt này, hoạt động chuyển gen vẫn ở
dạng tĩnh. Điều này dẫn đến việc trung đoạn – vùng không xảy ra quá trình sao chép –
cũng xuất hiện sự chuyển gen. Một số thử nghiệm đã được tiến hành trên chuột, nơi
đoạn Alu được sử dụng làm vật chất sao chép. Đoạn Alu, chứa khoảng 200 – 300
nucleotide, có số lượng khá dồi dào trong bộ gien của động vật có vú, đặc biệt trong
những khu vực hiếm hoặc không xảy ra sự sao chép. Một số đoạn Alu được sao mã
bởi RNA polymerase III, làm tăng hoạt độ của những ARN có chức năng chưa rõ ràng
hoặc vô hiệu. Nhiều thí nghiệm với sự tham gia của một nhóm các nhà nghiên cứu cho
thấy rằng tần suất liên kết được gia tăng khi ta gắn vào đó trình tự có chứa đoạn Alu.
Tuy nhiên, kết luận này lại không được một nhóm khác chấp nhận, vì họ cho rằng,
hiệu quả trên có thể yếu đi phụ thuộc đoạn gắn vào
2.3.5.3 Vector transposon
Transposons là những đoạn gen dài dưói 2 kb, mà nhiều bản sao của nó sẽ xuất

toàn và hiệu quả để sử dụng trong liệu pháp gen. (Hackett et al., 2001).
Còn có các vector khác để tạo ra gen chuyển trong côn trùng như là Aedes,
Aegypti hay con tằm. (Tamura et al., 1999).
Trong tất cả các trưòng hợp thì transposon và plasmid mã hóa cho transposase
phải được tiêm vào phôi dưới các điều kiện lệ thuộc vào từng loại sinh vật. Trong mối
liên hệ này thì phôi gà được xem là khác biệt nhất so với các dạng sinh vật khác. Thật
sự thì việc tiêm có thể thực hiện trong 1 phôi chỉ mới ở giai đoạn 1 tế bào mà không
thể thực hiện được khi phôi đang phát triển như là ở các dộng vật có vú .
Phôi đã được tiêm phải ở giai đoạn còn là lòng đỏ trứng và phải chưa có dự
làm tổ. Sau vài tuần ủ trứng dưới các điều kiện thích hợp thì gà chuyển gen sẽ được ra
đời với tỷ lệ thành công chấp nhận được.
Do đó các vector transposon có thể cho phép tạo ra các gen chuyển đổi trong
các sinh vật mà thường thì kĩ thuật vi tiêm không đạt được kết quả. Phương pháp này
tương đối an toàn, bởi vì ngay cả khi thiếu gen transposase thì vector transposon vẫn
có khả năng sao mã và hòa nhập vào bộ gen của tế bào chủ dù là với hiệu suất thấp ,
việc này có liên quan đến sự hiện diện của transposase nội sinh trong tế bào chủ và nó
có thể hạn chế công dụng của transposon trong một số trường hợp. Trong khi đó
transposon B A C ở lợn được dùng để tạo ra con tằm chuyển gen nhằm duy trì chất
lượng ổn định qua nhiều thế hệ.
Transposon chỉ có thể mang 1 mảnh DNA lạ với một độ dài nhất định. Điều
này rõ ràng là một giới hạn nếu cấu trúc tinh vi được dùng để thể hiện cho 1 gen lạ.
Hơn nữa cơ chế của tế bào để làm lu mờ transposons có thể làm ức chế sự biểu hiện
của gen chuyển trong một số trường hợp.
2.3.5.4 Vector Retroviral
Là những vector được sử dụng cho liệu pháp gen. Những vectơ virus retro
khác nhau được thiết kế nhằm tạo ra động vật biến đổi gen và đặc biệt là gà (Ronfort,
Legras và Verdier, 1997). Những vectơ này có lớp màng có khả năng nhận biết các tế
bào phôi thai gà. Những vectơ có thể được đưa vào trứng mới đẻ. Ở giai đoạn này, các
tế bào vẫn còn tế bào toàn năng và có thể tham gia trong một thế hệ giao tử, nhờ đó bộ
gen của chúng có thể được chuyển cho các thế hệ con cháu. Cách tiếp cận này tỏ ra

Các vectơ đã có thể điều khiển sự biểu hiện của gen EGFP ở chuột, cho bột
huỳnh quang màu xanh lá cây trong tất cả các loại tế bào hoặc chỉ ở cơ bắp khi hoạt
động quảng bá trong tất cả các loại tế bào trong cơ bắp hoặc chỉ được sử dụng tùy từng
trường hợp.
Cần những con chuột được sinh ra biến đổi gen. Khoảng 90 phần trăm của những con
chuột bày tỏ sự chuyển gene của họ mà không cần bất cứ im lặng trong nhiều thế hệ.
protein VSV đã được sử dụng như là một màng bao để cho phép nhiễm trùng hiệu quả
của các tế bào phôi thai.
Các tác giả của nghiên cứu này đã được xem xét những thuận lợi và các giới
hạn của thực phẩm này. Những lợi thế lớn rõ ràng là tỷ lệ cao hiệu quả và thực tế là bị
nhiễm trùng có thể được thực hiện bằng cách ủ phôi rỗng của vùng pellucida. Một thao
tác tương đối đơn giản của phôi như vậy là đủ. Phương pháp này được mở rộng tới các
động vật có vú khác không có vấn đề cụ thể. Nó sẽ đặc biệt thuận lợi ở chuột, nơi mà
các phương pháp vi tiêm rất khó khăn để sử dụng.
Các giới hạn của công cụ này nhiều càng tốt. Số lượng lớn của các hạt virus
phải được chuẩn bị với một kiểm soát an toàn sinh học thích hợp. Bước này đã trở nên
ngày càng được chuẩn hóa như là kết quả của việc sử dụng ngày càng tăng các loại véc
tơ cho liệu pháp gen. Những đoạn DNA không quá 7-9 KB có thể được mở đầu cho
các vector. Những biểu hiện của gen báo cáo là khá thấp trong trường hợp này. Mặt
khác, tích hợp độc lập của vectơ xảy ra trong cùng một phôi, dẫn đến động vật biến
đổi gen khảm. điều này có thể hơi phức tạp việc giải thích của dữ liệu.
Rõ ràng, công cụ này xuất hiện có thể thay thế vi tiêm trong một số trường hợp, nhưng
không phải trong tất cả.
2.3.5.5 Vectơ bổ sung
Sự thuận lợi của quá trình kết hợp là DNA ngoại được truyền lại cho thế hệ con
cháu một cách ổn định. Trở ngại chính của việc kết hợp là hiệu suất thấp và hiếm khi
18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât
xảy ra. Một khó khăn khác, sẽ được thảo luận ở chương 2.3.11 đó là gene kết hợp chịu

18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât
trong sinh vật nhân chuẩn bậc cao bởi vì chúng không hoạt động được trong tế bào
động vật. Những vecto này được sử dụng chủ yếu cho kỹ thuật DNA và tái tổ hợp
DNA nhằm mục đích nghiên cứu và đưa vào trong tế bào động vật.
Những vecto vi khuẩn có thể chỉ chứa đúng đoạn khởi đầu cho sao chép. Số
lượng bản sao có được sao mỗi lần sao chép DNA là đủ để thống kê được sự chuyển
của vecto vào tế bào con cháu.
Figure 2.14: Cấu trúc của 1 vecto YAC (nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo).
Vecto này bao gồm vùng khởi đầu phiên mã DNA (ARS 1), vùng centromere (CEN
4), có chức năng truyền những vecto đã được sao mã đến các dòng tế bào con cháu,
telomeres chức năng bảo vệ DNA khỏi tác dụng của exonucleases, 2 gene lựa chọn
(TRP 1 và UR 3) và vùng nhân bản có khả năng chưa đoạn gene khoảng 1000kb
Trong nấm men, một loại vecto mạch thẳng gọi là YAC đã được thiết kế
(Figure 2.14). Chúng chứa đoạn telomeres, đoạn mở đầu sao chép (ARS 1), đoạn
centromere (CEN 4), gene lựa chọn (Ura 3) và vùng nhân bản. Vecto này tương đối
nhỏ gọn và dễ dàng thao tác. Điều này là do vùng mở đầu sao chép và vùng
centromere tương đối ngắn. Vùng khởi đầu sao chép ở Saccharomyces cerevisiae chỉ
chiếm một vị trí nhỏ trên chuỗi gene. Đối với Saccharomyces pombe thì ngược lại,
vùng khởi đầu sao chép của nó kéo dài vài ngàn base. Những vecto YAC này có thể
gắn những mảnh DNA dài khoảng 1000kb và có thể dược đưa vào nấm men do tái kết
hợp tương đồng. Hạn chế lớn nhất của YAC là kém ổn định (Giraldo and Montoliu,
2001).
Vecto BAC được thiết ké với mục đích sao chép trong E.coli và chỉ hiện diện
một bản sao mỗi tế bào. Vecto BAC có thể gắn một DNA 250kb sau đó được đưa vào
vi khuẩn bằng cách tái kết hợp tương đồng. việc này cho phép xóa và thêm mảnh DNA
18
Công nghệ sinh học
ĐộngVât

Công nghệ sinh học
ĐộngVât
Một số loại virus có hệ gene dạng vòng, có khả năng tái bản với hiệu suất cao
trong tế bào động vật và được truyền cho thế hệ tế bào sau. Đó là trường hợp của virus
SV 40.
Nhiều nghiên cứu về đoạn mở đầu sao chép ở SV40 đã được nghiên cứu rộng
rãi. Cấu trúc của nó tuy ngắn nhưng đòi hỏi sự mã hóa kháng nguyên T bởi các thành
phần của tế bào và hệ gene SV 40 để có thể được sao chép. Vecto SV 40 chuyển vào tế
bào con để tổng hợp kháng nguyên T (tế bào Cos) thường được sử dụng trong phòng
thí nghiệm để thể hiện gene ngoại lai với hiệu suất cao. Loại vecto này không sao chép
được trong tế bào không phải linh trưởng (non-primate)do đó không thể sử dụng được
trong việc tạo ra động vật biến đổi gene.
Virus Herpes vẫn ở trạng thái tiềm ẩn trong các tế bào nhiêm bệnh. Mỗi tế bào
chứa một hoặc vài bản sao của bộ gene virus và sau đó được chuyển cho dòng tế bào
con cháu. Trong vài trường hợp nhất định, đặc biệt là khi các vi sinh vật bị nhiễm bệnh
chúng sẽ bị suy giảm miễn dịch, lúc đó bộ gene của virus kí sinh có cơ hội tái bản với
hiệu suất cao, dẫn đến trạng thái bệnh lý. Đó là trường hợp của virus Herpes đơn hình,
cytomegalovirus , Epstein±Barr virus và một số giống khác.
Các virus này có vùng khời điểm tái bản và một hệ thống tâm động giả. Hai yếu
tố này được nghiên cứu kĩ ở virus Epstein-barr (Ebv) . Những vùng có kích thước tối
thiểu cần thiết cho sự tái bản của gen EBV và sự di truyền của chúng cho tế bào con là
vùng khởi điểm tái bản P (ori P)và gen EBNA 1. Vùng khởi điểm tái bản P chứa hai
vùng có chức năng riêng biệt. Cả hai đều bám vào protein EBNA 1. Một vùng của
khởi điểm tái bản P làm đúng chức năng khởi điểm tái bản. Vùng thứ hai là cần cho sự
truyền gen của virus cho tế bào con.
Các kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng khởi điềm tái bản của EBV chỉ hoạt
động ở tế bào linh trưởng và chó. Nhiều thử nghiệm đã cho thấy vùng khởi điểm tái
bản EVB có thể bị xóa và được thay thế bằng các đoạn DNA người và động vật có vú
khác. Một số các đoạn DNA chứa vùng khởi điểm tái bản cho phép vecto được tái bản
và truyền lại cho tế bào con ví dụ như ở ở chuột chuyển gen (Kelleher et al, 1998) tuy

trường. Điều này có thể tránh bằng cách bỏ các phần khởi điểm tái bản ở prokaryote
Một cách khác tương đối khả thi trong việc tạo ra các vecto độc lập là sử dụng
các đoạn DNA dài chứa các khởi điểm tái bản tự nhiên, một tâm động và các telomere.
Các vecto này là nhiễm sắc thể nhân tạo của người (HACs), chỉ có thể có sau khi xảy
ra đột biến ngẫu nhiên loại bỏ 1 phần nhiễm sắc thể, giữ lại một vài yếu tố tối thiểu để
tạo thành một hệ thống tự chủ (Vos, 1998; Voet et al…2001) Những thao tác này
không dễ dàng điều khiển và đặc biệt khó khăn khi đưa các gen ngoaị lai vào chúng.
Hơn nữa các đoạn gen dài chứa rất nhiều gen quan trọng có thể gây trở ngại đến hoạt
động sinh lý của động vật hoặc với các gen quan tâm khi nó được bổ sung thêm vecto
Một nhiễm sắc thể chuột kích thước 60Mb gồm DNA vệ tinh gần trung tâm từ
chuột được tạo ra trong một dòng tế bào lai của động vật gặm nhấm/ người. Cấu trúc
này tồn tại trong một thời gian dài trong các tế bào nuôi cấy, và đang được tìm hiểu để
chuyển gen chuột vào cũng như duy trì qua các thế hệ sau (Co Et Al , 2000)
Vài năm trước đây, một nghiên cứu cho rằng nhiễm sắc thể số 2 của người có
thể chuyển vào bộ gen chuột, duy trì và chuyển cho thế hệ sau. Nhiễm sắc thể 2 của
người được chuyển từ nguyên bào sợi của người sang tế bào gốc phôi chuột bằng dung
hợp tế bào. Các tế bào gốc phôi mang nhiễm sắc thể của người đã được sử dụng để tạo
ra chuột chuyển gen thể khảm. chuột chuyển gen thể khảm này đã biểu hiện gen
globulin miễn dịch nằm trên Nhiễm sắc thể 2 vì vậy ta thu được kháng thể đơn dòng từ
chuột này (tomizuka et al, 1997)
Vecto thể bổ sung sẽ hữu ích cho các nhà nghiên cứu cho việc nghiên cứu gen
trong tế bào bị nhiễm cũng như liệu pháp gen và tạo giống động vật biến đổi gen. Tuy
chậm nhưng có tiến bộ đáng kể và đang được thực hiện trong lĩnh vực này.