NGUYỄN TRỌNG HẢI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN TRỌNG HẢI

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β - AGARASE
SẢN XUẤT PREBIOTIC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2014A
Hà Nội - 2016


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

NGUYỄN TRỌNG HẢI

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA β - AGARASE
SẢN XUẤT PREBIOTIC

CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2016

Nguyễn Trọng Hải

Nguyễn Trọng Hải

i


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là kết quả nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học
của TS Đỗ Biên Cương. Các kết quả nghiên cứu trong luận văn hoàn toàn trung thực,
các số liệu, tính toán là hoàn toàn chính xác và chưa được công bố trong bất kỳ các
công trình nghiên cứu nào (ngoại trừ các bài báo của tôi và thầy hướng dẫn có nội
dung liên quan đến luận văn).
Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được
thu thập và sử dụng nguồn dữ liệu mở hoặc được trích dẫn rõ nguồn gốc.
Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với sự cam đoan trên.

Hà Nội, ngày 9 tháng 5 năm 2016

Nguyễn Trọng Hải

Nguyễn Trọng Hải

ii


Nguyễn Trọng Hải

iii


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

1.3.3. Hoạt tính sinh học ................................................................................ 16
1.3.4. Phương pháp sản xuất agaro - oligosaccharide ..................................... 17
1.3.5. Ứng dụng agaro - oligosaccharide ........................................................ 20
1.4. Tình hình nghiên cứu về agarase và AOS ở Việt nam ................................. 21
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 22
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị máy móc ........................................................ 22
2.1.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................. 22
2.1.2. Môi trường ........................................................................................... 22
2.1.3. Hóa chất ............................................................................................... 23
2.1.4. Các loại dung dịch và đệm ................................................................... 23
2.1.5. Máy móc và thiết bị ............................................................................. 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 25
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật ....................................................................... 25
2.2.2. Phương pháp hóa sinh .......................................................................... 27
2.2.3. Định tên vi sinh vật bằng sinh học phân tử ........................................... 33
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 37
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 38
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp agarase
.......................................................................................................................... 38
3.1.1. Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp agarase ............. 38

3.5.5. Xác định các thông số động học phản ứng............................................ 60
3.6. Thăm dò khả năng chuyển hóa agarose tạo AOS......................................... 61
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 66
PHỤ LỤC.............................................................................................................. 74

Nguyễn Trọng Hải

v


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng việt

Tiếng Anh

BLAST

Basic local alignment search tool

bp

Base pair


ĐC

Đối chứng

EDTA

Ethylenediamine tetraacetic acid

EGTA

Ethylene glycol tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

FDA

Food and drug administration

Cục quản lý thực phẩm
và dược phẩm Hoa kỳ

FAO

Food and agriculture organization

Tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên Hiệp
Quốc

MEA

Malt Extract Agar

Môi trường MEA

NB

Nutrient Broth

Môi trường NB

kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

OD

Optical density

Mật độ quang

PCR

Polymerase chain reaction


Tris-boric-acid EDTA

TE

Tris - EDTA

TEMED

N,N,N’,N’-

Số vòng/phút

Tetramethylethylenediamine
TLC

Thin Layer Chromatography

Sắc ký lớp mỏng

v/v

Volume/volume

Thể tích/thể tích

v/v/v

Volume/volume/volume

Thể tích/thể tích/thể tích

Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ ammonium sulfate bão hòa đến hiệu suất thu nhận
agarase .................................................................................................................. 55
Bảng 3.6. Thông số kỹ thuật các bước tinh sạch agarase từ chủng Penicillium

sp.

HL28 ..................................................................................................................... 57
Bảng 3.7. Đặc hiệu cơ chất của agarase từ Penicillium sp. HL28 ........................... 57
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ agarase từ Penicillium sp. HL28
.............................................................................................................................. 60

Nguyễn Trọng Hải

viii


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của agarose . .............................................................................. 3
Hình 1.2. Các loài tảo đỏ sản xuất agar ................................................................... 4
Hình 1.3. Sơ đồ vị trí phân cắt của agarase ............................................................. 6
Hình 1.4. Cấu trúc không gian của β - agarase . ....................................................... 7
Hình 1.5. Sơ đồ hai cơ chế hoạt động của glycoside hydrolase ............................... 8
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học của các oligosaccharide từ agarose ............................. 14
Hình 1.7. Cấu trúc của agaro - oligosaccharide ...................................................... 16
Hình 1.8. Quy trình sản xuất AOS bằng β - agarase. .............................................. 17
Hình 1.9. Các phương pháp thu nhận agaro - oligosaccharide. ............................... 20

HL28. .................................................................................................................... 51
Hình 3.12. Ảnh hưởng pH ban đầu của môi trường nuôi cấy đến sinh tổng hợp agarase
của Penicillium sp. HL28 ...................................................................................... 53
Hình 3.13. Đồ thị động thái sinh trưởng của Penicillium sp. HL28 ........................ 54
Hình 3.14. Sắc ký đồ tinh sạch agarase trên cột lọc gel Sephadex G-50 (A) và hình
ảnh điện di protein sản phẩm tinh sạch (B). ........................................................... 56
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính agarase từ Penicillium sp. HL28.
.............................................................................................................................. 58
Hình 3.16. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ agarase từ Penicillium sp. HL28 ......... 59
Hình 3.17. Phương trình động học Lineweaver-Burk đối với cơ chất agarose. ....... 61
Hình 3.18. Hình ảnh phổ chạy sắc ký TLC sản phẩm thủy phân cơ chất agarose của
agarase tinh sạch từ Penicillium sp. HL28. ............................................................ 62
Hình 3.19. Phổ khối LC-MS của các mẫu thủy phân.............................................. 64

Nguyễn Trọng Hải

x


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học
MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước có tài nguyên sinh học rất phong phú và đa dạng. Việc khai
thác tài nguyên sinh học này được thực hiện bằng các nghiên cứu đa dạng sinh học
của mỗi loài sinh vật, nhằm tìm ra những đặc tính mới sử dụng cho nghiên cứu và
ứng dụng trong cuộc sống. Các nghiên cứu về enzyme thường được bắt đầu từ các
nguồn tự nhiên thông qua việc phân lập và sàng lọc. Từ đó thuần hóa chủng vi sinh
vật đã phân lập được hay dùng các biện pháp khác nhau đột biến chủng để đạt được

Việc tìm kiếm chủng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp agarase để ứng dụng
trong nghiên cứu sinh học và thực phẩm, đặc biệt để thủy phân cơ chất agar tạo AOS
là một việc làm rất có ý nghĩa, hiệu quả cao.
Xuất phát từ những vấn đề trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài:
“Thu nhận và xác định đặc tính của β-agarase sản xuất prebiotic”.
Nội dung nghiên cứu gồm:
- Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật sinh tổng hợp agarase.
- Xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh tổng hợp agarase cao cho chủng
lựa chọn.
- Tinh sạch agarase.
- Xác định tính chất agarase.
- Bước đầu thăm dò khả năng ứng dụng agarase thủy phân agarose tạo prebiotic
agaro - oligosaccharide (AOS).

Nguyễn Trọng Hải

2


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học
Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. Agar
1.1.1. Cấu tạo
Agar là một loại polysaccharide được sử dụng rất phổ biến trong cuộc sống. Nó
là thành phần chủ yếu được tìm thấy trong thành tế bào của tảo đỏ. Agar được cấu
tạo từ hai thành phần là agarose và agaropectin [4]. Agarose được hình thành từ các
gốc β - D - galactose và 3,6 - anhydro - α - L - galactose (3,6 - A,G) kết hợp với nhau

Lớp: Florideophyceae.
Bộ: Gelidiales
Họ: Gelidiaceae
Chi: Gelidium
Loài:

G. sesquipedale
G. amansii
G. robustum
G. pristoides
G. canariense
G. rex, G. chilense, ...

Chi: Gelidiella
Loài:

G. acerosa

Chi: Pterocladia
Loài:

P. capillacea
P. lucida

Bộ: Gracilariales
Họ: Gracilariaceae
Chi: Gracilaria
Loài:

G. chilense, G. gigas.

nhau cũng khác nhau; tuy nhiên tất cả các loại agar có một số tính chất lý hóa như
sau:
- Tính tan: Agar không tan trong nước lạnh, tan nhẹ trong ethanolamine và tan tốt
trong formamide. Ở trạng thái ẩm có thể tan tốt trong nước ở 25oC, ở trạng thái sấy
khô agar chỉ tan trong nước nóng. Agar sẽ đông lại ở 40 - 50oC và nóng chảy ở 80 85oC.
- Khả năng tạo gel: Agar tạo thành gel sau khi được đun nóng và làm lạnh mà không
cần bổ sung thêm các tác nhân tạo gel, trong khi carrageenan cần kali hay protein để
tạo gel, alginate cần canxi hay các cation hóa trị hai và pectin cần nồng độ đường cao
hoặc môi trường axit để tạo gel. Các phân tử agarose trong agar có sự biến đổi từ cấu
trúc cuộn sang cấu trúc xoắn và sau đó các chuỗi xoắn tạo thành một mạng lưới không
gian ba chiều nhốt các chất khô bên trong nhờ lượng liên kết hydro rất lớn trong
agarose. Khả năng tạo gel và độ bền gel phụ thuộc vào nồng độ agar và phân tử lượng
trung bình (phân tử lượng trung bình càng lớn thì gel tạo thành càng bền). Dung dịch
có chứa 1,5% agar sẽ tạo gel ở nhiệt độ 32 - 43oC và không tan chảy dưới 85oC. Đây
là đặc tính quan trọng của agar so với các tác nhân tạo gel khác.
- Tính chịu nhiệt: Agar có khả năng chịu nhiệt rất tốt, tính chất tạo gel không thay đổi
ở nhiệt độ cao hơn 100oC, cho phép khử trùng tốt.
- Độ nhớt của agar phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu. Nói chung độ nhớt của agar
tương đối ổn định ở pH 4,5 - 9,0. Agar có thể sử dụng tốt trong khoảng pH 5 - 8.
- Agar có khoảng lưu giữ và tăng cường mùi vị của sản phẩm khi trộn lẫn, có vai trò
cố định mùi vị của thực phẩm.
- Agar tạo gel không có hương vị và có màu trong suốt nên có thể dễ dàng bổ sung
thêm đường, glucose, glycerine,.. làm cho thực phẩm có độ sánh hấp dẫn.

Nguyễn Trọng Hải

5


Luận văn thạc sỹ khoa học

tín hiệu. Cấu trúc β - agarase JAMB-A94 gồm hai phần là vùng xúc tác GH16 (trình
tự amino acid 19 - 300) và 6 vùng CBM (trình tự amino acid 301 - 433) [17].
Agarase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và cấu trúc khác nhau.
Sự khác nhau giữa cấu tạo của các agarase thể hiện sự đa dạng về khối lượng phân
tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi polypeptide. Sự khác
nhau về cấu trúc của enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp trong không gian các chuỗi
polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác
nhau về cấu trúc không gian của các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về tính chất
lý hóa của chúng.

Hình 1.4. Cấu trúc không gian của β - agarase [34].
1.2.3. Cơ chế tác dụng
Agarase thuộc nhóm glycoside hydrolase thủy phân liên kết glycoside của
agarose để tạo thành các oligosaccharide. Do vậy, cơ chế tác dụng của agarase cũng
tương tự như cơ chế tác dụng của glycoside hydrolase. Cơ chế xúc tác của glycoside
hydrolase theo hai đường hướng: cơ chế giữ lại và cơ chế đảo ngược [12].

Nguyễn Trọng Hải

7


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

Hình 1.5. Sơ đồ hai cơ chế hoạt động của glycoside hydrolase [12].
1.2.4. Tính chất
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, mà mỗi loại enzyme khác nhau
cũng có đặc tính khác nhau.

tính hay pH kiềm yếu. β - agarase tái tổ hợp được mã hóa từ gen rAgaC của Vibrio
sp. PO-303 và rPagA của Pseudomonas sp. SK38, hoạt động tốt ở môi trường có pH
tương ứng là pH 6,0 [15] và pH 9,0 [35].
1.2.5. Nguồn thu nhận agarase
Agarase được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm: nước biển, tảo biển,
trầm tích biển, động vật thân mềm biển, nước ngọt và ở cả đất.
Agarase thuộc nhóm glycoside hydrolase có khả năng thủy phân agar, nên
agarase có thể được phân lập từ rễ cây của tảo đỏ ở bờ biển phía Nam đảo Hải Nam
của Trung Quốc [65], hay được phân lập trong bã thải tảo biển của Niebla ở Chile,
trong Halifax ở Canada và trong bã tảo Porphyra tại Nhật Bản. Hoạt tính agarase
được tìm thấy ở các vi khuẩn trong nước biển từ Vịnh Sagami ở tỉnh Kangawa tại
Nhật Bản, biển Địa Trung Hải ở Pháp hay vịnh San Vicente ở Chile, North Wales ở
Anh [68]. Trong trầm tích biển cũng phân lập được nhiều chủng vi sinh vật có khả
năng sinh tổng hợp agarase như ở vịnh Ise tại Nhật Bản, ở bờ biển Hạ Môn phía Đông
của Trung Quốc. Ở một vài loài động vật thân mềm biển sống cư trú trên tảo biển
cũng là nguồn cung cấp để phân lập agarase, do chúng cần sử dụng cacbonhydrate
thủy phân từ tảo để phát triển nên trong đường tiêu hóa của chúng có chứa agarase.
Agarase đã được tìm thấy trong ruột của Turbinidae batillus cornutus ở bờ biển
Kangnung tại Hàn Quốc. Trong một số nghiên cứu khác, vi sinh vật sinh tổng hợp
Nguyễn Trọng Hải

9


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

agarase cũng đã được phân lập trong môi trường nước ngọt và đất. Agarase được
phân lập từ mẫu đất từ Gifu tại Nhật Bản, ở vùng đất Kanto tại Nhật Bản hay ở

Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

Năm 2011, Uyangaa và cs đã tiến hành xác định đặc tính sinh hóa của đoạn gen
Sco3487 từ Streptomyces coelicolor A3(2) mã hóa ra hai loại enzyme Exo - và Endo
- β - agarase có khả năng tạo neoagarobiose [64].
1.2.6. Tinh sạch và đánh giá tính chất của β - agarase
1.2.6.1. Tinh sạch β - agarase
Trong sản xuất chế phẩm enzyme thì việc giữ được hoạt tính enzyme là một trong
những yêu cầu hàng đầu. Thông thường qua mỗi bước tinh sạch thì một phần enzyme
cũng như hoạt độ của chế phẩm bị mất đi, giá thành tăng cao do chi phí về thiết bị,
nguyên liệu, công sức và do mất hoạt độ. Để hạn chế tối đa sự giảm hoạt độ enzyme
trong quá trình tinh sạch cần chọn dung dịch chiết rút enzyme thích hợp, vừa cho hiệu
suất chiết xuất enzyme cao, vừa không làm biến tính enzyme. Với mục đích đó, việc
tìm được những phương pháp tách và tinh chế enzyme phù hợp là rất quan trọng.
Các β - agarase từ các chủng vi sinh vật được tinh sạch qua các bước như siêu
lọc, tủa ammonium sulfate, tủa dung môi và qua cột sắc kí (lọc gel, trao đổi ion, tương
tác kỵ nước, ...). β - agarase tinh sạch từ các chủng khác nhau có nguồn gốc khác
nhau rất khác nhau về kích thước: 100 kDa (Acinetobacter sp. AGLSL-1 [42]), 113
kDa (Bacillus sp. MK03 [59]), 33 kDa (Pseudoalteromonas sp. AG4 [10]), 54,58
kDa (Agarivorans sp. HZ105 [25]), 30 kDa (Paenibacillus sp. [29]), 59 kDa
(Microbulblfer sp. CMC-5 [57]), 105 kDa (Agarivorans gilvus WH0801 [49]), 58,7
kDa (Pseudoalteromonas hodoensis H7 [11]).
Chủng Microbulblfer sp. CMC-5 phân lập từ môi trường biển có khả năng sinh
tổng hợp β - agarase được tinh sạch 103 lần với hiệu suất thu hồi đạt 6,7% [57], từ
chủng Paenibacillus sp. tinh sạch 11,9 lần với hiệu suất thu hồi đạt 5,1% và hoạt độ
riêng là 4670,1 U/mg [29].
1.2.6.2. Tính chất β - agarase
Giá trị Km và Vmax đặc trưng cho tính đặc hiệu của một enzyme với một cơ chất,

Các ion kim loại Ca2+, Mg2+ làm tăng hoạt tính của β - agarase từ Microbulblfer
sp. CMC-5, trong khi các ion Zn2+, Hg2+, Cu2+, Fe2+ và Co2+ lại làm giảm hoạt tính
enzyme [57]. Các Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Al3+ hoạt hóa khả năng hoạt động của β agarase từ Paenibacillus sp. ở nồng độ 2 mM [29]. Ở nồng độ 0,2 mM, ion Ca2+ và
Ni+ hoạt hóa hoạt động của β - agarase từ Agarivorans gilvus WH0801, trong khi đó
các ion Cu2+, Fe2+, Mg2+ và EDTA ức chế hoạt động của enzyme [49].
1.2.7. Ứng dụng
1.2.7.1. Trong công nghệ gen nhằm thu hồi DNA từ gel agarose
Agarase được ứng dụng rất rộng rãi để thu hồi DNA từ gel agarose. Trong nghiên
cứu về sinh học thì việc sử dụng agarase để thu hồi DNA có hiệu quả hơn các phương
pháp truyền thống. Công ty Takana của Nhật Bản đã nghiên cứu và sản xuất thành
Nguyễn Trọng Hải

12


Luận văn thạc sỹ khoa học

Công nghệ sinh học

công bộ Kit tinh sạch DNA từ gel agarose nhờ β - agarase với độ bền nhiệt lên đến
60oC [56]. Agarase được phân lập từ Vibrio sp. JT0107 có thể thu hồi được 60% DNA
từ gel agarose bằng cách cho enzyme phản ứng ở 65oC trong thời gian 5 phút [68].
1.2.7.2. Tách chiết hợp chất sinh học từ tảo biển và tạo tế bào trần từ tảo biển
Agarase có tiềm năng ứng dụng thủy phân thành tế bào của tảo đỏ để thu nhận
các chất có hoạt động sinh học: vitamin, carotenoid, các axit béo không no. Agarase
cũng được ứng dụng để tạo thành các tế bào trần từ tảo biển. Tế bào trần từ tảo biển
là những vật liệu sinh học hữu ích cho các nghiên cứu sinh lý học và tế bào học, là
công cụ để phục vụ cho nhân giống cây trồng bằng cách dung nạp tế bào và các thao
tác gen [68]. Araki và cs (1998) đã thành công trong việc tạo tế bào trần từ Bangia
atropurpurea (Rhodophyta) bằng cách sử dụng ba loại enzyme là β - 1,4 - mannanase,