Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để sản
xuất enzyme Lypase với Canida sp. 99- 125


Tóm tắt lý thuyết
Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) được sử dụng để tối ưu hoá môi trường sản xuất
Lypase với Canida sp. 99- 125. Bước đầu, ma trận Plakett-Burmen đã được sử dụng để
đánh giá ảnh hưởng của các thành phần khác nhau trong môi trường nuôi cấy. Dầu đậu
nành, bột đậu nành và K2HPO4 có ảnh hưởng đáng kể đến việc sản xuất lipase. Nồng độ
của ba yếu tố được lựa chọn ở mức phù hợp nhất sau đó tổng hợp lại và phân tích bề mặt
phản ứng. Điều kiện trên cho phép xuất lipase được tăng lên 5.000-6.230 IU / ml Trong
hệ thống bình lắc. Sự lên men lipase trong 5L lên men đạt 9.600 IU / ml.
© 2006 Nhà xuất bản Elsevier B.V.
Từ khoá: Lipase, Lên men, tối ưu hoá môi trường, phương pháp đáp ứng bề mặt.


1. Mở đầu:
Lipase (EC3.1.1.3) xúc tác cho quá trình thủy phân triglyceride các acid béo và glycerol,
được sử dụng rộng rãi trong việc thay đổi thành phần chất béo và các loại dầu. Trong
những thập kỷ gần đây, lipase được chứng minh rằng có thể được sử dụng trong tổng hợp
enzyme không chứa nước cho sản xuất hợp chất quang học tinh khiết. Lipase có tiềm
năng trong công nghiệp vì là chất xúc tác cho quá trình thủy phân, tổng hợp và chuyển vị
este của tri-acyglycerols do có nhiều ưu điểm như được sản xuất nhiều và đa dạng.
Lipase từ Canida sp. là lipase có tình thương mại hoá nhất. Nó rất hữu ích trong các chuỗi
chuyển hoá sinh học. Tiêu biểu không chỉ để thuỷ phân ester, trans-esterify triglycerides,
giải quyết các hỗn hợp racemic, mà còn có thể tổng hợp este và peptide.
Hoạt động của lipase và việc sản xuất phụ thuộc vào thành phần của môi trường lên men.
Việc tối ưu hóa chung bằng cách thay đổi một tham số trong khi vẫn giữ các biến còn lại
ổn định ở mức độ liên tục. Bất lợi duy nhất của việc tối ưu hóa là nó không phản ánh
những tác động tương tác giữa các biến được sử dụng và không biểu hiện chính xác hiệu
quả của các biến khác nhau dựa vào hoạt động của enzyme. Để khắc phục những vấn đề

Giống được cấy trong môi trường chứa dầu đậu nành (4%), bột đậu tương (4%),
K2HPO4 (0,1%), KH2PO4 (0,1%). Sau khi cấy ở nhiệt độ 26 oC trong 220 rpm 48 tiếng,
2ml huyền phù (3 × 108 tế bào / ml) như là chất truyền nhiễm cho bình lắc 250ml có
50ml môi trường sản xuất
2.4 Sản xuất enzyme Lipase
2.4.1 Hệ thống bình lắc
Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 25 phút. Thành phần trong môi trường và các
cấu tử được sử dụng trong thành phần biến đổi theo sơ đồ ma trận. pH ban đầu trong
khoảng từ 6 đến 7. Mẻ cấy được ủ ở 26 oC trong 120 tiếng trong vòng lắc duy trì ở 20
rpm.
2.4.2 5 lít chấy lên men
5 lít chất lên men truyền trong môi trường thuận lợi được khử trùng ở 121 oC trong 25
phút. Sau khi làm lạnh ở nhiệt độ 26 oC, quá trình lên men được khởi tạo bằng cách truyền
7% (v/v). Môi trường được ủ ở 26oC và 220 rpm.
2.5 Khảo sát hoạt tính Lipase
Hoạt tính Lipase được xác định theo phương pháp nhũ hóa dầu oliu. Axit béo tạo ra được
xác định bằng cách chuẩn độ với 0.05 mol/L NaOH. Một đơn vị tính của lipase định
nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng axit béo 1 mol trong một phút dưới nhiệt
độ 40 ◦C.


2.6 Thiết kế thí nghiệm
Trong các thí nghiệm sơ bộ, chúng ta đánh giá nhiều loại carbon và nguồn nitơ, muối vô
cơ cho sự thích nghi của vi sinh vật để duy trì quá trình sản xuất Lipase do Candida sp.
99-125. Sơ bộ dữ liệu chỉ ra rằng các yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất nuôi cấy mẻ
Lipase là dầu đậu nành, bột đậu nành, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 and
Span 60. Vì thế, 7 thành phần được chọn để tối ưu hóa thông qua RSM.
2.6.1 Thiết kế Plackett-Burmen
Các ảnh hưởng của bảy yếu tố về năng suất lipase đã được nghiên cứu sử dụng phương
pháp luận của Plackett-Burmen. Mỗi yếu tố độc lập đã được thử nghiệm ở hai cấp độ,

trùng với một bậc hai phương trình đa thức bởi một nhiều kỹ thuật hồi quy.

Y là dự đoán phản ứng, β0, βi, βii, βij là các hệ số không đổi, và xi, xj là các biến mã hóa
độc lập hoặc các yếu tố. Hình dạng của phương trình mô hình thứ hai để được thể hiện
bằng hệ số xác định R2, và ý nghĩa thống kê của nó được xác định bằng một chiếc F-test.
Ý nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm tra bằng t-test.


3. Kết quả và thảo luận
3.1. Thiết kế Plackett-Burmen
BẢNG 1
Các kết quả thử nghiệm của sản xuất lipase bởi một Plackett-Burmen thiết kế được thể
hiện trong
bảng 1. Analysed bởi phần mềm SAS, một mô hình thứ tự đầu tiên được trang bị cho các
dữ liệu thu được từ cuộc thí nghiệm. Những ảnh hưởng của bảy yếu tố: dầu đậu nành
(X1), (NH4) 2SO4 (X2), K2HPO4 (X3), KH2PO4 (X4), bột đậu tương (X5), MgSO 4
(X6) và Span 60 (X7) được tính toán là 211,5,
-40,7, -74, 1, -138,5, 24, 42.7, tương ứng. Chúng tôi thu được theo mô hình trong các
biến mã hóa.
Thứ tự đầu tiên phương trình mô hình :
Y1 (IU/ml) = 493.3 + 211.5X1 − 40.7X2 − 74X3 + X4 − 138.5X5 + 24X6 + 42.7X7
3.2. Đường dốc lên (xuống).
Dựa trên các phương trình mô hình đầu tiên để thu được và ba yếu tố ảnh hưởng quan
trọng trên, con đường dốc đi lên (gốc) đã được xác định để tìm hướng thích hợp thay đổi
biến tăng hoặc giảm nồng độ theo các dấu hiệu của tác động chính để cải thiện sản xuất
lipase. Con đường đi lên dốc bắt đầu từ trung tâm của thiết kế Plackett-Burmen và di
chuyển dọc con đường, trong đó nồng độ của dầu đậu tương tăng, trong khi bột đậu
tương và K2HPO4 giảm. Thiết kế và kết quả của con đường đi lên của các thí nghiệm
mạnh nhất là thể hiện trong Bảng 3. Người ta thấy rằng các phản ứng cao nhất được 5980
IU / ml khi vừa là: (w / v) dầu đậu tương 4,56%, bột đậu tương 5,31% và K2HPO4

nuôi cấy đại diện cho điểm tối đa và năng suất lipase 6230 IU / ml (trung bình của ba lần
lặp lại). Kết quả cải thiện khoảng 20% so với tối ưu hóa biến duy nhất của môi trường
nuôi cấy, trong đó sản lượng lipase là 5000 IU / ml. Các cũng tương quan giữa giá trị dự
đoán và đo các thí nghiệm biện minh cho tính hợp lệ của các mô hình phản ứng và sự tồn
tại của một điểm tối ưu. So với kết quả báo cáo trên, sản lượng lipase đạt 9.600 IU / ml
trong 5 l lên men (Thể hiện trong hình. 4.) cao hơn so với kết quả trong 30 l lên men đề
cập trong Ref. 15. Thời gian lên men, tuy nhiên, kéo dài đến khoảng 168 h. Người ta tin
rằng sản lượng lipase trong thang điểm 30 l lên men trong điều kiện tối ưu này sẽ cao
hơn.


4. Kết luận:
Các phương pháp đáp ứng bề mặt cho phép sàng lọc nhanh những yếu tố ảnh hưởng quan
trọng và phát triển của một mô hình đa thức để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy trong việc
sản xuất lipase từ Candida sp. 99-125. Giá trị R 2 là 0,91 cho thấy sự phù hợp của mô hình
với các dữ liệu thực nghiệm. Mô hình đã được dự đoán chính xác điểm sản xuất lipase tối
đa. Các môi trường nuôi cấy tối ưu là (w/v) dầu đậu tương 4,187%, bột đậu nành 5,840%,
K2HPO4 0,284%, KH2PO4 0,1%, (NH4) 2SO4 0,1%, MgSO4 0,05% và Span 60 0,1%.
Các mẻ lipase tăng lên đến 6230 và 9600 IU / ml trong hệ thống bình lắc và 5 l lên men
tương ứng, thực tế là cao hơn so với kết quả báo cáo.