1
1

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI: So sánh sự khác biệt trong trình tự gen sinh tổng hợp
astaxanthin ở chủng hoang dại và chủng đột biến, tối ưu hóa môi
trường nuôi cấy các chủng đột biến của nấm men Rhodosporidium
toruloides để thu nhận astaxanthin


2
2

MỤC LỤC


3
3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ATP
BBD
BP
CCD
Contig
DNA
DNA sequencing
GB
Nanowell
NCBI
NGS


DANH MỤC BẢNG


6
6

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Astaxanthin là một carotenoid màu đỏ cam có trong nhiều loài vi sinh vật và
động vật biển. Là chất có hoạt tính kháng oxy hóa mạnh nhất trong nhóm các hợp
chất thuộc carotenoid, hoạt tính kháng oxy hóa của astaxanthin gấp 10 lần
zeaxanthin, lutein, canthaxanthin, β-carotene và cao gấp 100 lần so với αtocopherol. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin ngoài tác dụng kháng oxy
hóa còn có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, ung thư, tăng cường khả
năng miễn dịch của cơ thể giúp chống lại virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Vì
có nhiều tác dụng có lợi tới sức khỏe con người nên ngày nay nhu cầu sử dụng
astaxanthin như một nguồn dinh dưỡng bổ sung hoặc thực phẩm chức năng ngày
càng tăng cao.
Ở Việt Nam, nấm men Rhodosporidium toruloides đã được phân lập và tiến
hành nhiều nghiên cứu về sự sinh tổng hợp astaxanthin trên chủng hoang dại. Năm
2017, các tác giả đã tiến hành gây đột biến ngẫu nhiên trên chủng hoang dại bằng
các tác nhân vật lý và hóa học như benomyl, ethyl methanesulfonate, ethidium
bromide, tia UV và tia Co-60, kết quả là đã thu được các chủng Rhodosporidium
toruloides đột biến cho hàm lượng carotenoid tổng và hàm lượng astaxanthin tăng
lên đáng kể so với chủng Rhodosporidium toruloides hoang dại. Tuy nhiên, các
nghiên cứu về các chủng đột biến này chỉ dừng lại ở việc làm tăng hàm lượng
carotenoid tổng và hàm lượng astaxanthin bằng đột biến ngẫu nhiên mà chưa
nghiên cứu về sự ảnh hưởng của các yếu tố về môi trường dinh dưỡng, điều kiện
nuôi cấy lên sự phát triển và sinh tổng hợp astaxanthin. Ngoài ra, khi tiến hành các
phương pháp đột biến ngẫu nhiên thì các chủng đột biến tạo thành vẫn chưa xác



8
8

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về astaxanthin
2.1.1 Giới thiệu
Astaxanthin là một xanthophyll carotenoid được tìm thấy trong nhiều loài vi
sinh vật và động vật biển. Astaxanthin có màu đỏ và tan hoàn toàn trong chất béo,
chúng không có hoạt tính của tiền vitamin A trong cơ thể con người nhưng lại có
hoạt tính kháng oxy hóa mạnh hơn nhiều hợp chất khác thuộc nhóm carotenoid [1].
Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (USFDA) đã cấp phép cho việc sử
dụng astaxanthin làm chất màu phụ gia thực phẩm trong thức ăn chăn nuôi cho
động vật và thức ăn cho cá [2]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng astaxanthin có khả
năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch, ung thư, tăng cường khả năng miễn dịch
của cơ thể giúp chống lại virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng. Vì có nhiều tác
dụng có lợi tới sức khỏe con người nên ngày nay nhu cầu sử dụng astaxanthin như
một nguồn dinh dưỡng bổ sung hoặc thực phẩm chức năng ngày càng tăng cao [3].
2.1.2 Nguồn thu nhận
Trong tự nhiên, astaxanthin được tìm thấy chủ yếu tảo, nấm men, các loài cá
hồi, tôm và một số loài vi sinh vật khác (Bảng 2.1). Astaxanthin sản xuất cho
thương mại hiện nay chủ yếu thu nhận từ nấm men đỏ Phaffia rhodozyma, vi tảo lục
Haematococcus pluvialis và thông qua tổng hợp hóa học, trong đó vi tảo lục
Haematococcus pluvialis là một trong những nguồn thu nhận tốt nhất của
astaxanthin tự nhiên [4]. Tôm, cua và cá hồi có thể là nguồn cung cấp astaxanthin tự
nhiên cho con người tốt nhất thông qua chế độ ăn hợp lý, trung bình một người có
thể ăn 165 gram cá hồi mỗi ngày để có được 3,6 mg astaxanthin, đây cũng là lượng
astaxanthin cần thiết tạo ra nhiều lợi ích sức khỏe cho con người theo báo cáo của
Iwamoto và cộng sự [5].

0,02
0,01
2,2
0,5
0,2
0,12
0,015

Hình 2.1: Vi tảo lục Haematococcus pluvialis [6]
2.1.3 Đặc tính hóa sinh
Astaxanthin có công thức phân tử là C40H52O4 và khối lượng phân tử là
596,84 g/mol. Astaxanthin có cấu trúc bao gồm hai vòng β-ionon được nối với nhau
bởi một chuỗi polyene, phân tử astaxanthin có hai carbon bất đối xứng nằm ở vị trí
3, 3 'của vòng β-ionon với nhóm hydroxyl (-OH) ở cả hai đầu của phân tử (hình 2.2)
[3]. Trong các nguồn tự nhiên, astaxanthin tồn tại ở các dạng đồng phân lập thể,


10
10

đồng phân hình học và ở dạng tự do hoặc đã bị este hóa. Astaxanthin có chứa liên
kết đôi liên hợp, các nhóm hydroxyl (-OH) và keto (C=O), có tính chất ưa béo tốt
và ưa nước kém. Loại liên kết đôi liên hợp này hoạt động như một chất chống oxy
hóa mạnh bằng cách góp các electron tự do của chúng vào phản ứng với các gốc tự
do sau đó chuyển đổi chúng thành sản phẩm ổn định hơn và chấm dứt phản ứng của
chuỗi gốc tự do trong rất nhiều sinh vật sống. Astaxanthin cho thấy hoạt tính sinh
học tốt hơn các chất chống oxy hoá khác vì nó có thể liên kết với màng tế bào từ
bên trong ra bên ngoài [3].
2.1.4 Hoạt tính sinh học
Astaxanthin là một hợp chất hòa tan trong chất béo, với sự hấp thu tăng lên



12
12

oxy hóa cao. Hoạt tính chống oxy hóa của astaxanthin gấp 10 lần zeaxanthin, lutein,
canthaxanthin, β carotene và cao gấp 100 lần so với α-tocopherol [8].
Hoạt tính bảo vệ màng lipid: Astaxanthin có cấu trúc độc đáo giúp nó có thể
liên kết với cả bên trong và bên ngoài lớp lipid màng tế bào giúp bảo vệ màng tế
bào được tốt hơn. Astaxanthin ở màng tế bào ngăn chặn các gốc tự do dẫn đến ức
chế sự oxy hóa lipid. Nghiên cứu đã chỉ ra astaxanthin ức chế 80% sự peroxide hóa
xảy ra ở dạ dày chuột do ethanol gây ra [9, 10].
Kháng viêm: Astaxanthin là một chất chống oxy hóa mạnh để làm chấm dứt
sự kích thích viêm trong cơ thể động vật [3]. Astaxanthin là một phân tử có triển
vọng để điều trị viêm mắt ở mắt do các nhà nghiên cứu Nhật Bản báo cáo và
astaxanthin cũng có thể ngăn ngừa sự dày lên của da và giảm sự giảm collagen đối
với tổn thương da do UV gây ra [11, 12].
Ngăn ngừa các biến chứng của bệnh tiểu đường: Phản ứng oxy hóa xảy ra rất
cao ở bệnh nhân bệnh tiểu đường, nó được gây ra bởi sự tăng đường huyết, do rối
loạn chức năng của các tế bào β tuyến tụy và các mô hoại tử ở bệnh nhân.
Astaxanthin có thể làm giảm các stress oxy hoá gây ra bởi tăng đường huyết trong
tế bào β tuyến tụy và cũng cải thiện mức glucose và insulin huyết thanh theo hướng
tích cực. Astaxanthin có thể bảo vệ tế bào β tuyến tụy chống lại độc tính của
glucose. Trong một nghiên cứu, các stress oxy hoá ở chuột mắc bệnh tiểu đường đã
bị ức chế bởi sự kết hợp của astaxanthin với α-tocopherol. Một số nghiên cứu khác
đã chứng minh rằng astaxanthin ngăn ngừa suy thận ở bệnh nhân tiểu đường bằng
cách giảm stress oxy hóa và tổn thương tế bào thận [13, 14].
Ngăn ngừa bệnh tim mạch: Các chất oxy hóa góp phần vào sự lão hóa và gây
xơ vữa ở động mạch thông qua việc oxy hóa protein và lipid, astaxanthin có đặc
tính kháng oxy hóa mạnh nên nó có tác dụng lớn trong việc làm giảm nguy cơ xơ

miễn dịch hài hòa ở động vật lớn tuổi sau khi bổ sung astaxanthin trong chế độ ăn
uống [17]. Tám tuần bổ sung astaxanthin ở người đã làm tăng mức astaxanthin
trong máu và cải thiện hoạt động của các tế bào NK (Natural Killer) nhằm phát hiện
và phá huỷ các tế bào bị nhiễm virus [18].
2.1.5 Ứng dụng
Trên thị trường hiện nay, sản xuất astaxanthin từ các nguồn tự nhiên đã trở
thành một trong những hoạt động thành công nhất trong công nghệ sinh học.


14
14

Astaxanthin hiện đang có nhu cầu lớn để phục vụ cho các ngành công nghiệp thực
phẩm, thức ăn chăn nuôi, thực phẩm chức năng và dược phẩm. Điều này đã thúc
đẩy những nỗ lực lớn để cải thiện sản xuất astaxanthin từ các nguồn sinh học thay vì
thông qua con đường tổng hợp hóa học. Các sản phẩm của astaxanthin trên thị
trường có ở dạng viên nén, gel mềm, viên nang, bột rắn, sinh khối khô, dạng lỏng
và dạng kết hợp với một số loại dầu. Một số sản phẩm của astaxanthin được sản
xuất với sự kết hợp của các carotenoid khác, vitamin tổng hợp, chiết xuất từ thảo
mộc và các axit béo omega-3, omega-6. Nhiều ứng dụng đã được cấp bằng sáng chế
về việc sử dụng astaxanthin để ngăn ngừa nhiễm khuẩn, viêm, suy mạch, ung thư,
các bệnh tim mạch, ức chế sự peroxide hóa lipid, làm giảm tổn thương tế bào và
giảm mỡ trên cơ thể, cải thiện chức năng não và độ dầy da. Astaxanthin từ nguồn vi
sinh vật hoặc động vật có nhiều ứng dụng trong một loạt các hoạt động thương mại,
đó là lý do mà astaxanthin sản xuất từ vi tảo có thể cung cấp lợi nhuận hấp dẫn hơn
[3].

Hình 2.3: Sản phẩm BioAstin Hawaiian Astaxanthin
2.2 Tổng quan về chủng nấm men Rhodosporidium
2.2.1 Đặc điểm hình thái và sinh hóa

gần bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập, đang số các vị trí nẩy chồi
không cố định trên tế bào mẹ (nảy chồi đa hướng). Đây là phương pháp sinh sản vô
tính chủ yếu nhất ở nấm men, ngoài ra trong một số trường hợp vẫn phát hiện hình
thức sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp ở chủng nấm men Rhodosporidium. Tốc
độ sinh sản của Rhodosporidium khá nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi
thường từ 2 đến 6 giờ. Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn


16
16

giai đoạn: Giai đoạn tiềm sinh, giai đoạn phát triển hàm mũ, giai đoạn cân bằng và
giai đoạn suy vong. Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodosporidium trong
khoảng 24 – 96 giờ tùy loài, tùy thuộc vào thành phần môi trường dinh dưỡng và
điều kiện nuôi cấy [20].
Chủng nấm men Rhodosporidium có các đặc điểm sinh hóa như sau: Không
có khả năng lên men glucose, sucrose, maltose, lactose và galactose. Có khả năng
sử dụng các nguồn carbon khác nhau như glucose, sucrose, lactose, mannitol,
galactose, maltose, arabinose, sorbitol, inositol, glycerol, tinh bột, acid lactic và acid
citric. Có khả năng đồng hóa các nguồn nitơ khác nhau như NaNO 3, KNO3, NH4Cl
và (NH4)2SO4. Phát triển tốt ở nhiệt độ trong khoảng 25oC tới 30oC [23].

Hình 2.4: Khuẩn lạc Rhodosporidium toruloides trên môi trường thạch Hansen


17
17

Hình 2.5: Tế bào Rhodosporidium toruloides quan sát dưới kính hiển vi
2.2.2 Con đường sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men Rhodosporidium


β-zeacarotene,

3,3’-dihydroxy-β,γ-carotene-4,4’-dione

(DCD)

và

torulene, chỉ ra con đường thay thế thông qua β-zeacarotene  torulene  3hydroxy-3’,4’-didehydro- β,φ-carotene-4-one (HDCO)  3,3’-dihydroxy- β,γcarotene-4,4’-dione (DCD) thành trans-astaxanthin [19].


19
19

Hình 2.6: Quá trình sinh tổng hợp từ acetyl-CoA thành β-carotene, torulene và
torularhodin ở chủng nấm men Rhodosporidium [19]


20
20

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp astaxanthin ở nấm men
Rhodosporidium
2.2.3.1 Môi trường dinh dưỡng
Nguồn carbon và nguồn nitơ là những yếu tố quan trọng đã được nghiên cứu
nhiều về sự ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid. Carbon và nitơ là
những nguyên tố quan trọng cho việc cấu tạo nên tế bào và cũng như hình thành các
hợp chất thứ cấp ở vi sinh vật. Khi nuôi cấy nấm men Rhodosporidium với nguồn
carbon là sucrose sẽ cho hàm lượng torularhodin và β-carotene cao hơn khi nuôi

tới hàm lượng carotenoid mà còn ảnh hưởng tới việc hình thành các loại carotenoid
khác nhau và làm tăng khối lượng sinh khối của nhiều loài vi sinh vật. Trong nghiên
cứu nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hàm lượng carotenoid và
astaxanthin thu được khi có chiếu sáng lần lượt là 2,45 mg/L và 2,13 mg/L, còn khi
nuôi cấy trong tối thì hàm lượng carotenoid và astaxanthin thu được lần lượt là 1,72
mg/L và 1,38 mg/L [19].
Nhiệt độ là một nhân tố quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của quá
trình phát triển và hình thành các hợp chất thứ cấp ở vi sinh vật, nó ảnh hưởng lớn
đến quá trình nhân đôi tế bào và sự chuyển hóa sinh học bên trong tế bào, bao gồm
cả quá trình tổng hợp carotenoid. Sự ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng
hợp carotenoid ở vi sinh vật tùy thuộc vào đặc tính của từng loài vi sinh vật và các
điều kiện nuôi cấy khác nhau. Ở nhiều loài nấm men, nhận thấy có sự thay đổi tỷ lệ
giữa các sắc tố tạo thành carotenoid tổng (turulene, torularhodin, α-carotene và
astaxanthin) khi thay đổi nhiệt độ nuôi cấy. Mức nhiệt độ thấp từ 15 oC – 25oC cho
thấy ảnh hưởng tích cực đến sự sinh tổng hợp carotenoid ở nấm men, nghiên cứu
cho thấy khi nuôi cấy Rhodosporidium glutinis ở 20oC cho nồng độ các carotene là
19% so với lượng carotenoid tổng và nồng độ này chỉ đạt 9,6% khi nuôi cấy ở 35 oC
[19].
2.2.3.2 Sự sục khí
Sinh tổng hợp carotenoid là một quá trình hiếu khí, sự sục khí sẽ cung cấp
thêm nhiều oxy hòa tan cho môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Vì vậy ở nấm men, sục
khí trong quá trình nuôi cấy là một yếu tố thiết yếu ảnh hưởng đến sự đồng hóa các
chất nền dinh dưỡng cũng như ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng, tích lũy sinh
khối và sinh tổng hợp carotenoid. Ảnh hưởng của việc sục khí phụ thuộc vào đặc
điểm của từng loại vi sinh vật và cường độ của việc sục khí. Các giá trị tối ưu đã


22
22



23
23

2.3 Các phương pháp giải trình tự gene
2.3.1 Sự khác biệt trong trình tự gen tổng hợp astaxanthin
Đột biến là một trong các phương pháp cải tiến chủng nấm men
Rhodosporidium toruloides hoang dại với mục đích làm tăng khả năng sinh tổng
hợp astaxanthin. Các tác giả trước đã thực hiện đột biến trên nấm men
Rhodosporidium toruloides hoang dại mang tính ngẫu nhiên và có thể lựa chọn
chủng đột biến qua sự thay đổi màu sắc, kiểu hình khuẩn lạc. Các tác nhân đột biến
hóa học như etyl-methanesulfonate (EMS), benomyl, ethidium bromide hay tác
nhân vật lý như tia UV, tia Co-60 đã được sử dụng thành công trong đột biến vi sinh
vật nhằm cải thiện khả năng sinh tổng hợp carotenoids cũng như astaxanthin. Các
tác nhân trên đều là các tác nhân gây đột biến điểm, với mục đích khảo sát sự khác
biệt trong trình tự gen tổng hợp astaxanthin của chủng hoang dại với chủng đột biến
bởi các tác nhân trên, phương pháp giải trình tự gen quy định tổng hợp astaxanthin
đã được thực hiện để kiểm tra sự khác biệt.
2.3.2 Phương pháp giải trình tự DNA cổ điển
Giải trình tự DNA là phương pháp xác định vị trí sắp xếp các nucleotide
trong phân tử DNA. Có hai phương pháp chính để xác định trình tự các nucleotide
là phương pháp hóa học của Maxam và phương pháp enzyme của Sanger, ngày nay
hai phương pháp này đã không còn được sử dụng vì độ chính xác không cao và chỉ
giải trình tự được những đoạn ngắn DNA nhưng chúng vẫn là nguyên tắc để thiết kế
các phương pháp giải trình tự tự động hay phương pháp giải trình tự thế hệ mới
[22].
Phương pháp hóa học của Maxam và Gilberg: Phương pháp này dựa trên cơ
sở phân cắt hóa học tại vị trí đặc biệt của base. Đầu tiên, một mạch đơn nucleotide
có đánh dấu phóng xạ (32P) được chia thành bốn phản ứng để cắt ở những vị trí đặc
hiệu là G, G+A, T+C, C; Trong mỗi bốn phản ứng, mạch đơn có một đầu cố định

giảm chi phí đã phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây và trở thành một
công cụ phân tích quan trọng cho nhiều nhà di truyền học. Hàng triệu hoặc hàng tỉ
phân tử DNA có thể được giải trình tự đồng thời. Do đó, hiệu suất của quá trình giải
trình tự được tăng lên một cách đáng kể và giảm thiểu việc phải tách dòng trình tự
đích giống như phương pháp Sanger trước đó.
2.3.3.1 Pyrosequencing
Pyrosequencing là một phương pháp giải trình tự DNA dựa trên nguyên lý
“đọc trình tự bằng tổng hợp”. Nó khác với giải trình tự Sanger ở chỗ: dựa trên sự

phát hiện sự giải phóng pyrophosphate (PPi) khi dNTP được thêm vào chuỗi, thay
vì kết thúc chuỗi bằng ddNTP [23].