TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ MAI KHUYÊN

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG
GIẢI PHÓNG THUỐC CIMETIDIN CỦA
MÀNG CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƯỜNG NƯỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật
Người hướng dẫn khoa học
ThS. Ngô Thị Hải Yến

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận nghiên cứu với đề tài
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Cimetidin của màng Cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”, tôi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị và các bạn tại Viện Nghiên cứu
Khoa học và Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Với lòng kính
trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: ThS.
Ngô Thị Hải Yến - người đã hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cảm ơn chân thành tới các thầy cô làm việc tại Viện Nghiên cứu
Khoa học và Ứng dụng - trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các thầy cô và

Acetobacter xylinum

2
3

CVK
CM

4
5

CVK - CM
ĐHSP

6

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

7

Nxb

Nhà xuất bản

8

OD


1.1.2. Môi trường nuôi cấy A. xylinum thu màng CVK ...............................4
1.1.3. Màng CVK của vi khuẩn A. xylinum....................................................5
1.2. Tổng quan về thuốc Cimetidin ............................................................... 7
1.2.1. Công thức .............................................................................................7
1.2.2. Tính chất lí hóa ....................................................................................8
1.2.3. Tác dụng của CM .................................................................................8
1.2.4. Đặc điểm dược động học .....................................................................8
1.2.5. Dược lực học của CM ..........................................................................9
1.2.6. Tác dụng phụ của CM ........................................................................10
1.3. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .... 11
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK .................................11
1.3.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng của thuốc CM ............................12
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 14
2.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................... 14
2.1.1. Giống vi khuẩn ...................................................................................14
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất .......................................................................14
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................14


2.1.4. Môi trường lên men thu màng CVK ..................................................15
2.2. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 15
2.2.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo ..15
2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ...................17
2.2.3. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của CM .................................18
2.2.4. Phương pháp chế tạo màng CVK - CM.............................................19
2.2.5. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphat buffered saline) PBS 1X..........................................................................................................20
2.2.6. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng của màng CVK - CM
20
2.2.7. Phương pháp phân tích động học giải phóng của CM ......................21
2.2.8. Phương pháp xử lý thống kê ..............................................................22


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn của CM......................................... 19
Hình 3.1. Hình ảnh màng CVK nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo ...... 23
Hình 3.2. Thu màng CVK thô ở các khoảng thời gian khác nhau .................. 24
Hình 3.3. Quy trình xử lý màng CVK............................................................. 25
Hình 3.4. Mật độ quang phổ của màng CVK - CM trong các độ dày, thời gian
và môi trường pH khác nhau ......................................................................... 28
Hình 3.5. Tỉ lệ giải phóng CM từ màng CVK - CM trong các độ dày, thời
gian và môi trường pH khác nhau ................................................................. 29


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Thuốc Cimetidin (viết tắt là CM) là chất đối kháng trên receptor
histamin H2, đây là một trong những thuốc đầu tiên được khám phá bằng cách
tiếp cận phương pháp nghiên cứu thuốc hợp lí. Tác dụng chủ yếu của thuốc là
ức chế tế bào thành dạ dày tiết acid [9].
Cimetidin sau khi trải qua hàng loạt các nghiên cứu thử nghiệm đã được
báo cáo là một chất ức chế sự phát triển của các khối u tuyến nội tiết, ung thư đại
trực tràng, điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính [16],… đã được thành công
trên thị trường với tên Tagamet, nhưng sinh khả dụng của thuốc thấp khoảng
35% đã làm ngăn cản các ứng dụng điều trị trong khoảng thời gian dài [9].
Tuy nhiên trong quá trình dùng thuốc, người bệnh có thể gặp những tác
dụng phụ không mong muốn như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà, lú
lẫn, trầm cảm, rối loạn chức năng gan, viêm tụy có thể xảy ra,… Các phản
ứng này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc.
Trong tự nhiên có một số vi khuẩn có khả năng sinh ra màng cellulose,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Khi nuôi cấy những vi khuẩn này
trong môi trường chứa glucose, glycerol hoặc một số nguồn cacbon hữu cơ

cao. Trong khi đó, màng CVK hoàn toàn có thể sản xuất trong nước bằng
phương pháp lên men tĩnh vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường
lỏng.
Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc CM của màng CVK,
tôi đã chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc
Cimetidin của màng Cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
Thiết kế chế tạo hệ thống màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo
được nạp thuốc CM và nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc từ hệ thống này.
Chế tạo hệ thống CVK đã nạp thuốc CM có khả năng kéo dài thời gian

2


giải phóng thuốc, điều này có thể giúp cải thiện sự hấp thụ thuốc vào cơ thể,
nâng cao được hiệu quả tốt trong chữa trị viêm loét dạ dày ở người.
3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
 Vật liệu nghiên cứu:
- Màng CVK thu được từ môi trường nước vo gạo.
- Thuốc CM dạng tinh khiết 99,6%.
 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc CM của
màng CVK.
Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng, Trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Tạo màng và xử lí màng CVK lên men từ môi trường nước vo gạo.
Thiết kế, chế tạo màng CVK nạp thuốc CM.
Nghiên cứu khả năng giải phóng CM từ hệ thống CVK đã được nạp
thuốc ở môi trường pH khác nhau, định hướng sử dụng cho đường ruột hay
da.

A. xylinum. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo được trình bày như
trong bảng 1.1 [6].
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B (B1, B2, B5, B6)

30% - 60%

Protein

15,7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe (7% - 8%), Zn (12% - 13%)

Acid amin

leucine, valine, lysine

Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước
vo gạo chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng trưởng
như nhóm vitamin B1, B3, B5; nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm và các

trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể.

5


Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể,
lực ẩm cao. Màng CVK có khả năng giữ nước rất lớn, nó có thể hút 60 - 700
lần trọng nước của nó [14].
Màng CVK được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì
vậy việc sản xuất giấy, sợi không cần qua các bước trung gian.
Màng CVK được định hướng trong quá trình tổng hợp: Có khả năng hình
thành các sợi biến động, tạo các bền theo một trục. Theo Brown và White (1989)
[32] có thể hình thành một gang tay cellulose không cần khâu bằng cách sử dụng
một khối đất xốp mà không khí thấm qua được và dìm xuống không khí bên
trong môi trường lỏng nuôi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung
quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn.
Màng CVK được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: Khi thêm
chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp CVK thì có
thể làm thay đổi những thuộc tính của CVK. Nếu cho thuốc nhuộm vào môi
trường nuôi cấy có thể kiểm soát các tính chất vật lý của cellulose trong quá
trình tổng hợp.
Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động gen
liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đó giúp kiểm soát hình dạng
cellulose, kiểm soát trọng lượng phân tử cellulose.
1.1.3.3. Ứng dụng của CVK
Với những ưu điểm nổi bật, CVK ngày càng được nghiên cứu nhiều và
có nhiều ứng dụng rộng rãi [2, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 14, 18, 20, 25] được thể hiện
cụ thể trong bảng 1.2:

6


Trang phục
Thể thao

Sản xuất sợi nhân tạo, quần áo, giày dép tự phân hủy
Y phục quân đội
Lều lắp ráp
Gỗ nhân tạo

Sản phẩm rừng

Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ
Thùng hàng có độ bền cao

Lĩnh vực khác

Làm màng lọc

1.2. Tổng quan về thuốc Cimetidin
1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C10H16N6S
Phân tử lượng: 252,3
Độ nóng chảy: 142°C
Công thức cấu tạo:

7


Tên khoa học: N" - cyano - N methyl - N' - [2 - [[(5 - methyl - 1H imidazol - 4 - yl) methyl] thio] - ethyl] - guanidin [9].
1.2.2. Tính chất lí hóa

trong dịch cơ thể, các cơ quan và mô người, không có trong mô mỡ [9].
Tỷ lệ phân phối trung bình của CM giữa dịch não tủy và huyết thanh
thay đổi từ 0,03 - 0,18mcg/ml. Tỷ lệ này là 0,2 - 0,5 ở người bệnh gan hay
thận. Tỷ lệ gắn protein huyết tương của CM là 18 - 26% ở mức nồng độ giữa
0,05 - 50mcg/ml. Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỷ lệ này đạt
khoảng 13 - 25% (trung bình 19%) [9].
* Chuyển hóa và thải trừ
CM và chất chuyển hóa của nó được đào thải qua thận. Khoảng 50 - 80%
tổng lượng CM dùng đường tiêm tĩnh mạch tồn tại dưới dạng không đổi trong
nước tiểu. Tỷ lệ này là 40% nếu dùng thuốc đường uống. Sự chuyển hóa CM chỉ
chiếm khoảng 25 - 40% tổng lượng thải trừ của CM và quá trình này phụ thuộc
vào độ tuổi [9]. Nửa đời thải trừ của CM khoảng 2 giờ, tăng lên khi suy thận.
Sulphoxide Cimetidin được chứng minh là chất chuyển hóa chính của CM [25].
Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dược động học của CM. Tuổi
càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh thải này giảm một
nửa từ độ tuổi 30 - 65 [9]. Một lượng nhỏ liều thuốc tiêm tĩnh mạch được đào
thải qua mật (Stephen J et al., 1979) [29]. CM có thể qua hàng rào nhau thai,
được bài tiết qua sữa mẹ và ở những người mẹ cho con bú, thuốc vào được cơ
thể trẻ nhiều mg/ngày [28].
1.2.5. Dược lực học của CM
Các thử nghiệm cho thấy CM là một chất đối kháng cạnh tranh chọn lọc
với thụ thể histamin H2 mà không có tương tác có ý nghĩa nào với catecholamin,
thụ thể β, thụ thể histamin H1, thụ thể muscarinic và không có tác dụng kháng

9


cholinergic. CM làm giảm bài tiết và giảm nồng độ acid dạ dày cả ở điều kiện
cơ bản (khi đói) và khi được kích thích bởi thức ăn, histamin, pentagastrin,
insulin và cafein [27]. Vì quá trình tiết acid cơ bản dài nhất xảy ra vào ban

thượng bì nhiễm độc, hồng ban đa dạng, đỏ da bong vảy toàn thân, rụng tóc.
1.3. Giới thiệu tổng quan về tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
1.3.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng CVK
* Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng
của nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown (1989),
dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng
làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989),
Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm
ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm
[14].
Czaja và cộng sự (2006) sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở,
vết bỏng đã thu được kết quả tốt. Đặc biệt tác giả Wan (Canada) đã được đăng
kí bản quyền về làm màng CVK từ A. xylinum dùng trị bỏng. Các tác giả
Jonas và Farad (1998), Czaja và cộng sự (2006) đã dùng màng CVK làm da
nhân tạo, mặt nạ dưỡng da cho phụ nữ [4].
Gần đây hơn, Lin Huang và cộng sự [19] nghiên cứu việc sử dụng màng
CVK cho việc kiểm soát in vitro của Berberin. Ngoài thẩm thấu qua da, thí
nghiệm kiểm soát sự giải phóng thuốc qua màng CVK còn được thử nghiệm
mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu được cho thấy thuốc đã được
giải phóng với một tốc độ chậm.
* Tại Việt Nam
Ở Việt Nam việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK mới được quan
tâm gần đây và đã đạt được kết quả bước đầu.
Từ năm 2000, Bộ môn Vi Sinh - Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành

11


phố Hồ Chí Minh đã bước đầu nghiên cứu dùng màng CVK từ A. xylinum

khả năng hấp thụ thuốc tốt hơn và thời gian giải phóng thuốc dài hơn.
Nghiên cứu của Srivastava A. K. et al. (2005) [28] liên quan đến việc
đánh giá các vi cầu khuẩn nổi với CM như mô hình kéo dài thời gian cư trú
thuốc tại dạ dày. Các vi cầu được chuẩn bị bằng phương pháp bay hơi dung
môi sử dụng polymer hydroxyporyl methyl celllulose và ethyl cellulose. Hình
dạng và bề mặt hình thái của vi cầu được quan sát bằng kính hiển vi quang
học và kính hiển vi điện tử quét.
Kết quả cho thấy nồng độ polymer, kích thước vi cầu khuẩn, thành phần
dung môi ảnh hưởng tới thời gian giải phóng thuốc. Kích thước hạt vi cầu
khuẩn tăng lên, nồng độ polymer cao hơn thì thời gian cư trú CM tại dạ dày
tăng lên [28].
Fukuda M và cộng sự đã chứng minh hiệu quả của CM là một chất đối
kháng thụ thể histamin H2 điều trị tổn thương dạ dày cấp tính, ung thư đại trực
tràng [16].
Arisawa T và cộng sự có công trình nghiên cứu sự kết hợp CM và
Rabeprazole đơn trị liệu điều trị các tổn thương dạ dày cấp tính thông qua
đường miệng tái tạo mô liên kết [13].
Nghiên cứu của Franco I. (2000) dùng CM với liều 30 - 40mg/ngày,
dùng trong 3 tháng liền để chữa mụn cóc trên bốn trẻ em. Kết quả là bốn trẻ
đều khỏi mụn cóc [15].
* Tại Việt Nam
Ở Việt Nam, phần lớn CM được sử dụng là một loại thuốc để chữa trị bệnh
viêm loét và trào ngược dạ dày, ngăn ngừa tái phát sau khi bị viêm loét dạ dày.
Ngoài ra, CM còn được ứng dụng trong chữa các bệnh về da liễu, Hà
Nguyễn Phương Anh của trường Đại học Y dược đã thành công với luận án:
Nhiễm Human papillomavirus trên bệnh nhân bị nhiễm trùng lây truyền qua
đường tình dục và tác dụng của CM trong phòng tái phát bệnh sùi mào gà [1].

13




2.1.3.2. Dụng cụ
Hộp nhựa để lên men tạo màng CVK, ống nghiệm, cốc đong thủy tinh,
đũa thủy tinh, bình thủy tinh (500ml) có nút xoáy, lọ penicilin, đèn cồn, kẹp
gỗ, bình hút ẩm, giấy lọc, giấy quỳ tím, bình định mức loại 100ml, 500ml,
1000ml, pipet chính xác 1ml, 5ml, 10ml, thước kẹp panme,... và nhiều dụng
cụ hóa sinh khác.
2.1.4. Môi trường lên men thu màng CVK
Tạo màng CVK có cải tiến từ môi trường chuẩn Hestrin - Schramm [30]
bằng cách thay cao nấm men bằng nước vo gạo để tạo màng CVK do chi phí
rẻ và trong nước vo gạo có rất nhiều vi chất dinh dưỡng, vitamin thuộc nhóm
B như vitamin B1, B5,… vitamin E và một số thành phần có lợi khác. Vì vậy
A.xylinum rất thích hợp phát triển trong môi trường này.
Cùng với nước vo gạo, chúng tôi bổ sung thêm chất dinh dưỡng
(glucose, kalihydrophotphat, điamoni sunfat, pepton) với lượng thích hợp tạo
môi trường tối ưu để lên men tạo màng CVK [4] được thể hiện ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Nước vo gạo

Glucose

20g

1000ml

KH2PO4

2g


Nước vo gạo (đã lọc bã, rác)

Bổ sung dinh dưỡng (bảng 2.1)

Hấp khử trùng (113°C, 15 phút)

Để nguội

Bổ sung 10% dịch giống
và 2% acid acetic

Nuôi cấy tĩnh
(26°C, 6 - 14 ngày)

Thu CVK thô
Sơ đồ 2.1: Quy trình tạo màng CVK thô

16


2.2.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc
Màng CVK sau khi thu được chứa một lượng lớn môi trường lên men và
các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid acetic. Vì vậy, trước khi
hấp thu thuốc cần phải xử lý màng, quy trình xử lý màng CVK được thể hiện
qua sơ đồ 2.2 [4].

Tách màng CVK thô
Ép loại nước
Ngâm trong NaOH 3%
48h, rửa và ép