TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN
======

NGUYỄN HỮU THỊ QUỲNH

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƢỜNG
NƢỚC VO GẠO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
ThS. CAO BÁ CƢỜNG

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Cao Bá Cƣờng,
Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2, ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo,
động viên tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu thực hiện và hoàn
thành khóa luận.
Tôi cũng xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới toàn bộ các thầy, cô giáo và cán
bộ nhân viên Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 - những ngƣời đã dạy bảo và
giúp đỡ tôi trong suốt 4 năm học tại đây. Đặc biệt là gia đình và bạn bè đã
luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ
trong thời gian tôi thực hiện khóa luận này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tốt nhất,

Tên tiếng anh

A. xylinum

Acetobacter xylinum

Acetobacter xylinum

CVK

Cellulose vi khuẩn

Bacterial Cellulose

CVK - Berberin

Màng Cellulose vi khuẩn đã
hấp thụ thuốc berberin

cs

Cộng sự

C

Nồng độ

E. coli

Escherichia coli

2.3.1. Giống vi khuẩn ................................................................................ 11
2.3.2. Nguyên liệu - hóa chất .................................................................... 11
2.3.3. Thiết bị ............................................................................................ 11
2.3.4. Dụng cụ ........................................................................................... 12
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...................................................................... 12
2.4.1. Phương pháp lên men thu màng CVK từ môi trường nước vo gạo 12
2.4.2. Phương pháp xử lý màng CVK trước khi hấp thụ thuốc ................ 14
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK ..................... 15
2.4.4. Phương pháp xác định đường chuẩn .............................................. 15


2.4.5. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành ........................ 17
2.4.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK 17
2.4.7. Phương pháp pha môi trường đệm PBS (Phosphate buffered
saline) ........................................................................................................ 18
2.4.8. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế .............................................................................................. 18
2.4.9. Phương pháp đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng
CVK ........................................................................................................... 19
2.4.10. Phương pháp xử lí thống kê .......................................................... 20
2.5. Cách bố trí thí nghiệm........................................................................... 20
2.6. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 20
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 21
3.1. Thu màng CVK ..................................................................................... 21
3.1.1. Màng CVK thu được khi nuôi cấy trong môi trường nước vo gạo. 21
3.1.2. Tinh chế màng CVK ........................................................................ 22
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK ................................................. 22
3.3. Màng CVK hấp thụ thuốc berberin....................................................... 23
3.4. Xác định lƣợng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trƣờng pH
khác nhau ..................................................................................................... 25

Hình 3.5. Màng CVK ngâm trong dung dịch đệm............................................ 25
Hình 3.6. Mẫu dung dịch đệm thu đƣợc sau các giờ khác nhau ....................... 25
Hình 3.7. Khả năng giải phóng thuốc berberin của màng CVK - Berberin
trong các độ dày, thời gian và môi trƣờng pH khác nhau ................. 27
Hình 3.8. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 2 ........................................................ 29
Hình 3.9. Tỉ lệ giải phóng thuốc ở pH = 12 ...................................................... 29


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Berberin là một trong số các loại thuốc đƣờng tiêu hóa dùng qua đƣờng
uống, khó tan trong ethanol và nƣớc, không tan trong ether. Nó có tác dụng
chống các loại vi khuẩn, ký sinh trùng đƣờng ruột gây hại cho cơ thể mà
không ảnh hƣởng tới hoạt động của các vi sinh vật có lợi của đƣờng tiêu hóa.
Berberin còn đƣợc bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau
mắt đỏ do các yếu tố kích ứng từ môi trƣờng hoặc do đau mắt hột gây nên.
Berberin còn có khả năng ngăn ngừa sự lây lan của nấm, bột nhiễm nấm,
chống lại tác hại của vi khuẩn tả, E.coli. Berberin có tác dụng phụ gây ra táo
bón, nếu dùng với liều cao berberin trên 500mg có thể gây ra đau bụng, buồn
nôn, nôn mửa, căng thẳng, trầm cảm, khó thở, nhịp tim chậm, suy tim, hạ
huyết áp, co giật, tê liệt, co thắt và dẫn đến tử vong.
Tuy nhiên, berberin chủ yếu đƣợc sử dụng qua đƣờng uống và bôi qua
da với sinh khả dụng khá thấp. Do đó cần kéo dài quá trình giải phóng của
thuốc nhằm duy trì nồng độ dƣợc chất trong máu trong vùng điều trị, giảm số
lần dùng thuốc cho ngƣời bệnh, giảm tác dụng không mong muốn, nâng cao
hiệu quả điều trị của thuốc [3].
Cellulose vi khuẩn (CVK) đƣợc tạo thành từ Acetobacter xylinum có
cấu trúc hóa học rất giống của cellulose thực vật nhƣng có một số tính chất
hóa lý đặc biệt nhƣ: độ bền cơ học, khả năng thấm hút nƣớc cao, đƣờng kính
sợi nhỏ, độ tinh khiết cao, độ polymer hóa lớn, có khả năng phục hồi độ ẩm

thuốc berberin qua màng nhằm giúp thuốc đƣợc giải phóng một cách kéo dài,
đồng thời có thể giúp tăng khả dụng sinh học của thuốc berberin trong điều trị
bệnh, chúng tôi đã chọn đề tài: “Khả năng giải phóng thuốc berberin của
màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường nước vo gạo”.
2. Mục đích nghiên cứu
- Tạo hệ thống CVK đã hấp thụ thuốc đƣợc lên men từ môi trƣờng
nƣớc vo gạo.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc berberin từ hệ thống trên
nhằm tìm ra hệ thống có khả năng giải phóng thuốc kéo dài.

2


3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
Nghiên cứu tìm hiểu khả năng giải phóng để có những hiểu biết về tiềm
năng giải phóng của màng CVK. Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK nhằm
làm cho thuốc đƣợc giải phóng kéo dài, qua đó có thể khắc phục hạn chế của
thuốc berberin dạng thƣơng mại sẽ mở ra một hƣớng sản xuất thuốc hiệu quả,
mang lại lợi ích cho việc điều trị.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng đƣợc quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter
xylinum lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Từ màng CVK đã đƣợc tạo ra đƣợc dùng làm hệ thống giải phóng
thuốc có thể đƣa vào điều trị bệnh, kéo dài quá trình giải phóng, duy trì nồng
độ thuốc trong máu trong một thời gian dài, giảm số lần dùng thuốc cho ngƣời
bệnh, giảm tác dụng phụ không mong muốn, nâng cao đƣợc sinh khả dụng
của thuốc.

sợi này kết hợp với nhau thành bó, nhiều bó hợp thành dãy, mỗi dãy dài
khoảng 100nm, rộng khoảng 3 - 8nm [4, 18]. Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích

4


lũy trên bề mặt môi trƣờng dinh dƣỡng lỏng thành lớp màng mỏng nhƣ da,
sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tƣơng tự nhƣ giấy da với độ
dày 0.01 - 0.5nm.
Tính chất độc đáo của màng CVK: độ tinh khiết cao, độ bền dai cơ học
lớn, khả năng thấm hút nƣớc cao, có thể bị thủy phân bởi enzyme, bề mặt tiếp
xúc lớn hơn gỗ, không độc và không gây dị ứng, có khả năng chịu nhiệt tốt,
đặc biệt là khả năng cản khuẩn 8].... Vì vậy, CVK đƣợc ứng dụng trong rất
nhiều lĩnh vực công nghệ khác nhau nhƣ: thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ
phẩm, công nghệ giấy, công nghệ pin,... đặc biệt trong lĩnh vực y học [14, 23].
Trong y học, màng CVK thu đƣợc từ quá trình nuôi cấy tĩnh đƣợc nghiên cứu
và sử dụng làm da nhân tạo. Ở Brazil, màng CVK ƣớt tinh sạch đƣợc sản xuất
và bán ra thị trƣờng nhƣ một loại ra nhân tạo dùng đắp vết thƣơng [4]. Trƣờng
Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh cũng nghiên cứu sử dụng màng
CVK có tẩm dầu mù u làm màng trị bỏng đƣợc thực nghiệm ở thỏ. Kết quả
cho thấy rằng màng CVK giúp vết thƣơng mau lành và ngăn không cho vết
thƣơng nhiễm trùng [8]. Ngoài ra, sản phẩm CVK còn đƣợc ứng dụng làm
màng băng vết thƣơng, trong phẫu thuật, ghép mô, cơ quan [4].
Sinh tổng hợp CVK: cellulose đƣợc tổng hợp từ một số nhóm vi khuẩn
và đặc biệt là A. xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dƣỡng cacbon,
phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose
phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose. Ngày nay,
quá trình tổng hợp cellulose ở A. xylinum gồm nhiều bƣớc liên tiếp, gồm 2
giai đoạn chính: giai đoạn polyme và giai đoạn kết tinh. Phƣơng pháp sản
xuất CVK: lên men tĩnh và lên men động.

6


1.1.2.4. Tính chất hóa học
Tính chất hóa học của N: berberin có tính chất nhƣ một base yếu, tạo
muối bằng cách thay thế nhóm OH, việc tạo muối berberin không giống nhƣ
các alkaloid khác mà muối tạo thành giống muối của hydroxyd kim loại,
nghĩa là có loại phân tử nƣớc 1, 6, 10, 19, 23.
Tính chất hóa học của oxy: berberin kém ổn định trong môi trƣờng
kiềm mạnh, N không bền vững, trong môi trƣờng kiềm mạnh dễ biến mở
vòng, cho chức aldehyd gọi là berberin al 6, 7, 14.
Tính chất hóa học mạch kép: berberin có thể mất mạch kép tại nhân
giữa để cho các hydro alkaloid không màu 6, 7, 19.
1.1.2.5. Tác dụng dược lí và ứng dụng
Các tác dụng chủ yếu của berberin là chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký
sinh trùng đƣờng ruột. Berberin còn đƣợc bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều
trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài nhƣ (gió, nắng, lạnh,
bụi, khói...) và điều trị bệnh mắt hột. Ngoài ra berberin cũng có thể giúp ngăn
ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm và còn có tác dụng chống lại tác hại của vi
khuẩn tả và E. coli ngoại độc tố bền với nhiệt. Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra
tác dụng chống ung thƣ của berberin, nó có thể ngăn chặn sự phát triển của
nhiều loại tế bào ung thƣ, bao gồm ung thƣ vú, ung thƣ biểu mô, ung thƣ tụy,
ung thƣ dạ dày mà không làm ảnh hƣởng đến sự phát triển của các tế bào bình
thƣờng ở nồng độ nhất định 24.
Berberin có một ƣu thế là khi dùng điều trị các nhiễm trùng đƣờng ruột
berberin sẽ không ảnh hƣởng tới sự phát triển bình thƣờng của hệ vi khuẩn có
ích ở ruột. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh, khi dùng một số thuốc
kháng sinh nếu phối hợp với berberin sẽ hạn chế đƣợc tác dụng không mong
muốn gây ra bởi các thuốc kháng sinh đối với hệ vi sinh vật đƣờng ruột.
Hiện nay, nhiều hãng dƣợc sản xuất berberin với tên khác nhau nhƣ:

với màng CVK tinh khiết, 2 nghiên cứu với thể chất biến đổi màng CVK và 7

8


với các vật liệu nanocomposite. Nhƣ vậy, trong lĩnh vực này cần tiếp tục đƣợc
tiến hành nghiên cứu.
Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trƣờng phân tách cho
quá trình xử lý nƣớc, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lƣợng
cho tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng nhƣ là một chất
để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trƣờng cơ chất
trong sinh học, thực phẩm [8]. Các tác giả Hamlyn và cs (1997), Cienchanska
(2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs (2006) sử
dụng màng đắp lên các vết thƣơng hở, vết bỏng đã thu đƣợc kết quả tốt [8].
*Ở Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng đƣợc quan tâm. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và ứng dụng
màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng
lại bƣớc đầu nghiên cứu. Các kết quả ứng dụng của màng CVK hầu nhƣ mới
chỉ dừng lại ở điều kiện thí nghiệm. Năm 2006 gần đây, Nguyễn Văn Thanh và
cộng sự [8] đã tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylinum đạt
hiệu quả cao. Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in
vivo trong ứng dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho
thêm hoạt chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng
CVK có cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị
bỏng là ƣu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Nhƣ
Quỳnh [12] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợp có sợi


Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Khả năng giải phóng thuốc berberin của màng cellulose vi khuẩn lên
men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Tạo ra màng CVK đƣợc lên men từ môi trƣờng nƣớc vo gạo.
- Cho thuốc đƣợc hấp thu vào màng CVK.
- Nghiên cứu khả năng giải phóng của thuốc berberin từ hệ thống đƣợc
tạo ra từ bƣớc trên.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
2.3.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng đƣợc cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh khoa sinh - KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
2.3.2. Nguyên liệu - hóa chất
- Nguyên liệu: nƣớc vo gạo, nƣớc cất 2 lần, gạc vô trùng.
- Hóa chất:
+ Berberin 95%.
+ Màng CVK (99% hàm lƣợng nƣớc) đƣợc sản xuất bằng cách sử dụng
vi khuẩn A. xylinum (Phòng thí nghiệm Vi sinh, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2) lên
men trong môi trƣờng dinh dƣỡng.
+ Dung môi là etanol 96% và chất phản ứng khác đƣợc cung cấp từ
Viện NCKH & ƢD Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
+ Đƣờng glucose, acid acetic, acid citric, peptone, amoni sunfat, kali
đihiđrophotphat, HCl, NaOH,… đạt tiêu chuẩn phân tích.
2.3.3. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản).
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ).
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA.


Glucose

30g

Diamoni photphat

0.3g

Amoni sulfat

0.5g

Pepton

10g

Acid acetic

2%

Dịch giống A. xylinum

10%

12


Nguyên liệu nƣớc vo gạo sau khi lọc loại bỏ cặn và tạp chất sau đó thêm
các chất dinh dƣỡng cần thiết tạo màng. Hấp khử trùng ở 113°C trong 20 phút.
Sau đó môi trƣờng đƣợc khử trùng bằng tia UV trong 30 phút để nguội môi

Cụ thể màng CVK đƣợc tinh chế bằng cách rửa nhiều lần theo quy
trình [8] đƣợc thể hiện ở sơ đồ 2.2 dƣới đây:
Tách màng CVK thô
Ép loại nƣớc
Ngâm trong NaOH 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong HCl 3%
48 giờ, rửa và ép
Ngâm trong nƣớc
48 giờ, kiểm tra tạp chất
Thu CVK tinh chế
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tinh chế màng CVK
- Tách CVK: trong nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày ở mặt môi
trƣờng nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trƣờng.
- Trong màng chứa một lƣợng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm màng trong NaOH 3%
để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc tố của vi khuẩn.

14


- Ngâm HCl: Màng sau khi đƣợc ngâm bằng NaOH rửa nƣớc rồi ép
màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
- Ngâm nƣớc: Màng sau khi ngâm với HCl rửa sạch bằng nƣớc rồi ép
màng. Ngâm nƣớc để trung hòa hết acid trong khoảng 48 giờ ta thu đƣợc
CVK tinh chế [14].
2.4.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng CVK
- Mục đích: nhằm đảm bảo màng CVK sau khi xử lý đã loại đƣợc các
tạp chất có thể gây độc hại, kiểm tra sự hiện diện của đƣờng glucose trong
màng CVK.
- Nguyên tắc: dùng thuốc thử Fehling mới pha để phát hiện sự hiện

STT (mg/ml)

Giá trị trung
Lần 1

Lần 2

Lần 3

bình

1

5

0.353

0.355

0.354

0.354 ± 0.003

2

10

0.712

0.714


40

2.996

3.004

3.046

3.005 ± 0.040

6

50

3.703

3.641

3.504

3.616 ± 0.102

Dựng đồ thị biểu diễn và lập đƣờng chuẩn berberin bằng phần mềm
Excel 2007, kết quả đƣợc đồ thị nhƣ hình 2.3.
OD345nm
y = 0.0734x + 0.0074
R² = 0.9986

Mật độ quang OD345nm



Phƣơng trình dƣờng chuẩn:
y = 0.0734x + 0.0074 (R2=0.9986)

(1)

Trong đó:
x : Nồng độ berberin (mg/ml).
y : Giá trị OD tƣơng ứng với nồng độ x.
R2: Hệ số tƣơng quan.
2.4.5. Phương pháp xác định khối lượng CVK tạo thành
CVK sau khi đƣợc tách ra khỏi môi trƣờng, xử lý qua công đoạn hóa
học thu đƣợc CVK tinh chế. CVK tinh chế đƣợc ép áp lực, thu đƣợc khối
lƣợng CVK tạo thành.
2.4.6. Phương pháp xác định lượng thuốc được hấp thụ vào màng CVK
- Cắt các màng CVK có đƣờng kính 5cm với độ dày (0.3cm và 0.7cm)
tƣơng đối đều nhau. Cho 2 mẫu màng CVK đã sấy khô vào 2 bình tam giác có
chứa sẵn 100ml dung dịch berberin 10%. Sau đó cho vào máy rung siêu âm ở
nhiệt độ 37°C, sau 2 giờ tiến hành rút mẫu ra đo quang phổ bằng máy UV 2450 để xác định lƣợng thuốc còn lại trong dung dịch tại thời điểm lấy mẫu,
từ đó xác định đƣợc lƣợng thuốc hấp thu vào các màng CVK theo công thức:
mht = m1 - m2 (mg)

(2)

Trong đó:
mht : khối lƣợng thuốc đã đƣợc hấp thu vào màng.
m1 : khối lƣợng thuốc ban đầu trong dung dịch (100mg).
m2 : khối lƣợng thuốc có trong dung dịch sau khoảng thời gian nhất
định màng hấp thu thuốc.