TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

PHẠM THỊ THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC CIMETIDIN CỦA MÀNG
CELLULOSE VI KHUẨN
LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật học

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn cô giáo
ThS. Ngô Thị Hải Yến, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh –
KTNN cùng các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng trường
Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn
thành khóa luận này.
Một lần nữa tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô, cảm ơn gia đình
cùng toàn thể các bạn, những người thân, đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ và
khích lệ tôi hoàn thành luận văn này.
Mặc dù tôi đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách hoàn
chỉnh nhất. Tuy nhiên do buổi đầu mới làm quen với công việc nghiên cứu
khoa học cũng như hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh


CVK

Cellulose vi khuẩn

CVK – CM

Màng Cellulose vi khuẩn đã hấp

3

thụ thuốc Cimetidin

4

CM

Cimetidin

5

cs

cộng sự

6

ĐHSP

Đại học Sư phạm

Bảng 2.2. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch CM ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3). ......................................................................... 17
Bảng 2.3. Môi trường đệm PBS với pH 2 và pH 12................................... 19
Bảng 3.1 Kết quả thu màng CVK tươi ....................................................... 23
Bảng 3.2. Tỉ lệ hấp thụ thuốc của CM vào màng CVK (n = 3).................. 27
Bảng 3.3. Giá trị OD (y) tương ứng với nồng độ CM ở các độ dày màng,
môi trường pH và thời điểm khác nhau khi giải phóng .............................. 28
từ màng CVK – CM (n = 3)........................................................................ 28
Bảng 3.4. Tỉ lệ giải phóng thuốc CM từ màng CVK – CM trong các độ
dày, thời gian và môi trường pH khác nhau (n = 3). .................................. 30
Bảng 3.5. Hệ số tương quan R2, tốc độ giải phóng thuốc (k) và trị số mũ
giải phóng (n) đối với các môi trường pH khác nhau (n = 3). .................... 32


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 2.1. Công thức cấu tạo của Cimetidin. ..................................................... 6
Hình 2.2. Sơ đồ các bước thực hiện của đề tài................................................ 13
Hình 2.3. Phương trình đường chuẩn của CM ................................................ 18
Hình 3.1. Màng CVK lên men từ môi trường cao nấm men .......................... 22
Hình 3.2. Màng CVK thô thu được sau 8 ngày .............................................. 23
Hình 3.3. Các quy trình xử lí màng CVK ....................................................... 25
Hình 3.4. Màng VC sau khi tinh chế............................................................... 26
Hình 3.5. Khả năng giải phóng thuốc CM của màng CVK- CM trong các độ
dày, thời gian và môi trường pH khác nhau. ................................................... 29
Hình 3.6. Tỉ lệ giải phóng thuốc CM của màng CVK- CM trong các độ dày,
thời gian và môi trường pH khác nhau. .......................................................... 30


DANH MỤC SƠ ĐỒ


1.3.1.2. Tình hình nghiên về màng CVK trên thế giới ............................... 10


1.3.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc CM .................................................. 10
1.3.2.1. Tình hình nghiên cứu về thuốc CM tại Việt Nam .......................... 10
1.3.2.2. Tình hình nghiên cứu về thuốc CM trên thế giới .......................... 11
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 12
2.1. Vật liệu nghiên cứu .............................................................................. 12
2.1.1. Giống vi khuẩn.................................................................................. 12
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất ...................................................................... 12
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................... 12
2.1.3.1. Thiết bị ........................................................................................... 12
2.1.3.2. Dụng cụ .......................................................................................... 13
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................ 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 14
2.3.1. Môi trường lên men thu màng CVK ................................................. 14
2.3.2. Xây dựng đường chuẩn của CM trong HCl 0.1N ............................. 17
2.3.3 Hấp thụ CM ....................................................................................... 18
2.3.4. Chuẩn bị bộ đệm ............................................................................... 19
2.3.5. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng thông qua hệ thống
được thiết kế................................................................................................ 19
2.3.6. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK .................. 20
2.3.7. Phương pháp xử lý thống kê ............................................................. 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................... 22
3.1. Tạo màng CVK của A.xylinum trong môi trường cao nấm men ........ 22
3.2. Thu màng CVK thô trong môi trường cao nấm nem .......................... 22
3.3. Tinh chế màng CVK ............................................................................ 23
3.4. Khả năng hấp thụ CM của màng CVK ................................................ 26
3.5. Lượng thuốc CM giải phóng khỏi màng CVK – CM........................... 27
3.6. Phân tích động dược học giải phóng của CM....................................... 31

chứng bất thường do thuốc gây nên như: tiêu chảy, đau đầu, chóng mặt, ngủ gà,
lú lẫn, trầm cảm, kích động... hay chứng to vú ở đàn ông, bất lực ở đàn ông,
tăng men gan, viêm gan mãn tính, vàng da, rối loạn chức nãng gan, viêm tụy có
thể xảy ra. Các phản ứng này cũng sẽ khỏi khi ngừng thuốc, đây là những tác
dụng phụ của thuốc, những triệu chứng này có thể gặp ngay cả ở liều điều trị.
Ngoài ra, thuốc này còn gây tương tác với rất nhiều thuốc khác.
Cellulose vi khuẩn (CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn, đặc biệt là
1


chủng Acetobacter xylinum (A. xylinum). Màng sinh học (CVK) có cấu trúc và
đặc tính rất giống với cellulose của thực vật (gồm các phân tử glucose liên kết
với nhau bằng liên kết β-1,4 glucorit) cellulose vi khuẩn khác với cellulose
thực vật ở chỗ: không chứa các hợp chất cao phân tử như ligin, hemicellulose,
peptin và sáp nến do vậy chúng có những đặc tính vượt trội với độ dẻo dai, bề
chắc [4], [26]. Màng CVK được coi là một nguồn polymer mới, là một giải
pháp trên con đường tìm nguồn nguyên liệu mới hiện nay.
Trên thế giới màng cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng rất nhiều trong
các lĩnh vực công nghệ khác nhau như: dùng làm màng phân tách cho quá trình
xử lí nước, chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào, dùng làm
chất biến đổi độ nhớt trong sản xuất các sợi truyền quang, làm môi trường cơ
chất trong sinh học, thực phẩm hay thay thế thực phẩm [12]. Đặc biệt trong lĩnh
vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da tạm thời thay thế da trong quá
trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân tạo điếu trị các bệnh tim mạch;
làm mặt nạ dưỡng da cho con người [12]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu và ứng
dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các nghiên cứu ứng dụng mới chỉ
dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A.
xylinum, từ đó chế tạo màng sinh học để khảo sát sự giải phóng thuốc qua
màng nhằm kéo dài thời gian giải phóng , hạn chế tác dụng phụ, khắc phục tính

màng CVK trên nhiều các loại thuốc khác nhau nhằm tăng sinh khả dụng và
kéo dài thời gian giải phóng của các loại thuốc đó.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng A. xylinum.
- Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm hệ thống giải phóng
thuốc CM nhằm xác định lượng CM giải phóng qua màng CVK.
- Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể định hướng tạo hệ hấp thu thuốc
để tăng khả dụng sinh học của thuốc, từ đó có thể áp dụng trong điều trị bệnh
viêm loét dạ dày, tá tràng tại Việt Nam.
3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về Cellulose vi khuẩn (CVK)
1.1.1. Đặc điểm của A. xylinum
Vi khuẩn A. xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2μm,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không có khả năng di động. Các tế bào
được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Chúng tích lũy khoảng
4,5% acid acetic trong môi trường, khi nồng độ acid vượt quá giới hạn cho
phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.
A. xylinum thường sống chung với nấm chè trong một loại nước giải khát
dân gian làm từ chè loãng gọi là “Thủy hoài sâm”, người Trung Quốc gọi là
“Hải bảo” hay “Vị bảo”, người Nga gọi là “Nấm chè”, người Pháp gọi là
“Champignon De Longue Vie - nấm trường sinh”, người Nhật gọi chúng là
“Kombucha” [5].
Vi khuẩn A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc,
không sinh bào tử. Thường sống trong giấm, rượu nhạt, nước ép hoa quả và
có cả trong đất. Theo Bergey [11], nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn A. xylinum
là 25 - 300C , pH tối ưu là 5,4 - 6,2.
1.1.2. Đặc điểm cấu trúc của CVK

vi khuẩn này nằm trong mạng lưới polymer giúp tế bào bám chặt vào bề mặt
môi trường và thu nhận chất dinh dưỡng dễ dàng hơn so với tế bào vi khuẩn
không nằm trong mạng lưới polymer.
Cellulose có các đặc tính như độ bền cơ học cao, tính thấm và tính hút
cao, trạng thái kết tinh giúp A. xylinum kháng lại sự thay đổi của môi trường
như việc thay đổi xuống 1 hay 2 đơn vị pH trong thời gian nuôi cấy hay do
lượng nước bị giảm đi, các chất chuyển hóa được sinh ra [2].
1.1.5. Môi trường nuôi cấy A. xylinum nhằm thu màng CVK
Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
5


dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng.
Nhu cầu sử dụng đường ở A. xylinum rất lớn và giữ vai trò quan trọng
trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng
các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công nghiệp khác nhau như: rỉ đường,
chất thải trong công nghệ sản xuất khoai tây và phomat, chất thải của nhà máy
sản xuất bột ngọt, nước dừa già, nước mía, …để làm nguyên liệu trong nuôi
cấy A. xylinum.
Trong đó, màng cellulose vi khuẩn lên men từ môi trường cao nấm men
được sử dụng phổ biến trên thế giới và có đặc tính bền hơn các màng màng
cellulose vi khuẩn lên men từ các môi trường khác.
1.2. Tổng quan về thuốc Cimetidin
1.2.1. Công thức
Công thức phân tử: C10H16N6S.
Phân tử lượng: 252,3.
Độ nóng chảy: 1420C.
Tên khoa học: N" – cyano – N methyl – N' - [2 - [[(5 – methyl - 1H imidazol – 4 - yl) methyl] thio] - ethyl] - guanidin [7].
Công thức cấu tạo của Cimetidin được mô tả ở hình 2.1.

phân phối trung bình của CM giữa dịch não tủy và huyết thanh thay đổi từ
0,03 – 0,18mcg/ml. Tỷ lệ này là 0,2 – 0,5 ở người bệnh gan hay thận. Tỷ lệ
gắn protein huyết tương của CM là 18 – 26% ở mức nồng độ giữa 0,05 50mcg/ml. Ở những bệnh nhân loét dạ dày tá tràng thì tỷ lệ này đạt khoảng 13
– 25% (trung bình 19%) [7].
Chuyển hóa và thải trừ
CM và chất chuyển hóa của nó được đào thải qua thận. Khoảng 50 - 80%
tổng lượng CM dùng đường tiêm tĩnh mạch tồn tại dưới dạng không đổi trong
7


nước tiểu. Tỷ lệ này là 40% nếu dùng thuốc đường uống. Sự chuyển hóa CM
chỉ chiếm khoảng 25 - 40% tổng lượng thải trừ của CM và quá trình này phụ
thuộc vào độ tuổi [7]. Nửa đời thải trừ của CM khoảng 2 giờ, tăng lên khi suy
thận. Sulphoxide Cimetidin được chứng minh là chất chuyển hóa chính của
CM [23].
Độ tuổi đóng một vai trò quan trọng trong dược động học của CM. Tuổi
càng trẻ thì độ thanh thải càng lớn, trừ trẻ sơ sinh, độ thanh thải này giảm một
nửa từ độ tuổi 30 - 65 [7]. Một lượng nhỏ liều thuốc tiêm tĩnh mạch được đào
thải qua mật (Stephen J et al, 1979) [26]. CM có thể qua hàng rào nhau thai,
được bài tiết qua sữa mẹ và ở những người mẹ cho con bú, thuốc vào được cơ
thể trẻ nhiều mg/ngày [25].
1.2.5. Dược lực học của Cimetidin
Các thử nghiệm cho thấy CM là một chất đối kháng cạnh tranh chọn lọc
với thụ thể histamin H2 mà không có tương tác có ý nghĩa nào với
catecholamin, thụ thể β, thụ thể histamin H1, thụ thể muscarinic và không có
tác dụng kháng cholinergic. CM làm giảm bài tiết và giảm nồng độ acid dạ
dày cả ở điều kiện cơ bản (khi đói) và khi được kích thích bởi thức ăn,
histamin, pentagastrin, insulin và cafein [24]. Vì quá trình tiết acid cơ bản dài
nhất xảy ra vào ban đêm nên việc dùng thuốc sau ăn tối hoặc trước khi ngủ sẽ
đạt hiệu quả tối ưu. CM cũng ức chế enzym cytochrome P - 450, cytochrome

1.3.1. Tình hình nghiên cứu về màng CVK
1.3.1.1. Tình hình nghiên cứu về màng CVK tại Việt Nam
Tại Việt Nam việc nghiên cứu và sử dụng màng CVK từ vi khuẩn A.
xylinum ngày càng được quan tâm. Nguyễn Văn Thanh và cs (2006) [2] đã
tiến hành nuôi cấy, tinh chế và thu màng CVK từ A. xylium đạt hiệu cao.
Đồng thời nhóm nghiên cứu trên cũng đã tiến hành thử nghiệm in vivo trong
ứng dụng màng CVK điều trị bỏng với 2 loại màng CVK gồm cho thêm hoạt
chất tái sinh mô và hoạt chất kháng khuẩn. Kết quả cho thấy màng CVK có
cho thêm hoạt chất tái sinh mô từ dầu mù u làm gia tăng hiệu quả trị bỏng là
9


ưu điểm mà các loại màng khác trên thế giới không có.
Năm 2012, Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thị Thùy Vân, Trần Như
Quỳnh [3] đã công bố công trình nghiên cứu “Nghiên cứu vi khuẩn
Acetobacter xylinum tạo màng Bacterial cellulose ứng dụng trong điều trị
bỏng”, kết quả cho thấy màng CVK tạo bởi A. xylinum BNH2 tổng hợ có sợi
cellulose nhỏ, dai, độ bền kéo, độ thấu khí cao, độ hút nước tốt có triển vọng
ứng dụng làm màng trị bỏng.
1.3.1.2. Tình hình nghiên về màng CVK trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Tác giả Brown, 1989, dùng
màng CVK làm môi trường phân tách cho quá trình xử lý nước, dùng làm chất
mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho tế bào. Brown (1989) và cộng sự,
dùng màng như là một chất để biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền
quang, làm môi trường cơ chất trong sinh học, thực phẩm hoặc thay thế thực
phẩm. Đặc biệt Brown (1989), đã dùng CVK làm vải đặc biệt, để sản xuất giấy
chất lượng cao, làm cơ chất để cố định protein hay cho sắc kí.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng CVK là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Harmlyn và cộng sự



CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Giống vi khuẩn
Giống vi khuẩn A. xylinum thuần chủng được cung cấp bởi Phòng thí
nghiệm Vi sinh khoa sinh - KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2.
2.1.2. Nguyên liệu - hóa chất
Nguyên liệu: nước cất 2 lần, gạc vô trùng.
Hóa chất:
- Thuốc CM dạng tinh khiết 99,6%, nguồn gốc Trung Quốc
- Sử dụng hóa chất đặc biệt: cao nấm men.
- Các hóa chất thông thường: amoni sunfat, diamoni phosphat, acid
acetic, NaOH, HCl, đường glucose, pepton.
- Hóa chất dùng pha môi trường pH: HClđđ, KCl, acid citric,
Na2HPO4.12H2O, ethanol 960, thuốc thử fehling.
- Các hóa chất trên đều có nguồn gốc từ Việt Nam và Trung Quốc.
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ
2.1.3.1. Thiết bị
- Máy đo quang phổ UV - 2450 (Shimadzu - Nhật Bản);
- Cân phân tích (Sartorius - Thụy sỹ);
- Cân kỹ thuật - Sartorius TE 3102 S;
- Nồi hấp khử trùng HV - 110/HIRAIAMA;
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Tủ sấy, tủ ấm (Binder - Đức);
- Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA - Đức);
- Máy nước cất 2 lần (Hamilton - Anh);
- Bể ổn nhiệt (Đức);
- Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu;
Và nhiều dụng cụ hóa sinh thông dụng khác.

13


2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Môi trường lên men thu màng CVK
A. xylinum được nuôi cấy trong môi trường cao nấm men và được trình
bày ở bảng 2.1.
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng CVK
Glucose

20g

Acid citric

1,5g

Pepton

5g

Acid acetic

2%

Diamoni photphat 2,7g

Nước cất 2 lần

1000ml



Sơ đồ 2.1. Quy trình thu nhận màng CVK
- Tách CVK: Trong môi trường nuôi cấy tĩnh CVK tạo thành màng dày
ở mặt môi trường nuôi cấy, ép màng loại bỏ môi trường.
- Ngâm NaOH: Trong màng chứa một lượng lớn vi khuẩn vì vậy ngâm
màng trong NaOH 3% để phá vỡ thành tế bào vi khuẩn và giải phóng nội độc
tố của vi khuẩn.
- Ngâm HCl: Màng CVK sau khi được ngâm bằng NaOH rửa nước rồi
ép màng. Sau đó ngâm với HCl 3% khoảng 48 giờ để trung hòa hết NaOH.
- Ngâm nước: Màng sau khi ngâm với nước rửa rồi ép màng. Ngâm
nước đến trung hòa hết acid, thời gian khoảng 48 giờ ta thu được CVK tinh
chế.
- CVK sau khi được tinh chế sấy 90oC trong 4 giờ để loại bỏ nước.
15