BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
.........***........

NGUYỄN HỒNG HÀ

PHÁT HIỆN GEN MCR-1 VÀ XÁC ĐỊNH
ĐỘ NHẠY CẢM VỚI KHÁNG SINH COLISTIN CỦA
CÁC CHỦNG E. COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN
TẠI BA VÌ – HÀ NỘI
Chuyên ngành : Vi sinh
Mã số

: 62726801

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Nguyễn Vũ Trung

HÀ NỘI - 2017


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học
và Bộ môn Vi sinh – Trường Đại học Y Hà Nội đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn Vu
Trung trưởng Bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Y Hà Nội, người thầy đã hết

ESBL
KPC

mcr-1
MRSA
VRSA
ndm-1

MBL
PCR
MIC

Deoxyribonucleic Acid
Acid deoxyribonucleic
Extended-spectrum beta-lactamases
Enzym beta lactamase phổ mở rộng
Klebsiella pneumoniae carbapenemase
Klebsiella
pneumonia
sinh
enzym
carbapenemase
Mediated colistin resistance – 1
Gen kháng colistin trung gian plasmid - 1
Methicillin - resistant Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng kháng methicillin
Vancomycin - resistant Staphylococcus aureus
Tụ cầu vàng kháng vancomycin
New Delhi Metallo - beta - lactamase -1
Gen quy đinh sinh enzym Metallo beta

DANH MỤC BIỂU ĐỒ


DANH MỤC HÌNH


9

ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn kháng kháng sinh đã trở thành mối đe dọa với y tế toàn cầu.
Nhiều vi khuẩn gây bệnh đã kháng với nhiều loại kháng sinh thế hệ mới, phổ
rộng thậm chí nhiều chủng vi khuẩn đã kháng lại với tất cả các kháng sinh
theo khuyến cáo điều trị. Các vi khuẩn Gram âm đã và đang là những vi
khuẩn gây bệnh thường gặp và kháng kháng sinh với tỉ lệ cao [1]. Tại Việt
Nam, trong số các vi khuẩn gây bệnh được phân lập, vi khuẩn Gram âm
chiếm đa số với tỉ lệ phân lập được là 78,5%, trong đó, Escherichi coli đóng
vai trò quan trọng trong các nhiễm trùng đường tiết niệu, viêm màng não,
nhiễm khuẩn huyết, nhiễm trùng đường mật. E. coli là vi khuẩn tồn tại trong
tự nhiên, trong đường tiêu hóa của gia súc. Đây là nguồn lây truyền quan
trọng đối với nhiều nhiễm trùng ở người. Nhiều chủng E. coli đã kháng lại với
các cephalosporin thế hệ 3, 4, thậm chí với cả các kháng sinh nhóm
carbapenem [2], làm cho việc lựa chọn kháng sinh điều trị gặp nhiều khó
khăn. Trên lâm sang hiện nay, colistin là kháng sinh cuối cùng được sử dụng
đối với các trường hợp nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram âm đa kháng kháng
sinh gây ra.
Đã có các nghiên cứu chỉ ra mối liên quan chặt chẽ giữa việc sử dụng
kháng sinh và tính đề kháng kháng sinh trên các chủng vi khuẩn đặc biệt trên
các chủng trên động vật. Đáng chú ý là khi gần đây tình trạng kháng colistin
đang gia tăng một cách báo động, với sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn
Gram âm trong đó có E. coli mang gen mcr-1. Báo cáo đầu tiên về vi khuẩn

vi khuẩn học người Áo, phát hiện lần đầu tiên năm 1885. Chi Escherichia
thuộc họ vi khuẩn đường ruột, tồn tại và phát triển như vi hệ trong ruột của
người cũng như các loài gia súc. Trong các loài thuộc chi này, E. coli được
chọn là loài điển hình và có vai trò quan trọng nhất trong y học. Chúng có khả
năng truyền từ động vật sang người và trong quá trình đó chúng cũng truyền
các gen kháng thuốc từ động vật sang người.

CHƯƠNG 2: Đặc điểm sinh học [6]
CHƯƠNG 3: Hình thể:
E. coli là trực khuẩn Gram âm, có lông quanh thân, di động được, rất ít
khi có vỏ, không sinh nha bào.

CHƯƠNG 4: Nuôi cấy :
•

E. coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt
độ thích hợp 37⁰C, có thể phát triển được ở nhiệt độ 5 - 40⁰C. Hiếu và kỵ

•

khí tuỳ tiện.
Môi trường canh thang: Nuôi cấy sau 3 - 4 giờ vi khuẩn phát triển làm đục
nhẹ môi trường, sau 2 ngày trên mặt môi trường có váng mỏng, những

•

ngày sau vi khuẩn lắng xuống đáy ống.
Môi trường thạch thường: Nuôi cấy sau 8 - 10 giờ có thể nhìn thấy khuẩn
lạc riêng rẽ, khuẩn lạc to, tròn, lồi, mặt nhẵn, bờ đều, đường kính khoảng


năng sinh ra acetyl - metyl cacbinol E. coli có phản ứng V (-)
Phản ứng kiểm tra lên men đường inozitol (I): Trên thực tế không làm.
Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon từ citrate (C): E. coli phản ứng

citrat trong môi trường Simon âm tính C (-).
Ngoài ra E. coli không phân giải được ure, không sinh H₂S sau 48 giờ.

CHƯƠNG 6: Sức đề kháng
•
•

Đun E. coli ở 55°C trong 1 giờ hoặc 60°C trong 30 phút sẽ bị tiêu diệt.
Dễ bị diệt bởi các thuốc sát trùng thông thường.

CHƯƠNG 7: Kháng nguyên
•

E. coli có các kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K.
Kháng nguyên O: Có khoảng 157 quyết định kháng nguyên O được đánh

•
•

số 1, 2, 3, 4 ...
Kháng nguyên H: Có tới 52 quyết định kháng nguyên H.
Kháng nguyên K: Gồm có kháng nguyên L và B không chịu nhiệt và

•

kháng nguyên А, M chịu nhiệt, kháng nguyên bề mặt K thường ngăn cản

Nhóm EIEC (Enteroinvasive E. coli): Gây bệnh bằng sự xâm nhập của

E. coli vào đại tràng và gây bệnh bằng nội độc tố giống Shigella. Triệu chứng
lâm sàng như bệnh lỵ trực khuẩn.
Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli): Trong thực nghiệm, vi khuẩn
thuộc nhóm này tạo ra độc tố tác động trên tế bào vero (từ đó có tên là độc tố
vero) độc tố này tương tự như độc tố của Shigella dysenteriae. Nó tác động
vào tế bào biểu mô ruột và phá huỷ nhung mao của tế bào này.
EHEC (Enterohaemorhagic Е. coli): Cơ chế gây bệnh của nhóm này
chưa được biết rõ. Nhưng người ta khẳng định rằng, nó có một độc tố, có
kháng nguyên và cơ chế tác dụng gần như ngoại độc tố của Shigella shiga.
EAEC (Enteroadherent E. coli): Gây bệnh do bám dính vào niêm mạc
ruột làm cản trờ sự hấp thu chất dinh dưỡng.
•

Gây bệnh ngoài đường tiêu hoá
E. coli có thể gây nhiễm trùng đường tiết niệu, sinh dục, nhiễm trùng

đường gan - mật, nhiễm khuẩn vết thương, vết bỏng, viêm phế quản, viêm
phổi, viêm tai giữa, viêm xoang, viêm màng não mủ ở trẻ sơ sinh, nhiễm
khuẩn huyết.

CHƯƠNG 10: Mức độ kháng kháng sinh của E. coli gây bệnh
Tại Việt Nam, E. coli gây bệnh đã giảm nhạy cảm với cephlosporin thế
hệ 3 và có tỉ lệ kháng cao với cotrimoxazole dao động từ 60-80% tại hầu hết


14

các bệnh viện. Tỉ lệ kháng với carbapenems thấp hơn 2%, trừ Bệnh viện Bệnh

những loại kháng sinh khác ít độc hơn (như aminoglycosides ... ). Giữa những
năm 1970 và 1990, colistin không thường được sử dụng và số lượng những
nghiên cứu phân tích việc sử dụng cũng như dược lực học của colistin là rất
hiếm. Tuy nhiên gần đây, kháng sinh này đã được sử dụng trở lại với vai trò là
lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những vi khuẩn đa kháng như
Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae,
E. coli. Do các vi khuẩn Gram âm này ngày càng đóng vai trò quan trọng
trong những trường hợp nhiễm khuẩn và mức độ kháng kháng sinh ngày càng
tăng, colistin đóng vai trò ngày càng quan trọng. Tuy nhiên hiện nay đã ghi
nhận những chủng vi khuẩn Gram âm kháng lại colistin. Mặc dù cơ chế chính
xác gây ra kháng colistin vẫn chưa được xác định, nhưng có giả thiết cho rằng
hệ thống điều hòa gen PmrA - PmrB và PhoP - PhoQ đóng vai trò trong sự đề
kháng colistin. Và gần đây nhất đã có những nghiên cứu đưa ra sự liên quan
mật thiết giữa gen mcr-1 trên plasmid vi khuẩn và sự kháng colistin trên lâm
sàng, cũng như cơ chế kháng colistin do gen trên của vi khuẩn [3] [4].

CHƯƠNG 12: Cơ chế tác dụng và phổ kháng khuẩn, dạng
sử dụng, thải trừ thuốc.

Hình 1.2 Công thức hóa học của kháng sinh colistin
Colistin có hai dạng sử dụng colistin sulfate dùng tại chỗ và
colistimethate natri dùng toàn thân. Điều quan trọng cần lưu ý là hai dạng


17

này không thể thay thế lẫn nhau. Colistin sulfate mang điện tích dương và
ổn định, trong khi colistimethate natri mang điện tích âm và không ổn định về
mặt hóa học cả trong thực nghiệm lẫn trong cơ thể [11],[12]. Tuy nhiên,
colistimethate natri là dạng an toàn hơn nên được sử dụng đường tĩnh mạch vì

K. pneumoniae trong điều kiện thực nghiệm. Colistin cũng có hoạt tính chống
lại những vi khuẩn khác như Stenotrophomonas maltophilia, E. coli,
Salmonella species, Shigella species, Haemophilus influenzae, Bordetella
pertussis, và Legionella pneumophila [7].

CHƯƠNG 13: Cơ chế đề kháng colistin của vi khuẩn
• Một số cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung:
+

Đề kháng sinh thông qua các enzym:
Kháng carbapenem: Các vi khuẩn Gram âm đa kháng là có sự xuất hiện
các enzym kháng thuốc ESBL, KPC, hay nhóm enzym MBLs.
Kháng aminoside: Do enzym làm biến đổi nhóm Aminoglycoside

+

Đề kháng sinh qua thay đổi tính thấm của màng tế bào vi khuẩn
Kháng carbapenem: Do thay đổi protein, porin, bơm đẩy ngược ở màng
tế bào.

+

Kháng kháng sinh thông qua thay đổi đích tác động
Kháng quinolon: Do đột biến gen gyrA, parC, mexR

• Cơ chế đề kháng colistin chủ yếu là do sự thay đổi tính thấm của màng
Lipopolysarcarid (LPS) của tế bào vi khuẩn, là đích tác động chủ yếu của
colistin. Đây là cơ chế kháng của các loài vi khuẩn đặc trưng như E. coli, K.
pneumoniae, và P. aeruginosa [19]. Một cách khác gây nên kháng colistin là do
sự giảm hoạt động của các kênh protein hoặc các kênh calci, magie ở màng

với lớp màng ngoài. Những phát hiện này đã minh chứng rằng những nghiên
cứu chuyên biệt nhằm xem xét những cơ chế gen đằng sau sự khác biệt về
hình thái học và cấu trúc tế bào rất cần được thực hiện, để qua đó ta có thể
hiểu được nhiều hơn về sự đề kháng đối với colistin [20].
Như đã đề cập, ở những vi khuẩn đa kháng như E. coli, K. pneumoniae,
A. baumannii và P. aeruginosa sự cần thiết của những điều trị thay thế đã dẫn
đến sự trở lại của colistin. Mặc dù colistin cho thấy hiệu quả trong điều trị
nhiều loại nhiễm trùng khác nhau [8] nhưng việc sử dụng colistin nhằm điều
trị nhiễm trùng gây ra do bốn tác nhân trên gặp khó khăn bởi sự xuất hiện tình
trạng kháng thuốc. Sự gia tăng đề kháng colistin là một vấn đề rất đáng ngại.
Colistin là lựa chọn điều trị cuối cùng đối với những tác nhân gây bệnh này,
việc kháng thuốc có thể rất nguy hiểm cho bệnh nhân nếu không còn lựa chọn
điều trị nào khác.
Nhu cầu về kháng sinh thay thế trong điều trị E. coli, K. pneumoniae
ngày càng gia tăng cùng với sự gia tăng của men carbapenemases, men βlactamase phổ rộng (ESBL) và men metallo - beta- lactamase (MBL) sản sinh
ra từ những chủng khác nhau của những loại vi khuẩn này. Mặc dù những báo
cáo về sự đề kháng colistin của nhóm tác nhân này vẫn còn thưa thớt nhưng
chúng vẫn rất có ý nghĩa, bởi những lựa chọn điều trị hiện tại và trong tương
lai đối với E. coli, K. pneumoniae sinh ESBL và MBL rất hạn chế.
Trong một nghiên cứu tiến hành trên 18 mẫu phân lập được K.
pneumoniae kháng colistin (MIC > 8 mg/L) từ 13 bệnh nhân trong hơn 16
tháng tại một trung tâm chăm sóc đặc biệt ở Hy Lạp [21]. Tất cả những bệnh
nhân này đều có thời gian sử dụng colistin (trung bình 27 ngày) và nhập viện
điều trị (69 ngày) kéo dài, điều này có thể đóng góp vào việc gia tăng kháng
thuốc. Gần đây nhất, 6,8% (15 trong số 221 mẫu phân lập) [22] và 27,3% (6
trong số 22 mẫu phân lập) [23] mẫu K. pneumoniae phân lập được đã cho
thấy kháng colistin lần lượt tại miền nam Hàn Quốc và Australia. Cho thấy


21

22

hiện ra mcr-1 ở các chủng E. coli phân lập từ lợn và từ vết thương của một
người bị nhiễm trùng kháng carbapenem.

CHƯƠNG 15: Tình trạng sử dụng kháng sinh colistin trên
lâm sàng và trong chăn nuôi
Tính đến cuối năm 2015, số lượng tiêu thụ của colistin trong chăn nuôi
đã lên đến 11,942 tấn (tương ứng với 229,5 triệu USD). Nếu tình hình không
được kiểm soát, rất có thể đến cuối năm 2021, con số này sẽ còn cao lên đến
mức báo động 16,500 tấn với tỉ lệ gia tăng hằng năm là 4,75% [3]. Trước đây,
chúng ta cũng đã từng lo lắng về việc đề kháng kháng sinh như MRSA,
VRSA. Các nhà khoa học đã cảnh báo về việc vancomycin sẽ trở nên không
còn tác dụng đối với các vi khuẩn kháng thuốc. Tuy nhiên, thực tế trong vòng
15 năm cho thấy, chỉ có 14 ca trên toàn nước Mỹ là không chữa được với các
vi khuẩn kháng vancomycin. Song tình hình hiện tại lại là một cục diện hoàn
toàn khác, colistin đã bị lạm dụng quá nhiều trong chăn nuôi, điều này khiến
cho việc xuất hiện và lan truyền gen đề kháng từ động vật sang người bị mất
kiểm soát và không hề được chú ý. Sự phát triển của các vi khuẩn có khả năng
đề kháng tất cả các loại kháng sinh là hoàn toàn có thể xảy ra, vấn đề chỉ nằm
ở thời gian. Với việc chưa kiểm soát chặt chẽ được lượng thuốc kháng sinh sử
dụng trong chăn nuôi, Việt Nam cũng không nằm ngoài cục diện này. Năm
2015, theo thống kê có trên 17 loại kháng sinh được sử dụng tại các trang trại
chăn nuôi. Trong đó, các loại kháng sinh được sử dụng phổ biến là
norfloxacin,

tylosin,

gentamycin,


đã phát hiện ca lâm sàng đầu tiên nhiễm E. coli có mang gen mcr-1 [5]. Ở
châu Âu đã đưa ra các khuyến cáo về tình trạng gia tăng gen kháng colistin
mcr-1 do việc sử dụng kháng sinh một cách bừa bãi trong thức ăn chăn nuôi
và vai trò của việc sàng lọc gen mcr-1 trên các mẫu bệnh phẩm từ người cũng
như các mẫu từ môi trường.

CHƯƠNG 18: Tại Việt Nam
Hiện nay còn thiêu những nghiên cứu được thực hiện về việc sàng lọc gen
kháng colistin mcr-1 của E. coli trên mẫu ở người cũng như mẫu phân động vật
và xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng mang gen đó.

CHƯƠNG 19: Các kỹ thuật kháng sinh đồ [27]
CHƯƠNG 20: Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán


24

Nguyên lý: Kháng sinh trong khoanh giấy sẽ khuếch tán vào đĩa thạch
Mueller - Hinton đã được ria cấy các chủng vi khuẩn cần thử nghiệm. Mức độ
nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh sẽ được biểu hiện bằng đường kính các
vòng ức chế vi khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh.
• Ưu điểm: Giá thành rẻ, đơn giản và dễ thực hiện
• Nhược điểm: Kĩ thuật này chỉ phát hiện được mức độ nhạy cảm với nồng
độ kháng sinh đã biết trước và chỉ có tính chất định tính.

CHƯƠNG 21: Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế sự
phát triển của vi khuẩn (MIC)
Kĩ thuật kháng sinh hòa đều trong môi trường lỏng hoặc môi trường thạch
Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn thử nghiệm được nuôi cấy trong các
ống canh thang hoặc trên các đĩa thạch Mueller-Hinton có nồng độ kháng sinh

•

Nhược điểm: Chi phí cao do cần dùng trang thiết bị, sinh phẩm hóa chất
đắt tiền, cần có những người được đào tạo mới có thể sử dụng máy.

CHƯƠNG 22: Xác định gen liên quan đến kháng colistin, mcr-1 của E.
coli bằng PCR [28]
Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) do Karl Mullis và cộng
sự phát minh ra năm 1985 là phương pháp in vitro để nhân lên một đoạn DNA
nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần một số lượng mẫu ban đầu hạn chế.
Kĩ thuật này dựa trên nguyên lý tất cả các DNA polymerase khi hoạt
động tổng hợp một mạch DNA mới từ khuôn đều cần sự hiện diện của những
mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA có độ dài khoảng từ 18-40
nucleotit, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ dùng dNTPs nối dài mồi hình thành mạch DNA mới bổ sung
với DNA khuôn (tùy vào mục đích nghiên cứu, sẽ lựa chọn mồi riêng để có
được đoạn DNA cần tổng hợp). Nhờ đó, từ một khối lượng mẫu ban đầu hạn
chế tạo ra đủ lượng DNA cần thiết có thể quan sát được dưới ánh sáng UV sau
khi điện di sản phẩm PCR trên gel agarose.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
3 bước: Giai đoạn biến tính tách đôi sợi DNA (denaturation), giai đoạn bắt
cặp (annealing), giai đoạn kéo dài (elongation – extension).