ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THU HẰNG

ĐINH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B6 VÀ B12
̣
TRONG THUỐC NEUROBION, SCANNEURON BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VÀ QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Thái Nguyên, năm 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN THU HẰNG

ĐINH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI VITAMIN B1, B6 VÀ B12
̣
TRONG THUỐC NEUROBION, SCANNEURON BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
VÀ QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60.44.01.18


i


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tác giả đã nhận được
nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn bè
và gia đình.
Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
Khoa Hóa ho ̣c, Phòng Đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái
Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp
tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Đặc biệt tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai
Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những
người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện
đề tài nghiên cứu của mình.
Với thời gian nghiên cứu có hạn, khối lượng công viêc̣ lớn, khả năng
nghiên cứu còn hạn chế, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu
sót. Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp từ các thầy giáo, cô giáo
và bạn đọc.
Xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 04 năm
2017
Tác giả

Nguyễn Thu Hằng

ii

Chương 2. THỰC NGHIỆM .................................................................... 33

iii


2.1. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 33
2.1.1. Phương pháp HPLC ........................................................................... 33
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử .......................................... 33
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 34
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyế t .................................................... 34
2.2.2. Phương pháp thực nghiê ̣m ................................................................. 34
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích ......................................... 35
2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) ................................................................. 35
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ) ............................................................... 35
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp ............................................... 35
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê ................................ 36
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................ 37
2.4.1. Thiết bị ............................................................................................... 37
2.4.2. Dụng cụ .............................................................................................. 37
2.4.3. Hóa chất ............................................................................................. 37
2.4.4. Chế phẩm Neurobion ......................................................................... 38
2.4.5. Chế phẩm Scanneuron ....................................................................... 38
2.5. Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu ................................................ 38
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN......................... 40
3.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử ............................................. 40
3.1.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của các vitamin B1, B6 và B12 .......... 40
3.1.2. Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia
của các vitamin B1, B6 và B12. Xác định chỉ số LOD và LOQ ................. 41
3.1.3. Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các
mẫu tự pha ................................................................................................... 48


Vitamin B1

Thiamine

B6

Vitamin B6

Pyridoxine

B12

Vitamin B12

Xyanocobalamin

HPLC

Phương pháp sắc kí lỏng hiệu High Performance Liquid
năng cao

Chromatography

LOD

Giới hạn phát hiện

Limit Of Detection


Bả ng 3.5. Đô ̣ hấ p thu ̣ quang củ a vitamin B12 ở các giá trị nồ ng độ ....... 46
Bảng 3.6. Kết quả tính LOD và LOQ của vitamin B12 ............................ 48
Bả ng 3.7. Pha chế cá c dung di ch
̣ hỗ n hơ p̣ vitamin B1 và vitamin B6 ..... 48
Bả ng 3.8. Kế t quả tí nh nồ ng đô ̣, sai số củ a vitamin B1 và vitamin B6
trong hỗ n hơ p̣ .......................................................................... 49
Bả ng 3.9. Pha chế cá c dung di ch
̣ hỗ n hơ p̣ vitamin B1 và vitamin B12 ... 50
Bả ng 3.10. Kế t quả tí nh nồ ng đô ̣, sai số củ a vitamin B1 và vitamin B12
trong hỗ n hơ p̣ .......................................................................... 50
Bả ng 3.11. Pha chế cá c dung di ch
̣ hỗ n hơ p̣ vitamin B6 và vitamin B12.. 51
Bả ng 3.12. Kế t quả tí nh nồ ng đô ̣, sai số củ a vitamin B6 và vitamin B12
trong hỗn hơ p̣ .......................................................................... 52
Bảng 3.13. Pha các dung dịch chuẩ n vitamin B1, vitamin B6, vitamin
B12 và hỗ n hơ p̣ ..................................................................... 53
Bả ng 3.14. Kế t quả tí nh nồ ng đô ̣, sai số củ a vitamin B1, vitamin B6 và
vitamin B12 ........................................................................... 53
Bảng 3.15. Kết quả tính nồng độ, sai số các vitamin B1, B6 và B12 trong
mẫu thuốc Neurobion ............................................................ 55
Bảng 3.16. Kết quả tính nồng độ, sai số B1, B6 và B12 trong mẫu thuốc
Scanneuron ............................................................................ 57
v


Bảng 3.17. Thành phần các dung dịch chuẩn B1, B6 và B12 thêm vào
dung dịch mẫu thuốc Neuronbion .......................................... 59
Bảng 3.18. Kết quả xác định độ thu hồi của các vitamin B1, B6 và B12
trong mẫu thuốc Neuronbion ................................................. 60
Bảng 3.19. Thành phần các dung dịch chuẩn B1, B6 và B12 thêm vào

Hình 3.1. Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn các vitamin B1, B6 và B12 ... 40
Hình 3.2. Phổ hấp thụ quang của vitamin B1 ở các nồng độ 0,1  40,0g/mL ..... 41
Hình 3.3. Đường hồ i quy tuyế n tính biể u diễn sự phu ̣ thuô ̣c của đô ̣ hấ p thu ̣
quang A vào nồ ng đô ̣ của vitamin B1 .............................................. 42
Hình 3.4. Phổ hấp thụ quang của vitamin B6 ở các nồng độ 0,1  50,0g/mL .... 44
Hình 3.5. Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ
quang A vào nồng độ của vitamin B6 .............................................. 45
Hình 3.6. Phổ hấp thụ quang của vitamin B12 ở các nồng độ 0,1  50,0g/mL ... 46
Hình 3.7. Đường hồ i quy tuyế n tính biể u diễn sự phu ̣ thuô ̣c của đô ̣ hấ p thu ̣
quang A vào nồ ng đô ̣ của vitamin B12 ............................................ 47
Hình 3.8. Sắc ký đồ của vitamin B1 400 µg/mL tại bước sóng λ = 278 nm ..... 65
Hình 3.9. Sắc ký đồ của vitamin B6 800 µg/mL tại bước sóng λ = 278 nm ..... 65
Hình 3.10. Sắc ký đồ của vitamin B12 800 µg/mL tại bước sóng λ = 278nm....... 66
Hình 3.11. Sắc ký đồ của vitamin B1 (1), vitamin B6 (2) và vitamin B12 (3) .... 67

vi


Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của vitamin B1 ..................................................................... 70
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của vitamin B6 ..................................................................... 71
Hình 3.14. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện
tích pic của vitamin B12 ................................................................... 71

vii


MỞ ĐẦU
Những năm gần đây, ở nước ta thuốc tân dược được bán rộng rãi trên


2


Vitamin B1 không ổn định với ánh sáng và độ ẩm. Mất hoạt tính trong môi
trường trung tính và bazơ. Ổn định tính chất ở pH = 4.
Dạng chế phẩm của vitamin B1 có thể tồn tại ở dạng thiamin
monohydroclorua, thiamin mononitrat… [12].
1.1.1.3. Tính chất hóa học
Vitamin B1 là dẫn xuất pyrimidin gắn với dẫn xuất thiazol qua nhóm
metylen.
Do có 3 nguyên tử N nên mang lại cho vitamin B1 tính bazơ. Tuy nhiên 2
nguyên tử N có tính bazơ yếu. Vì vậy chế phẩm được dùng loại thiamin
monohydroclorua, dung dịch của chúng trong nước có môi trường axit, chúng dễ
tan trong nước và vững bền hơn thiamin bazơ.
Do nguyên tử N bậc 4 nên vòng thiazol trong thiamin kém vững bền đặc
biệt trong môi trường kiềm. Trong môi trường này vòng bị mở và lúc đó dễ bị
oxi hóa thành các sản phẩm không có hoạt tính vitamin. Do vậy khi pha chế dung
dịch thiamin phải đựng trong cốc thủy tinh trung tính, pH của dung dịch phải
axit.
Vitamin B1 bị oxy hóa bởi K3[Fe(CN)6] trong môi trường kiềm tạo thành
thiocrom màu vàng phát huỳnh quang màu xanh da trời. Phản ứng này được
dùng để định tính vitamin B1 và định lượng vitamin B1 bằng phương pháp đo
huỳnh quang [8].

Nhóm -OH trong phân tử làm cho vitamin B1 có thể ete hóa hay este hóa
tạo thiamin panmitat, thiamin stearat, thiamin phtalat… song quan trọng nhất là
tạo với H3PO4 thiamin pyrophotphat (TPP) – là coenzym xúc tác nhiều quá trình
chuyển hóa trong cơ thể.



CH3-COOH


Thiamin pyrophotphat là coenzym xúc tác cho quá trình phân giải các xeto
axit như axit pyruvic, axit oxaloaxetic…Vì vậy khi thiếu vitamin B1, sự chuyển
hóa các xeto axit bị ngừng trệ làm cho cơ thể tích lũy một lượng lớn các xeto axit
làm rối loạn trao đổi chất và gây nên trạng thái bệnh lí nguy hiểm. Vì thế nhu
cầu vitamin B1 đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng [8].
1.1.1.4. Tổng hợp vitamin B1
Vitamin B1 có thể được tổng hợp từ phản ứng giữa 2–methyl–4–amino–5–
bromo–methyl–pyrimidine–hydrobromide (A) và 4–methyl–5–β–oxy–ethylthiazole (B). Sau đó cho sản phẩm thu được qua axit clohidric 10% [12].

1.1.1.5. Chức năng của vitamin B1
Vitamin B1 là thành phần của men thiamin pyrophotphat (TPP) có vai trò
rất quan trọng trong chuyển hoá chất bột, đường (gluxit). Vitamin B1 cần cho
quá trình tổng hợp axit ribonucleic (RNA), axit deoxyribonuleic (DNA) là những
axit liên quan đến quá trình di truyền, vitamin B1 cũng cần cho quá trình tổng
hợp nicotinamit adenin dinucleotit photphat khử (NADP) cần cho tổng hợp axit
béo mà các axit béo không no lại có rất nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể (là
thành phần của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như lipoprotein, là yếu
tố cần thiết của màng tế bào, các tổ chức liên kết, tổ chức thần kinh...). Vitamin
B1 còn tham gia vào quá trình sản xuất và giải phóng chất dẫn truyền thần kinh
axetylcolin, chuyển hoá một số axit amin cần thiết như leucin, isoleucin và valin
(các axit amin này có nhiều vai trò rất quan trọng trong cơ thể).

5


Khi thiếu vitamin B1 kéo dài sẽ bị mắc bệnh Beri - beri. Ở người trưởng

Lượng vitamin B1 cần cung cấp hằng ngày cho cơ thể: trẻ em 1 – 12 tuổi
0,7 – 1,2mg; trẻ trên 12 tuổi là 1,3 – 1,5mg; người lớn nam là 1,5mg và nữ là
1,3mg; phụ nữ mang thai và nuôi con bú là 1,8mg.
Bảng 1.1. Hàm lượng vitamin B1 trong một số thực phẩm
Thực phẩm

Hàm lượng

Thực phẩm

(mg/100g)

Hàm lượng
(mg/100g)

Cao men bia

3,10

Bánh mì từ bột thô

0,34

Đậu nành khô

1,10

Lòng đỏ trứng gà

0,32

7


- Vitamin B6 tồn tại ở 3 dạng: pyridoxine, pyridoxal và pyridoxamine. Cả 3
dạng này đều có trong các thực phẩm từ động thực vật và có hoạt tính tương
đương nhau. Cấu trúc hóa học của 3 dạng vitamin B6 như sau:

1.1.2.2. Tính chất vật lý
Pyridoxin bazơ là những tinh thể không màu nóng chảy ở 160oC, tan được
trong nước.
Pyridoxin bazơ nóng chảy ở 204-208oC, rất dễ tan trong nước và tan dược
trong etanol.
Bền khi đun sôi trong dung dịch axit, kiềm nhưng không bền khi có mặt các
chất oxy hóa.
Cả 3 chất đều hấp thụ bức xạ tử ngoại vì vậy có thể đo phổ hấp thụ vùng tử
ngoại để định tính và định lượng vitamin B6 [8].
1.1.2.3. Tính chất hóa học
Cả 3 hợp chất pyridoxine, pyridoxal và pyridoxamine đều là dẫn xuất của
pyridin, vị trí số 3 có nhóm hydroxyl phenyl, vị trí số 5 có nhóm hydrometyl.
Chúng chỉ khác nhau nhóm thế ở vị trí số 4. Do vậy:
Cả 3 chất đều có tính bazơ (nhân pyridin) nên:
- Tác dụng với các axit tạo muối. Chế phẩm được dùng là pyridin
hydroclorit dễ tan trong nước, tạo muối, kết tủa với axit silicovolframic, axit
photphovolframic.
- Định lượng chúng bằng phương pháp đo axit trong môi trường khan. Do
có nhóm hydroxyl phenyl mà cả 3 chất đều có tính chất:

8




Một số trẻ sơ sinh biểu hiện hội chứng lệ thuộc pyridoxin có tính di truyền
nên cần dùng pyridoxine trong tuần đầu tiên sau khi sinh để phòng thiếu máu và
chậm phát triển. Nguyên nhân không biết rõ nhưng dấu hiệu là khóc quấy nhiều
và có cơn run giật kiểu động kinh [8].
1.1.2.5. Dạng bào chế
- Dạng viên nén: 5mg, 10mg, 25mg, 50mg, 100mg, 250mg, 500mg.
- Dạng thuốc tiêm: 50mg/mL, 100mg/mL.

Hình 1.4. Các dạng bào chế của vitamin B6
1.1.2.6. Nhu cầu vitamin B6 và nguồn thực phẩm
Điều trị bệnh thiếu vitamin B6 với phụ nữ có thai và cho con bú: ngày
5 - 25mg, dùng trong 3 tuần sau đó duy trì ngày 1,5 – 2,5mg.
Hội chứng phụ thuộc pyridoxin dùng 10 – 250mg/ngày; trẻ sơ sinh
2 – 15mg/ngày; viêm thần kinh do thuốc 25 – 50mg/ngày.
Nguồn vitamin B6 chính trong thực phẩm là khoai tây và các loại rau quả
khác, sữa và thịt.

10


Bảng 1.2. Hàm lượng vitamin B6 trong một số thực phẩm
Thực phẩm

Hàm lượng

Thực phẩm

(mg/100g)



Bánh mì bột thô

0,12

Cá trắng

0,29

1.1.3. Vitamin B12
1.1.3.1. Giới thiệu về vitamin B12
- Tên thông thường: vitamin B12 hay xyanocobalamin
- Tên IUPAC: α – (5,6 – dimethylbenzimidazolyl)cobanmidcyanide
- Công thức phân tử: C63H88CoN14O14P
- Khối lượng mol phân tử: 1355,36g/mol

Hình 1.5. Công thức cấu tạo của vitamin B12
- Vitamin B12 là những hợp chất hữu cơ có nguyên tử coban ở trung tâm,
với tên gọi là những cobalamin và có hoạt tính sinh học trên cơ thể người.

11


- Hiện nay biết khoảng 100 loại tương tự vitamin B12. Các chất thường
gặp là: xiacobalamin, hydroxycobalamin, nitritocoalamin [12].
1.1.3.2. Tính chất của vitamin B12
- Kết tinh dưới dạng tinh thể nhỏ, không có mùi, vị.
- Tan tốt trong nước, dung dịch trung tính và cồn. Không tan trong axetol,
ete, benzen, clorofom.
- Dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, dễ mất hoạt tính khi tiếp xúc với kim loại

- Dạng thuốc tiêm: 200µg/mL, 500µg/mL, 1000 µg/mL, 1 mg/mL, 1mg/4 mL.

Hình 1.6. Các dạng bào chế của vitamin B6
1.1.3.5. Nhu cầu vitamin B12 và nguồn thực phẩm
- Hàm lượng vitamin B12 tối thiểu cần thiết cho hoạt động bình thường
của cơ thể lại rất thấp không quá 3µg.
- Trên nguyên tắc chỉ cần uống một ly sữa đã đủ cung ứng vitamin B12
cho cơ thể.
- Trẻ sơ sinh bú sữa mẹ có thể thiếu vitamin B12 nếu người mẹ ăn chay
và không uống sữa .
- Trên đối tượng bị đau nhức cũng như viêm dây thần kinh, nhiều nhà điều
trị có khuynh hướng dùng vitamin B12 với liều cao trong khoảng 1000 - 5000µg,
nghĩa là cao gấp 300 – 1500 lần nhu cầu thông thường.
- Vitamin B12 có ý nghĩa rất quan trọng đối với chăn nuôi gia súc. Nó làm
tăng sự hấp thụ thức ăn protein thực vật, tăng trưởng và tích lũy mỡ.
- Vitamin B12 cũng làm tăng sinh đẻ trứng gà ở gà mái.
Thành phần vitamin B12 tương đối thấp trong rau quả, chủ yếu có nhiều
trong gan, thịt, cá, trứng, sữa, men bia.
13