ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HUỲNH TÚ PHƯƠNG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT MÀU NHUỘM GÂY
UNG THƯ TRONG CÁC LOẠI VẢI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO GHÉP ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ (HPLC/MS)
Chuyên ngành: HÓA PHÂN TÍCH
Mã số: 604429

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN THỊ XUÂN MAI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 11/2011

LỜI CẢM ƠN
1.2.2. Nhóm chất màu nhuộm Acid 8
1.2.3. Nhóm chất màu nhuộm Baz 9
1.2.4. Nhóm chất màu nhuộm phân tán 10
1.3. Công dụng 11

1.4. Độc tính 12
1.5. Các phương pháp xác định 14
1.5.1. Nhận định chung 14
1.5.2. Tiêu chuẩn DIN 54231-2005 15
1.5.3. Phương pháp LC/DAD 17

1.5.4. Phương pháp LC/MS/MS 18
1.6. Khái quát về sắc ký lỏng ghép khối phổ 19
1.6.1. Khái quát về sắc ký lỏng hiệu năng cao 19
1.6.1.1. Bộ phận bơm trong HPLC 20
1.6.1.2. Pha động 20
1.6.1.3. Bộ phận tiêm mẫu 21
1.6.1.4. Cột sắc ký 21
1.6.1.5. Đầu dò 21
1.6.2. Khái quát về đầu dò khối phổ 21
1.6.2.1. Nguyên tắc hoạt động của thiết bị MS Agilent 6100 21
1.6.2.2. Nguồn ion hóa 23
a. Ion hóa bằng phun điện tử (ESI) 24
b. Nguồn ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) 26
c. Nguồn ion hóa quang học ở áp suất khí quyển (APPI) 27
1.6.2.3. Bộ phận phân tích khối tứ cực và chế độ quét 27
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 29
2.1. Nội dung 29
2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch 29
2.2.1. Thiết bị, dụng c

Danh mục các kí hiệu viết tắt dùng trong luận văn
ACN: Acetonitril.
APCI: Kỹ thuật ion hóa hóa học ở điều kiện áp suất khí quyển (atmosphere pressure
chemical ionization).
CAS: Chemical abstracts service.
CI: Chỉ số màu sắc.
DAD: đầu dò mạng điốt.
DIN: Tiêu chuẩn Đức.
ESI: Kỹ thuật ion hóa phun điện tử (electrospray ionization).
EtOH: Ethanol.
GC: Sắc ký khí.
HPLC/MS: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép đầu dò khối phổ.
HH: Hỗn hợp.
IIS: Institute for Interlaboratory Studies (tổ chức đánh giá kết quả thử nghiệm thành
thạo).
IRM: internal preference material (mẫu tham khảo nội bộ).
MeOH: Methanol.
LOD: Giới hạn phát hiện của thiết bị
LOQ: Giới hạn định lượng của thiết bị.
MSD: Mass selective detector (đầu dò chọn lọc khối phổ).
ND: Not detected (không phát hiện)
RSD: Độ lệch chuẩn tương đối.
SD: Độ lệch chuẩn.
T
r
: Thời gian lưu.
TOF: Time Of Flight (phân tích theo thời gian bay).
TLC: Sắc ký bản mỏng.
TLTK: Tài liệu tham khảo.
UV-Vis detector: đầu dò ở vùng tử ngoại và vùng thấy được.

Danh mục đồ thị, hình vẽ Trang
Hình 1.1. Công thức cấu tạo của 16 chất màu nhuộm gây ung thư 6
Hình 1.2. Màu sắc của các chất ở nồng độ 2 ppm. 7
Hình 1.3. Chứng minh khả năng gây ung thư từ benzidine 13
Hình 1.4. Chương trình gradient pha động theo tiêu chuẩn DIN 54231 16
Hình1.5. Sắc ký đồ tách các chất trên thiết bị LC/MS-ESI (chuẩn 10 mg/l) 17
Hình 1.6. Sơ đồ hoạt động của máy sắc ký lỏng 19
Hình 1.7. Cấu tạo nguồn MS của thiết bị MSD 6120B Agilent.
22
Hình 1.8. Bộ tứ cực phân tích khối 23
Hình 1.9. Nguồn ion hóa ESI 25
Hình 1.10. Giải phóng ion khỏi dung dịch 25
Hình 1.11. Nguồn ion hóa APCI 26
Hình 1.12. Nguồn ion hóa APPI 27
Hình 1.13. Sơ đồ cấu tạo của bộ tứ cực và sự di chuyển của ion trong tứ cực 27
Hình 1.14. Bộ phân tích khối tứ cực hoạt động ở cả hai chế độ Scan và SIM 28
Hình 2.1. Cơ chế phân mảnh ion của một vài chất màu nhuộm 38
Hình 2.2. Khảo sát dung môi pha động 39
Hình 2.3. Chương trình gradient pha động 47
Hình 2.4. Sắ
c ký đồ của 16 chất dùng chương trình gradient (HPLC/DAD) 48
Hình 2.5. Sắc ký đồ của chuẩn đơn dùng chương trình gradient (HPLC/DAD) 48
Hình 2.6. Sắc ký đồ của hỗn hợp 16 chất dùng chương trình gradient (HPLC/MS)52
Hình 2.7. Sắc ký đồ của 16 chất dùng chương trình gradient (nồng độ 5ppm) 54
Hình 2.8. Qui trình xử lý mẫu 56
Hình 2.9. Biểu đồ biểu diễn sự ổn định theo thời gian của chất DY3 61
Hình 2.10. Chế độ SIM phân mảnh DB6 mẫu và chuẩn (thế phân mảnh 180V) 64
Hình 2.11. Chế độ SIM phân mảnh DY3 trên chuẩ
n và mẫu thật (thế phân mảnh
180V) 65

Ở thị trườ
ng Châu Âu, ban hành nghị định 1999/43/EC để cấm buôn bán và
sử dụng các chất nhuộm màu gây ung thư và 3 năm sau đó quyết định 2002/371/EC
đưa ra việc sử dụng hạn chế 9 chất nhuộm màu gây ung thư trên các vật liệu vải
[14]
.
Do vậy các nhà sản xuất hàng hóa, giày dép, xuất khẩu sang thị trường Châu Âu
như Adidas, Clarks, rất quan tâm đến việc kiểm tra chỉ tiêu này để sản phẩm đạt

2
chất lượng cao. Giới hạn cho phép trong sản phẩm là 5mg/l (theo tiêu chuẩn DIN
54231-2005)
[7]
.
Việc xác định nhóm màu gây ung thư đang được nghiên cứu và phát triển
trong nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và một số phòng thí nghiệm dịch vụ
nước ngoài tại Việt Nam nhằm đáp ứng nhu cầu kiểm định sản phẩm để xuất khẩu
của khách hàng. Do đó, đề tài “Phát triển phương pháp xác định một số chất nhuộm
màu gây ung thư trong các loại vải bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệ
u năng cao
ghép đầu dò khối phổ (HPLC/MS)“ nhằm đáp ứng nhu cầu trên.
Mục tiêu thực hiện đề tài:
1. Xây dựng phương pháp tối ưu để xác định đồng thời một số chất màu nhuộm
gây ung thư (carcinogenic dyes) trên nhiều loại vải như coton, polyester, vải
tổng hợp polyester, cotton và polyamid.
- Khảo sát tìm điều kiện tối ưu trên hệ máy HPLC/MS.
- Đánh giá phương pháp đã xây dựng.
2.
Áp dụng phương pháp vừa xây dựng để kiểm soát đánh giá chất lượng sản
phẩm.

nhiên, đồ chơi, giấy. Rất đáng tiếc là phần lớ
n các loại chất màu nhuộm này chính
là tác nhân gây ung thư vì các chất nhuộm này có chứa nhóm azo có thể bị khử bởi
hiện diện của vi khuẩn trong đường ruột, các enzyme trong gan, hình thành nên
các amin thơm gây ung thư.

1.2. Đặc điểm chung và cấu tạo hóa học của chất nhuộm màu gây
ung thư
[2], [13], [14]
:
Theo qui định của Hiệp Hội Châu Âu (the directive 1999/43/EC) và tiêu chuẩn
Oeko Tex 100 cấm buôn bán sử dụng các loại màu nhuộm gây ung thư này vào năm
1999 và theo qui định 2003/371/EC hạn chế sử dụng 9 chất màu thuộc nhóm này. Ở
đây chúng tôi mở rộng thành xác định 16 chất màu gây ung thư dựa trên yêu cầu
thực tế của khách hàng: 4
5 6
Phân tử chất màu nhuộm chứa một số nhóm chức nhất định, chủ yếu là nhóm
hydroxyl và nhóm amin (– OH , – NH
2
), những nhóm này vừa làm nhiệm vụ trợ
màu vừa tạo cho thuốc nhuộm thực hiện liên kết hydro với vật liệu. Nhóm màu
nhuộm trực tiếp là loại màu nhuộm mà các ion mang màu của nó liên kết với
cellulose bằng lực liên kết hóa học và các phân tử chất màu nhuộm xen kẻ với xơ
sợi bằng lực liên kết Vander Waals. Tất cả chất màu nhuộm trực tiếp đều hòa tan
trong nước do trong phân tử có chứa nhóm ư
a nước SO
3
Na
-
và khi hòa tan, chúng
phân ly thành ion âm mang màu và ion dương không mang màu.
Ví dụ: Chất màu nhuộm trực tiếp lên sợi cellulose
[13 tr61]
:

1.2.2. Nhóm chất màu nhuộm Acid:
Các chất màu nhuộm acid được nghiên cứu trong đề tài là: Acid Red 26 (AR26),
Acid Violet 49 (AV49).
Đa số loại này là những hợp chất sulfonic hóa chứa một hoặc nhiều nhóm SO
3
H
-

và một vài dẫn xuất carboxyl hóa chứa nhóm -COOH dễ tan trong nước. Chúng

9

…vì vậy chúng dễ tan trong nước.
Chúng thường được dùng rộng rãi trong công nghệ giấy vì có thể kết hợp với nhóm
acid trong sợi cellulose để tạo thành liên kết muối gắn trên xơ sợi. Nghĩa là chất
màu nhuộm được proton hóa hoặc có nhóm dương điện như amonium, chẳng hạn
dễ kết hợp với điện âm trong xơ sợi. Vì vậy thường nhuộm chất cầm màu axít để
tăng khả nă
ng hòa tan của thuốc nhuộm trong nước. Thêm acid vào dung dịch chất
màu nhuộm để kết tủa chất màu nhuộm lên xơ sợi, tức là giảm khả năng phân ly của
chất màu nhuộm, giảm tốc độ nhuộm và làm màu sắc được đều hơn, nhưng nếu acid
mạnh quá, ngược lại xơ sợi có thể không nhuộm màu được. Các anion cũng làm
chậm tốc độ nhuộm, do chúng tác dụng với thuốc nhuộm tạo thành các phức chất
không có ái lực với xơ sợi, phức chất bị phân hủy chậm ngay cả ở nhiệt độ cao. Khi
thêm các cation vào dung dịch, tốc độ nhuộm chậm lại vì các cation này cạnh tranh

10
với những cation của thuốc nhuộm để chiếm lấy những trung tâm trên vật liệu
nhuộm, nên phải chú ý cả nước dùng để nhuộm, nếu nước cứng thì xuất hiện gốc
muối không hòa tan, làm màu nhạt, nếu có gia nhiệt trong môi trường kiềm thì
thuốc nhuộm bị phá hủy mất màu.

1.2.4. Nhóm chất màu nhuộm phân tán:
Trong đề tài chúng tôi sẽ đề cập đến các chất màu nhuộm phân tán sau:
Disperse Blue 1 (DB1), Disperse Yellow 3 (DY3), Disperse Orange 11(DO11),
Solvent Yellow 1 (SY1), Solvent Yellow 2 (SY2), Solvent Yellow 3 (SY3)).
Loại màu này thường có cấu trúc phân tử nhỏ và hòa tan tốt trong chất dầu
với hạn chế hòa tan trong nước. Phân tử màu được hòa trong sợi và người ta dùng
cho qui trình nhuộm các dung môi hữu cơ (chất dẫn, chất kích hoạt phản ứng). Các
lỗi xảy ra trong qui trình nhuộm (nhuộm quá màu, sai loại sợi…) sẽ dẫn đến tình
trạng giả
i phóng chất màu ra ngoài. Với khả năng hòa tan trong dầu, hạt phân tử

- Là phẩm màu dùng cho nhuộm và in hoa hàng dệt: lụa, tơ tằm, len. Và cho các
ngành như pha chế sơn mài, nhuộm giấy in, văn phòng phẩm, nhuộm da thuộc, lông
thú. Có thể tóm tắt công dụng của các loại chất màu nhuộm nói trên ở bảng 1.1.
Bảng 1.1. Ứng dụng thực tế của các nhóm màu nhuộm lên các nền vải
[10 tr6]
Nhóm sợi dựa trên nguồn
gốc và polymer hóa
Tên nhóm
Acid

Baz
Phân
tán
Trực
tiếp
Sợi cellulose tự nhiên Cotton
Vải lanh
x
x
Sợi protein tự nhiên Len
Tơ
x
x
(x)
(x)
x
x
Sợi cellulose nhân tạo Viscose
Acetate
Triacetate

Có nhiều bài báo nghiên cứu về độc tính gây ung thư của các chất màu
nhuộm này, điển hình là bài báo của Viện nghiên cứu khoa học về chất độc quốc gia
Hoa Kỳ (National toxicology program). Tác giả đã chứng minh thành công độc tính
của Direct Black 38, Direct Blue 6, Direct Brown 95 thử nghiệm ở chuột trong 13
tuần
[16]
. Tác giả chia thành 2 nhóm: nhóm 10 con chuột cống và 10 con chuột
thường. Trong từng nhóm, tác giả chia theo giới tính. Mức nồng độ được dùng cho
chuột cống là: 190, 375, 750, 1500, 3000 ppm. Mức nồng độ dùng cho chuột
thường là: 750, 1500, 3000, 6000, 12500 ppm. Những con chuột cống đực và chuột
cống cái khi tiêu thụ các chất màu ở nồng độ 3000 ppm và 1500 ppm Direct Brown
95 chết trước khi kết thúc thí nghiệm. Một con đực tiêu thụ Direct Blue 6 ở nồng độ
1500 ppm, 6 con đực khác tiêu thụ Direct Black 38 ở 1500 ppm và 2 con đực khác
tiêu thụ Direct Brown 95 ở nồng độ 750 ppm cũng chết khi kết thúc thí nghiệm.
Những con còn sống sót khi thử nghiệm nước tiểu đều phát hiện benzidine – nguồn
gốc gây ra bệnh ung thư. Tổ chức IARC (International Agency for Research on
Cancer) cũng đưa ra đánh giá về độc tính của các chất màu như Disperse Yellow 3,
Basic Red 9, Basic Violet 14.
Độc tính của chúng được minh họa bằng cơ chế của quá trình khử các chất
màu nhuộm azo thành các amine thơm gây ung thư
[4]
. 13
Sản phẩm của quá trình khử sẽ tạo benzidine- được chứng
minh là tác chất gây ung thư

Hình 1.3. Chứng minh khả năng gây ung thư từ benzidine
[13 P 238]

được xem là qui trình chuẩn và truyền thống trong xác định các chất màu nhuộm
trên vải. Qui trình này được các phòng thí nghiệm áp dụng với chấp nhận giới hạn
phát hiện trong dung dịch chiết là 5 mg/l và giới hạn thực tế trên sản phẩm là 75
mg/g (cân 0.5 g thể tích chiết 7.5 ml). Hơn nữ
a, một thực trạng được IIS - tổ chức
về thực nghiệm thành thạo liên phòng thí nghiệm nhận định qui trình này cho hiệu
suất thu hồi và độ tái lặp thấp. Độ tinh khiết chuẩn của các nhà sản xuất khác nhau
gây ảnh hưởng lớn đến kết quả đáng giá chung
[9], [17]
.
Qua việc tìm hiểu một số bài báo về xác định các hợp chất màu bị cấm trên
vải, chúng tôi rút ra một số nhận định chung như sau:
- Các tài liệu đa phần đều tập trung vào phân tích các chất màu phân tán
trong khi đó nhu cầu về phân tích các chất màu gây ung thư trong thực tiễn vẫn rất
được quan tâm.
- Các chất màu nhuộm có độ tinh khiết thấp, điều này gây khó khăn cho việc
xác định đồng thời các chất màu bằng đầu dò DAD vì sẽ dễ bị nhiễu bước sóng.

15
- Các chất màu được tập trung xác định nhiều là những chất màu phân tán
gây dị ứng. Phương pháp xác định chủ yếu được nghiên cứu gần đây là phương
pháp LC/MS/MS.
- Những phương pháp đã và đang được nghiên cứu sử dụng để xác định các
chất màu nhuộm thuộc nhóm màu gây ung thư và dị ứng chủ yếu vẫn dựa trên tiêu
chuẩn DIN 54231-2005.
- Chưa có bài báo nào tập trung xác định 16 chất màu gây ung thư bằng
phương pháp LC/MS.
1.5.2. Tiêu chu
ẩn DIN 54231-2005
[7]

Hình1.4. Chương trình gradient pha động theo tiêu chuẩn DIN 54231
-
Đầu dò DAD: scan từ 210 nm đến 800 nm.
- Đầu dò MS: scan từ 100 u đến 800 u.
- MS-ESI, thế dương CID 80 V.

17

Hình1.5. Sắc ký đồ tách các chất trên thiết bị LC/MS-ESI (chuẩn 10 mg/l).
b. Qui trình xử lý mẫu:
Tiêu chuẩn này cũng đưa ra qui trình xử lý mẫu như sau: mẫu được cân 0.5 g và
chiết siêu âm trong 7.5 ml MeOH ở (70±2)
0
C trong 30 phút. Sau đó mẫu được lọc
qua màng lọc PTFE (0.45 µm) và phân tích kỹ thuật bằng HPLC/DAD/MS.
1.5.3. Phương pháp LC/DAD
[12]
:
- Nhóm tác giả C. Wang đề cập đến cách xác định 16 chất màu gây ung thư
và gây dị ứng theo phương pháp sắc ký lỏng ghép đầu dò DAD.
Cột sắc ký: C18 (250 mm*4.6 mm)
Tốc độ dòng: 0.8 ml/phút.
Pha động:
A: 15 mM citrate-20 mM tetrabutylammonium hydroxide, pH = 9
B: Tetrahydrofuran
C: Acetonitril
Theo chương trình gradient đã tối ưu, tác giả đã tách được hầu hết các chất
màu. Tuy nhiên vẫn còn một số chất chưa tách tốt như: Disperse Orange 3 chập với
Disperse Yellow 3, Disperse Blue 124 chập với Solvent Yellow 3, Solvent Yellow 2
chập với Disperse Orange 37. Vì các chất phân tích có nhóm màu nhuộm acid và