BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHẠM THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM
LỚN
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC


2

NGHỆ AN - 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH

PHẠM THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
CÁC AXIT AMIN TRONG MỘT SỐ LOÀI NẤM
LỚN
Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn
bè đã động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Vinh, tháng 10 năm 2014
Học viên


Phạm Thị Nguyệt


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC BẢNG.......................................................................................10
DANH MỤC HÌNH........................................................................................11
MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
Bảng 1.1: Cấu trúc của 20 axit amin tiêu chuẩn..............................................13
Ngoài ra axit amin còn có một số tính chất riêng như sau:.....................16
Bảng 1.2: Trị số ước lượng về lượng đòi hỏi các axit amin cần thiết
(mg/kg cân nặng/ngày)....................................................................................21
Bảng 1.3: Đối chiếu các loại axit amin thiết yếu.............................................21
Bảng 1.4: Thành phần axit amin thiết yếu trong một số loài nấm hoang
(g/100g protein thô)[10, 35]............................................................................22
Bảng 1.5: Hàm lượng axit amin tự do trong loài nấm Calvatia gigantea
ở phía Nam Thỗ Nhĩ Kỳ (mg/100 g ± SD) [32].............................................23
Bảng 1.6: Thành phần axit amin thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn Quốc
(g/100g) (định lượng bằng phương pháp HPLC) [33]...................................24
Bảng 1.7: Thành phần axit amin không thiết yếu trong hai loài nấm ở Hàn
Quốc................................................................................................................24
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất thu hồi........................40
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi các axit
amin.................................................................................................................44

Analytical Chemists
Aminoquinolil- Nhydroxysuccinimidyl
carbamate
dry matter

EAA

Axit amin thiết yếu

Essential amino acid

FMOC

9-florenylmetyl cloroformat

9-florenylmethyl cloroformate

GC

Sắc ký khí
Sắc ký khí detector ion hóa
ngọn lửa

Gas chromatography
Gas chromatography/ flame
ionization detector
Gas chromatography/ mass
spectrometry
High performance liquid
chromatography


Sắc ký lỏng hiệu năng cao
pha ngược

TAA

Tổng axit amin

Nonessential amino acid
ortho-phthalaldehyd/ orthophthaldialdehyde
Phenylisothiocyanate
Reversed phase - High
performance liquid
chromatography
Total amino acid

TEA

Trietylamin

Triethylamine

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

OPA
PITC


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Hệ thống máy sắc ký HPLC Agilent 1100 series............................30
Hình 2.1: Mẫu nấm 03 Hình 2.2: Mẫu nấm 04
Hình 2.3: Mẫu nấm 05
.........................................................................................................................35
Hình 2.4: Mẫu nấm lỗ Hình 2.5: Mẫu nấm 01

Hình 2.6: Mẫu nấm 02.....35

Hình 2.7: Mẫu nấm 608 Hình 2.8: Mẫu nấm 619 Hình 2.9: Mẫu nấm 621
.........................................................................................................................36
Hình 2.10: Mẫu nấm HKG 401

Hình 2.11: Mẫu nấm HKG 406 ..........36

Hình 2.12: Quy trình phân tích axit amin thủy phân.......................................37
Hình 2.13: Quy trình phân tích axit amin tự do..............................................38
Hình 3.1: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl.....41
Hình 3.2: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01
tại nồng độ HCl 5M.........................................................................................42
Hình 3.3: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01
tại nồng độ HCl 5,5M......................................................................................42
Hình 3.4: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01
tại nồng độ HCl 6M.........................................................................................43
Hình 3.5: Sắc đồ tách các axit amin trong dịch thủy phân của mẫu nấm 01
tại nồng độ HCl 6,5M......................................................................................43
Hình 3.6: Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi các axit amin
vào thời gian thủy phân...................................................................................45
Hình 3.7: Sắc đồ tách các axit amin của mẫu nấm 01

Hình 3.45: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 619..............................74
Hình 3.46: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm 621..............................74
Hình 3.47: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 401....................75
Hình 3.48: Sắc đồ tách các axit amin trong mẫu nấm HKG 406....................75



1
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng sinh học cao trên thế
giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xương
sống đã được mô tả, trong đó có những loài đặc hữu. Cấu trúc địa chất độc
đáo, địa lý thủy văn đa dạng, khí hậu nhiệt đới gió mùa đã góp phần tạo nên sự
đa dạng của hệ nấm Việt Nam, đây là nguồn có giá trị tài nguyên rất to lớn.
Nấm có ý nghĩa rất quan trọng trong đời sống con người, chúng là
nguồn thực phẩm giàu chất dinh dưỡng (Termitomyces albuminosus,
Macrocybe gegantea), là nguồn thức ăn quý được nhân dân ưa chuộng, chứa
nhiều protein, các chất khoáng và vitamin (A, B, C, D, E...). Nhiều loài nấm
được ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm, là nguồn nguyên liệu để điều
chế các hoạt chất điều trị bệnh như: Laricifomes officinalis là nguyên liệu để
chiết aragicin dùng trong chữa bệnh lao hoặc dùng làm thuốc nhuận tràng hay
chất thay thế cho quinin. Các chế phẩm từ nấm linh chi (Ganoderma) được
dùng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh như bệnh gan, tiết niệu, tim mạch, ung thư,
AIDS. Trong quả thể của Ganoderma lucidum có các hoạt chất khác có hoạt
tính kháng virus. Chúng có tác dụng kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của
virus HIV. Các hoạt chất từ Ganoderma applanatum có hiệu lực chống khối u
cao, chúng được sử dụng trong điều trị ung thư: ung thư phổi, ung thư vú, ung
thư dạ dày. Các dẫn xuất adenosine có trong Ganoderma capense và G.
amboinense có tác dụng giảm đau, giãn cơ, ức chế kết dính tiền tiểu cầu.

thuộc vùng Bắc Trung Bộ.


3
Chương 1

TỔNG QUAN
1.1. Nấm
1.1.1. Định nghĩa về nấm lớn
Nấm theo nghĩa rộng (thuật ngữ khoa học) mà tiếng Anh là Fungi, là
nhóm sinh vật nằm trong giới Myceteae (Miles and Chang, 1997). Giới nấm
bao gồm nấm lớn và tất cả các nấm khác (như nấm men, nấm mốc, ...là các
vi nấm), được tách riêng do có các đặc điểm không giống cả động vật lẫn
thực vật.
Nấm theo nghĩa hẹp là nấm lớn với quả thể phân biệt rõ mà nó có thể
mọc trên mặt đất hoặc dưới đất và đủ lớn để thấy được bằng mắt thường và
được thu hái bằng tay.
1.1.2. Phân loại nấm
Nấm là một giới riêng biệt khoảng 1,5 triệu loài, trong đó đã mô tả
được 69000 loài bao gồm nấm men, nấm mốc và các loài nấm lớn. Nấm là
các sinh vật có nhân thực (được xếp vào nhóm eukaryote) có vách tế bào bao
bọc bên ngoài thường chứa chitin polysaccharit, chất béo và protein. Nấm
không có chất diệp lục và do đó không thể thực hiện quá trình quang hợp. Do
đó, nấm phải hấp thu chất dinh dưỡng từ các nguồn khác nhau. Nấm sinh sản
hữu tính hoặc vô tính và có bộ máy sinh dưỡng thường là dạng sợi có cấu trúc
phân nhánh gọi là sợi nấm.
1.1.3. Đặc điểm dinh dưỡng của nấm
1.1.3.1. Chất khô, giá trị năng lượng
Hàm lượng chất khô trong nấm tươi là rất thấp, thường trong khoảng
60-140g/kg và chủ yếu bao gồm carbohydrate, protein, chất xơ và khoáng

loài thực phẩm khác bao gồm sữa, thứ được sản xuất từ động vật [31].


5
Năm 2011, Bauer-pettrovska [14] đã xác định được hàm lượng protein
thô trung bình là 32,6% dm (dry matter: chất khô) của 47 loài nấm hoang ở
Hy lạp. Hàm lượng cao nhất là 48,8% dm và 51,2% dm có trong loài
Calocybe gambosa và Macrolepiota mastoidea và thấp nhất chỉ 16,2% dm là
trong loài C. Cibarius.
Hàm lượng protein trong chất khô, hầu như không thay đổi trong suốt
quá trình sấy khô nấm ở 40°C hoặc làm lạnh đến -20°C; còn khi đun sôi nấm
tươi gây ra sự giảm đáng kể.
Theo FAO/WHO, nấm được coi là giàu axit glutamic, axit aspartic và
arginine, tuy nhiên, các protein của chúng là thiếu methionine và cysteine. Các
axit amin hạn chế là leucine và lysine có trong L. edodes và P. ostreatus (nấm
sò tím) và P. eryngii (nấm sò vua). Điều thú vị là hai loại axit amin không phổ
biến: axit γ -amino butyric và ornithine đã được phát hiện, hai chất này thể
hiện các chức năng sinh lí quan trọng [41].
Hàm lượng của axit amin tự do trong nấm là thấp, chỉ khoảng 1% dm.
Vì thế, sự đóng góp thành phần dinh dưỡng của chúng là bị hạn chế. Tuy
nhiên, chúng tham gia vào hương vị của nấm. Axit glutamic và alanin được
báo cáo là axit amin tự do phổ biến trong T. portentosum and T. terreum [23].
1.1.3.3. Lipid (chất béo)
Nấm ăn cung cấp một lượng chất béo thấp. Các axit béo không bão hòa
chiếm ưu thế hơn các axit béo bão hòa đặc biệt là axit panmitic, axit oleic và
axit linoleic, trong khi đó các axit béo còn lại chỉ được tìm thấy với lượng nhỏ,
ngoại trừ trường hợp loài Lactarius deliciosus nó có chứa một lượng lớn của
axit stearic. Axit linolenic là tiền thân cho 1-octen-3-ol (còn gọi là nấm rượu),
là hợp chất thơm chủ yếu có trong hầu hết các loại nấm, nó là thành phần đặc
trưng và đặc sắc góp phần vào hương vị nấm [25].

(vitamin B2), niacin (vitamin B3), tocopherol and vitamin D. Một số tác giả đã
xem nấm như một nguồn cung cấp vitamin dựa trên hàm lượng cao của


7
riboflavin (vitamin B2), niacin và của vitamin C, vitamin B 1, vitamin D, βcaroten (tiền vitamin A), vitamin E và vitamin B 12. Nấm giống như là nguồn
thức ăn không động vật chứa vitamin D, và vì thế chúng là nguồn vitamin D
tự nhiên cho người ăn chay. Hàm lượng vitamin D 2 là đáng kể trong một số
loài nấm hoang dã, nhưng nó gần như vắng mặt trong các loài nấm trồng [44].
Quá trình nấu và chế biến công nghiệp đã được phát hiện là có ảnh
hưởng đến hàm lượng vitamin trong sản phẩm. Vitamin B1 và B2 bị mất trong
quá trình chế biến công nghiệp của loài Boletus ở mức 21-57% và 8-74%.
1.1.3.6. Thành phần khoáng chất
Nấm là một nguồn tốt của các nguyên tố khoáng. Nguyên tố khoáng có
hàm lượng cao nhất là kali, tiếp theo là photpho, natri, canxi và magie. Chúng
được coi là thành phần nguyên tố khoáng chính; đồng, kẽm, sắt, mangan,
cadimi là những nguyên tố khoáng phụ.
Tính toán nồng độ thành phần của K, P, Na, Ca và Mg chiếm khoảng
56-70% tổng hàm lượng tro [35]. K là phong phú và chiếm khoảng gần 45%
tổng hàm lượng tro. Hàm lượng tro trong nấm thường chiếm từ 5-12% trọng
lượng khô. Nhìn chung, hàm lượng tro của nấm có phần cao hơn hoặc tương
đương với hầu hết các loại rau. Nấm chứa hàm lượng cao của photpho, kali và
tương đối cao của magiê. Tuy nhiên, một số nguyên tố còn lại sẵn có trong
nấm vẫn chưa được biết hàm lượng.
Điểm lưu ý đặc biệt là sự tích tụ trong nấm vết kim loại nặng, đặc biệt là
các nguyên tố độc hại như cadimi, chì và thủy ngân, thường có mặt trong các
chất nền nuôi cấy. Thật vậy, loài L. edodes được chứng minh là tích trữ một
lượng cadimi hiệu quả, trong khi loài A. bisporus, P. ostreatus, L. edodes và
một số loài thuộc chi Boletus tự nhiên giàu selen [26].
1.1.3.7. Thành phần hương vị

Ergothionin là một hợp chất thiol hòa tan trong nước, là một chất chống
oxy hóa tuyệt vời trong cơ thể. Hàm lượng ergothionin từ 48 đến 2851 mg/kg


9
dm có trong 29 loài nấm [18]. Vì vậy, nấm ăn tự nhiên có hàm lượng
ergothionin có thể cải thiện khả năng chống oxy hóa trong các bữa ăn.
1.1.4. Vai trò của nấm trong tự nhiên và trong đời sống con người
Nấm là nguồn dược phẩm
Y học cũng đã sử dụng nấm từ thời xa xưa. Nấm dược liệu đã có một
thời gian dài được dùng trong phương pháp điều trị cổ truyền. Gilmore (1919)
cũng đã công bố rằng loài nấm Calvatia gigantean được thu hoạch để sử dụng
như chất cầm máu cho bất kì vết thương nào, đặc biệt là dùng cầm máu cho
rốn trẻ sơ sinh. Sự quan tâm của các nhà khoa học trên loài nấm là đang được
phát triển vì chúng là nguồn chính của dược phẩm mới tiềm năng và bổ sung
vào chế độ ăn uống [52].
Nhiều chất kháng sinh quan trọng được chiết rút từ nấm. Chẳng hạn
như penicilin được phát hiện và sau đó được phát triển như chất điều trị y tế
chống nhiễm khuẩn. Penicillin có lẽ là nổi tiếng nhất của tất cả các loại thuốc
kháng sinh, có nguồn gốc từ một loại nấm thông thường gọi
là Penicillium. Nhiều loại nấm khác cũng sản xuất các chất kháng sinh, mà
hiện nay được sử dụng rộng rãi để kiểm soát bệnh trong người và động
vật. Việc phát hiện ra kháng sinh là một cuộc cách mạng chăm sóc sức khỏe
trên toàn thế giới.
Nhiều đặc tính có lợi của nấm dùng phòng ngừa và điều trị một số bệnh
đã được mô tả bao gồm: chống oxi hóa, kháng u, điều hoà miễn dịch, kháng
virut, kháng khuẩn, ký sinh trùng và hiệu quả trong trị đái tháo đường; nấm
còn có tác dụng ngăn ngừa các bệnh như cao huyết áp, tăng cholesterol máu,
xơ vữa động mạch và ung thư do các thành phần hóa học cụ thể của nấm và
các hợp chất có hoạt tính sinh học khác nhau. Sản phẩm chữa bệnh quan trọng

do hương vị độc đáo và tinh tế của chúng.
Từ rất lâu nấm được coi là một loại thực phẩm đặc biệt. Người Hy lạp
đã tin tưởng rằng nấm cung cấp sức mạnh cho các chiến binh trong các trận
chiến. Các vị vua tự hào nấm như một món ăn, các vị La mã coi nấm như “


11
thực phẩm của các vị thần” và chúng chỉ phục vụ vào các dịp lễ hội. Người
Trung quốc coi nấm như là nguồn thực phẩm sức khỏe, “ thuốc trường sinh
của cuộc sống”. Người Ấn độ Mexico sử dụng nấm như là chất gây ảo giác
trong nghi lễ tôn giáo và ma thuật tốt như là trong mục đích chữa bệnh [55].
Thường được nhóm với các loại rau, nấm cung cấp nhiều thuộc tính
dinh dưỡng, cũng như các thuộc tính thường được tìm thấy trong thịt, đậu
hoặc các loại ngũ cốc. Nấm là ít calo, không có chất béo, cholesterol và natri
rất thấp, nhưng chúng cung cấp một số chất dinh dưỡng mà thường được tìm
thấy trong các loại thực phẩm động vật hoặc các loại ngũ cốc [57]. Giống như
tất cả các loại trái cây và rau quả, nấm tự nhiên không có gluten, nên bổ
dưỡng với một chế độ ăn không có gluten. Nấm có đủ các chất hữu cơ cần cho
nhu cầu dinh dưỡng của người như protein, gluxit, lipit, vitamin, muối khoáng
và nhiều loại enzim rất lợi cho tiêu hoá và có giá trị dinh dưỡng cao.
Nấm ăn Việt Nam có hơn 200 loài trong đó khoảng 50 loài là nấm ăn
quý. Tuyệt đại đa số nấm ăn Việt Nam thuộc các đại diện của nấm Đảm
Basidiomycota và một số ít thuộc nấm túi Ascomycota. Có thể kể một số ví dụ
như: mộc nhĩ, nấm hương, nấm rơm, ngân nhĩ, nấm thông, nấm chàm, nấm
bào ngư, nấm kim châm, nấm ngọc châm…(Trịnh Tam Kiệt, 2011).
Ngoài ra, các loài nấm có khả năng ứng dụng trong công nghệ sinh học và
bảo vệ môi trường
Những loài nấm có khả năng sinh enzim và một số hoạt chất quý có thể
được ứng dụng trong công nghệ sinh học và bảo vệ môi trường.
Nấm là bộ phận quan trọng trong công nghệ lên men. Các loài nấm men


R

N

Cα

H

H

H

O
C

H
O

Dạng phân tử

H

+

_
O

R