BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------

ĐÀO THỊ HUỀ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI
HÕA TAN CHITOSAN VÀ CHẤT GIA VỊ DÙNG TRONG
SẢN XUẤT CHẢ CÁ ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG
OXY HÓA CỦA CHITOSAN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ Chế Biến Thủy Sản

NHA TRANG, THÁNG 6 NĂM 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
--------

ĐÀO THỊ HUỀ

NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ DUNG MÔI
HÕA TAN CHITOSAN VÀ CHẤT GIA VỊ DÙNG TRONG
SẢN XUẤT CHẢ CÁ ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG
OXY HÓA CỦA CHITOSAN

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Sinh viên thực hiện.
Đào Thị Huề

năm 2017


MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. ix
LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN ...........................................................................................4
1.1. Cấu tạo, tính chất và ứng dụng của chitosan ........................................................4
1.1.1. Cấu tạo ..............................................................................................................4
1.1.2. Tính chất của chitosan .......................................................................................4
1.1.2.1.Tính chất vật lý................................................................................................5
1.1.2.2. Tính chất hóa học ...........................................................................................6
1.1.2.3. Hoạt tính sinh học ..........................................................................................8
1.1.3. Ứng dụng của chitosan ......................................................................................9
1.2. Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và một số dung môi hòa tan chitosan ...14
1.2.1. Hoạt tính chống oxy hóa của chitosan ............................................................14
1.2.1.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của chitosan ...............................................15
1.2.1.2. Tổng năng lực khử của chitosan ..................................................................16
1.2.1.3. Hoạt tính chống oxy hóa lipid bằng mô hình phản ứng Feton trong hệ
Lipid/FeCl2/H2O2 của chitosan ..................................................................................16
1.2.1.4. Khả năng khử H2O2 .....................................................................................17
1.2.2. Hoạt tính chống oxy hóa của một số dung môi hòa tan ..................................17
1.2.2.1. Khả năng hòa tan chitosan của một số loại dung môi..................................17
1.2.2.2. Khả năng chống oxy hóa của một số loại dung môi hòa tan chitosan ........18

1.5.1.5. Phƣơng pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity): Xác định
hoạt tính chống oxi hóa so với khả năng chống oxi hóa của Trolox ........................43
1.5.1.6. Phƣơng pháp ORAC (Oxygen radical absorbance capacity): Xác định khả
năng hấp thụ gốc chứa oxi hoạt động........................................................................43
1.5.1.7. Phƣơng pháp TRAP (Total radical-trapping antioxidant potential): Xác
định khả năng bẩy các gốc tự do ...............................................................................44
1.5.1.8. Phƣơng pháp FRAP (Ferric reducing-antioxidant power): Lực chống oxy
hóa bằng phƣơng pháp khử sắt..................................................................................44
1.5.2. Phƣơng pháp điện hóa .....................................................................................45
1.5.2.1. Cyclic voltammetry (đo điện thế) ................................................................45
1.5.2.2. Phƣơng pháp amperometric .........................................................................46
1.5.2.3. Phƣơng pháp biamperometric......................................................................46
1.5.3. Phƣơng pháp sắc kí .........................................................................................47
1.5.3.1. Phƣơng pháp sắc kí khí (Gas chromatography) ..........................................47


1.5.3.2. HPLC (high performance liquid chromatography): phƣơng pháp sắc kí lỏng
hiệu năng cao.............................................................................................................47
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................48
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.........................................................................................48
2.1.2. Hóa chất nghiên cứu........................................................................................48
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ..........................................................................................49
2.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................49
2.2.1. Cơ sở nguyên cứu............................................................................................49
2.2.2. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................50
2.2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu chung ..............................................................................50
2.2.2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của dung môi hòa tan chitosan đến hoạt tính
chống oxy hóa của chitosan ......................................................................................52
2.2.2.3. Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của các chất gia vị đến hoạt tính chống oxy
hóa chitosan ...............................................................................................................53

hóa bắt gốc tự do DPPH theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ........................84
3.2.1.2. Đánh giá quá trình sàng lọc các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính chống oxy
hóa dựa vào tổng năng lực khử theo thiết kế thí nghiệm Plackett-Burman ..............87
3.2.1.3. Đánh giá quá trình sàng lọc các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính chống oxy
hóa lipid bằng mô hình Fenton trong hệ Lipid/FeCl2/H202 theo thiết kế thí nghiệm
Plackett-Burman ........................................................................................................90
3.2.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của chitosan và chitosan kết hợp với các
chất gia vị, phụ gia ....................................................................................................92
Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KIẾN NGHỊ ..............................................95
4.1. Kết luận ..............................................................................................................95
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................96
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu viết tắt

Viết đầy đủ

TCVN

: Tiêu chuẩn Việt Nam

BHA

: Butylated hydroxyanisole

BHT

: Butylated hydroxytoluen


: Thiobarbituric acid reactive substances

TPP

: Tripolyphosphate-pentasodium

WHO

: World Health Organization


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm .............................................10
Bảng 1.2. Một số ứng dụng chitosan trong xử lí môi trƣờng ....................................12
Bảng 1.3. Mức độ hòa tan chitosan trong các dung môi ...........................................18
Bảng 1.4. Tính chất của sorbitol. ..............................................................................32
Bảng 2.1. Tên thiết bị và dụng cụ .............................................................................49
Bảng 2.2. Các biến trong ma trận thí nghiệm sàng lọc theo thiết kế Plackett-Burman .......... 53
Bảng 2.3. Ma trận bố trí thí nghiệm sàng lọc các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính
chống oxy hóa của chitosan theo thiết kế Plackett-Burman .....................54
Bảng 2.4. Ma trận bố trí các thí nghiệm đầy đủ theo thiết kế Plackett-Burman .......54
Bảng 3.1. Mô tả sự khác biệt của chitosan trong các mẫu dung môi hòa tan acid
acetic, acid lactic, acid citric và giữa các nồng độ của Chitosan trong
cùng 1 dung môi thông qua chỉ tiêu khử gốc tự do DPPH .......................79
Bảng 3.2. Mô tả sự khác biệt của chitosan trong các mẫu dung môi hòa tan acid
acetic, acid lactic, acid citric và giữa các nồng độ của chitosan trong cùng
1 dung môi thông qua chỉ tiêu khử sắt .....................................................80
Bảng 3.3. Đánh giá ảnh hƣởng của các chất gia vị từ ma trận đầy đủ theo thiết kế thí
nghiệm Plackett-Burman ảnh hƣởng đến hoạt tính chống oxy hóa bắt gốc

Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng chống oxy hóa của chitosan và
chitosan kết hợp với các chất gia vị, phụ gia dùng trong công nghệ sản
xuất chả cá ................................................................................................57
Hình 2.5. Sơ đồ chuẩn bị dung dịch acid acetic, acid lactic, acid citric, acid ascorbic ..... 58
Hình 2.6. Sơ đồ chuẩn bị dung dịch chitosan ...........................................................59
Hình 2.7. Đƣờng chuẩn DPPH ..................................................................................62
Hình 2.8. Đƣờng chuẩn BHT ....................................................................................65
Hình 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa của 4 mẫu dung môi đến khả năng khử gốc tự do
DPPH. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm

SD.

Các kí tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P

Các kí tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P
chất gia vị dùng trong công nghệ sản xuất chả cá.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của 4 loại dung môi hòa tan chitosan:
acid acetic, acid lactic, acid citric, acid ascorbic ở cùng nồng độ.
- Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa chitosan trong các mẫu dung môi.


3
- Sàng lọc các yếu tố ảnh hƣởng (muối, đƣờng, bột ngọt, tiêu, hành, tỏi) đến
hoạt tính chống oxy hóa của chitosan.
4. Ý nghĩa đề tài
Ý nghĩa khoa học
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của dung môi hòa tan đến hoạt tính chống oxy
hóa của chitosan.
- Xác định đƣợc ảnh hƣởng của các loại gia vị dùng trong công nghệ sản
xuất chả cá đến hoạt tính chống oxy hóa của chitosan.
- Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ
thuật trong ngành công nghệ thực phẩm.
Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà chế biến tiết kiệm đƣợc
thời gian, chi phí làm thí nghiệm.
- Nhằm hạn chế có hiệu quả sự oxy hóa trong quá trình bảo quản các sản
phẩm từ chả cá.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành bài báo cáo nhƣng bƣớc đầu làm
quen với nghiên cứu khoa học trong thời gian nghiên cứu có hạn và điều kiện
nghiên cứu còn nhiều hạn chế nên bài báo cáo không tránh khỏi thiếu sót. Rất mong
nhận đƣợc nhiều góp ý từ quý thầy cô để bài báo cáo đƣợc hoàn thiện hơn.
Trân trọng cám ơn!


4

của chitosan bởi vì nó liên quan trực tiếp đến các tính chất cation của chitosan [7].
Độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu đƣợc phụ thuộc nhiều vào các yếu tố
nhƣ: nồng độ và tỉ lệ NaOH sử dụng, nhiệt độ và thời gian xử lý của quá trình
deacetylchitin, tạo nên những phân tử chitosan có tính chất hóa lý khác nhau. Nồng
độ NaOH và nhiệt độ xử lý càng cao thì số lƣợng nhóm acetyl loại bỏ càng nhiều,
chitosan có độ deactyl càng cao và khối lƣợng phân tử (MW) càng thấp. Để đạt
đƣợc độ deacetyl (DD) cao trên 90% thì cần thực hiện quá trình deacetyl nhiều lần
[15], [54].
Độ deacetyl (DD) của chitosan đƣợc xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau
nhƣ: Phân tích nguyên tố, chuẩn độ thế năng, quang phổ hồng ngoại, phân tích
nguyên tố IR, phƣơng pháp sắc kí lỏng và rắn… [28]. Tuy nhiên, các phƣơng pháp
phổ biến hiện nay sử dụng là sử dụng UV, NMR và IR [3].
Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên ngƣời ta qui ƣớc nếu độ
deacetyl DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50% thì gọi là chitin [3], [19].
- Khối lƣợng phân tử (Molecular Weight MW)
Khối lƣợng phân tử chitosan khác nhau tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu và
phƣơng pháp sản xuất. Phân tử lƣợng chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, nó
quyết định tính chất chitosan nhƣ khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp
phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật và chống oxy hóa [15], [27].
Hầu hết chitosan thƣơng mại có giá trị DD > 70% và trọng lƣợng phân tử từ
100.000 đến 1.200.000 Da. Chitosan có phân tử lƣợng thấp thì thƣờng có hoạt tính


6
sinh học cao hơn, thƣờng có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, công nghệ thực
phẩm, y học và công nghệ sinh học [15], [28].
Khối lƣợng phân tử chitosan thƣơng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo độ
nhớt, phƣơng pháp sắc kí gel thấm qua, phƣơng pháp tán xạ ánh sáng (Gel
Permeation Chromatography- GPC) [3], [15], [27].
- Độ nhớt

Phức chất (a) đƣợc tạo thành trong điều kiện pH = 5-5.8, phức chất (b) đƣợc
tạo thành ở pH

5.8. Cơ chế tạo phức phụ thuộc vào độ pH và nồng độ của dung

dịch đồng loãng và trạng thái cuả chitosan (bột, gel, màng…). Phản ứng tạo phức
tốt hơn khi chitosan thu hồi từ quá trình deacettyl chitin có độ deacyl (DD) cao.
Điều này chứng tỏ sự tạo phức còn phụ thuộc số lƣợng nhóm NH2 cũng nhƣ là sự
sắp xếp các nhóm NH2 trên mạch chitosan.
Mặt khác, chitosan có khả năng tạo phức với sắt. Phức hợp của chitosan với
Fe3+ đƣợc tạo thành bằng cách cho chitosan (dạng bột) phản ứng với sắt clorua
1.5M, kết tủa thu đƣợc rửa sạch, sấy khô và khảo sát. Sản phẩm cuối cùng là một
phức hợp phức tạp [Chitosan-Fe3+] với 1 ion Fe3+ kết với 2 phân tử chitosan, 3 phân
tử

H2 O

kết

hợp

với

1

ion

Cl.

Công

Chitosan đƣợc hòa tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ acid acetic, acid lactic
và đƣợc sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm.
Có rất nhiều nghiên cứu thảo luận về hoạt động kháng khuẩn của chitosan
trong những điều kiện khác nhau. Nghiên cứu Lian-Ying Zheng [36] về hoạt tính
kháng khuẩn của các loại chitosan có khối lƣợng phân tử (MW) khác nhau trên E.
coli và Staphylococus aureus cho thấy: khả năng kháng khuẩn của chitosan trên
Staphylococus aureus tăng khi khối lƣợng phân tử (MW) của chitosan tăng và khả
năng kháng khuẩn của chitosan trên E. coli giảm khi khối lƣợng phân tử (MW) của
chitosan tăng [36].
- Tính phân hủy sinh học
Hầu hết polymer ngày nay là nguyên liệu tổng hợp, nên khả năng tự phân hủy
sinh học của chúng bị hạn chế hơn nhiều so với các polymer tự nhiên nhƣ:
cenlulose, chitin, chitosan bà những dẫn xuất của chúng [38]. Chitosan dễ bị phân
hủy bởi vi sinh vật trong đất và vi sinh vật trong nƣớc, nên chitosan đƣợc xem là
polymer thân thiện với môi trƣờng [54].
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã cho kết quả rằng chitin và chitosan là các
polymer có tính phân hủy sinh học [28]. Theo nghiên cứu của Davies và cộng sự,


9
chitosan dễ bị phân hủy bởi lysozyme ở pH = 5.2, và pHopt = 5.2-8.0. Pangburn và
cộng sự

nghiên cứu về ảnh hƣởng của lysozyme tới tính nhạy cảm của

chitin/chitosan và kết quả cho thấy rằng chitin tinh khiết (0% deacetylation) dễ bị
phận hủy bởi lysozyme nhất, trong khi chitosan tinh khiết (100% deacetylation)
không bị phân hủy bởi lysozyme.
Phƣơng pháp sản xuất chitosan cũng ảnh hƣởng đến tính thủy phân sinh học
của chitosan và kết quả là chitosan đƣợc sản xuất theo phƣơng pháp đồng nhất dễ bị

kiwi, dƣa chuột, ớt chuông, dâu tây, cà chua, quả vải, xoài, nho...). Ở Việt Nam,
chitosan cũng đã đƣợc sử dụng trong bảo quản xúc xích. sản xuất chả giò [13].
Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm đƣợc trình bày ở bảng 1.1 [15].
Bảng 1.1. Một số ứng dụng chitosan trong thực phẩm
Ứng dụng
Tạo màng chống biến nâu, chống
mất nƣớc, hạn chế hao hụt trọng
lƣợng, kháng nấm, bảo quản trái cây,
rau.

Đối tƣợng
Dâu, vải, nhãn, na,
thanh long, xoài, cà

Thịt bò tẩm gia vị,

oxy hóa trong quá trình bảo quản và

xúc xích heo, cá,

chế biến thịt cá, đậu phụ, bánh mì.

mực…

cồng nghệ sản xuất nƣớc quả và
rƣợu

-

Chitosan

kiềm hãm hoạt tính của nấm. Những vật liệu này đƣợc sử dụng trong các loại kem,
sữa và một số dẫn xuất của chúng đƣợc sử dụng trong công nghệ sợn móng tay.
Ngoài ra, chitosan còn đƣợc nghiên cứu để làm keo dƣỡng da, dầu gội, sử dụng để


11
sản xuất kem chống khô da, do bản chất chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì của
da bởi nhóm NH4+ liên kết với nhóm tế bào sừng hóa của da [38].
- Ứng dụng chitosan trong nông nghiệp
Chitosan đƣợc sử dụng để tăng cƣờng sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi
trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong
đất và tăng cƣờng khả năng nẩy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích thích sinh
trƣởng và tăng năng suất thu hoạch. Đặc biệt, chitosan có đóng vai trò là chất kích
thích hệ miễn dịch của cây (plant defence booster) và sự hoạt động của enzyme
chitinase. Chitosan đƣợc nghiên cứu thử nghiệm phun lên rau cải (Brassica
campestrissp). Cho lƣợng cải thu hoạch tăng lên. Hạt giống ngâm bằng chitosan và
phun chitosan lên lá có thể tăng năng suất lên 1,6 lần. Đối với hạt giống lúa mì, khi
đƣợc xử lý trong dung dịch chitosan thì tỷ lệ nảy chồi hình thành cây con tăng lên
25%, rễ và lá phát triển mạnh hơn so với mẫu không xử lý chitosan [3].
Để mở rộng ứng dụng của chitin, chitosan cần phát triển nghiên cứu thử
nghiệm trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau, thử nghiệm nhiều loại chitosan, tìm
ra loại chitosan, lƣợng sử dụng cho từng loại cây và từng giai đoạn phát triển của
cây. Phát triển lợi thế đa chức năng, đa tác dụng khi sử dụng chitosan nhƣ bảo vệ
hạt giống, bảo vệ cây trồng, tăng năng suất.
- Ứng dụng chitosan trong nuôi trồng thủy sản
Chitosan đƣợc nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích thích sinh
trƣởng, tăng miễn dịch và cải thiện môi trƣờng ao nuôi. Thức ăn bổ sung chitosan
có khả năng làm tăng sự phát triển và tỷ lệ sống của cá so với thức ăn bình thƣờng.
Ngoài ra chitosan cũng đƣợc ứng dụng làm màng bao, làm chất kết dính để làm
tăng độ ổn định của thức ăn tôm.

Chitosan

Hạt

Chì

Chitosan, dẫn xuất chitosan

Hạt, bột

Catmi

Chitosan, dẫn xuất chitosan

Hạt, vi hạt

Niken

Chitosan

Hạt, vi hạt

Kẽm

Chitosan

Hạt, vi hạt

Đồng


Anthraquynone
Triphenylmethane

Chitin, chitosan và dẫn xuất

Hạt

Hỗn hợp chất màu từ
nhà máy dệt nhuộm

Chitin, chitosan

Hạt

Chitosan

Dung dịch


13
- Ứng dụng trong y học
Trong những năm gần đây, việc nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan trong
lĩnh vực y học đƣợc phát triển rất nhanh. Chitosan là polymer tự nhiên với cấu trúc
độc đáo, tính đa chiều và nhiều tính chất đặc trƣng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các
ứng dụng y sinh học. Chitosan có khả năng hòa hợp sinh học rất cao và thúc đẩy
việc gắn liền vết thƣơng. Nó có tác dụng bảo vệ, chống nhiễm trùng, chống mất
nƣớc, tăng khả năng tái tạo da [38].
Theo nghiên cứu của Jae Kweon Park về khả năng chống ung thƣ của chitosan
có khối lƣợng phân tử cao. Kết quả cho thấy rằng chitosan có khả năng chống ung
thƣ, trong đó khối lƣợng phân tử và độ deacetyl của chitosan là thông số quan trọng

protein, lipid và chất màu phụ thuộc vào phân tử lƣợng, độ deacetyl hóa, độ rắn và
độ tinh khiết của chitosan và thƣờng biến động lớn với các mẫu chitosan. Chitosan
có độ deacetyl cao thì thƣờng hấp phụ màu tốt.
- Các yếu tố chính ảnh hƣởng đến khả năng chống oxy hóa của chitosan
Nồng độ chitosan: Nồng độ chitosan càng cao số lƣợng nhóm amin trong phân
tử càng nhiều thì khả năng phản ứng của chitosan càng tốt và ngƣợc lại [36], [39].
Khối lượng phân tử (MW): Chitosan có khối lƣợng phân tử càng thấp thì khả
năng chống oxy hóa càng cao. Điều này đƣợc giải thích là chitosan có khối lƣợng
phân tử càng cao, kích thƣớc càng lớn thì cấu trúc cồng kềnh, khó dịch chuyển
chính vì vậy phản ứng các nhóm chức chậm hơn làm hạn chế khả năng chống oxy
hóa của nó. Đồng thời, khối lƣợng phân tử của chitosan càng cao thì khả năng tan
trong dung dịch càng khó, độ nhớt càng cao hạn chế sự phân bố của chitosan trong
dung dịch [15], [26].
Độ deacetyl (DD): Chitosan còn là một polymer mang điện tích dƣơng nên
đƣợc xem là một polycationic có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm
nhƣ protein, aminopolysaccharide, acid béo,… vì vậy chitosan có độ deacetyl hóa