BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
VÕ THỊ HẢO
NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)
Nha Trang – Năm: 2017
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
VÕ THỊ HẢO
NGHIÊN CỨU TINH CHẾ VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
HÓA HỌC CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN STYLISSA FLEXIBILIS
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(Ngành: Công nghệ Kỹ thuật Hóa Học)
GVHD: TS. LÊ ĐÌNH HÙNG
Nha Trang – Năm: 2017
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
Nha Trang, ngày…..tháng…..năm 2017
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Ký và ghi rõ họ tên)
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc
PHIẾU ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG ĐỀ TÀI
Họ và tên sinh viên: Võ Thị Hảo
MSSV: 55134649
Lớp: 55CNHH
Chuyên ngành: Công Nghệ Kỹ Thuật Hóa Học
Đề tài: “Nghiên cứu tinh chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt
biển Stylissa flexibilis”.
Số chương:
Số trang:
Tài liệu tham khảo:
Hiện vật:
NHẬN XÉT CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
......................................................................................................................................
Kết luận.........................................................................................................................
quá trình nghiên cứu đồ án tốt nghiệp mà còn là hành trang quý báu để tôi có kinh
nghiệm tốt hơn cho con đường sắp tới vững chắc và tự tin hơn.
Cảm ơn các anh chị tại Phòng Công Nghệ Sinh Học Biển - Viện nghiên cứu và
Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện
luận văn.
Và cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt
tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này.
Trong quá trình nghiên cứu, cũng như trong quá trình làm bài luận văn tốt nghiệp,
do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không
thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô.
Luận văn tốt nghiệp được thực hiện từ đề tài “Nghiên cứu và định hướng sử dụng
hemagglutinin từ sinh vật biển” do Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tài
trợ với mã số: VAST06.04/16-17.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Nha Trang, ngày
tháng năm 2017
Sinh viên
Võ Thị Hảo
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy cô
hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được công bố.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.
Nha Trang, ngày
1.3.4. Một số tính chất lý hóa và sinh học của lectin từ bọt biển.............................10
1.3.5. ỨNG DỤNG CỦA LECTIN TỪ BỌT BIỂN................................................11
1.4. PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN LECTIN .............................................................12
1.4.1. Các kỹ thuật chiết xuất lectin .........................................................................12
1.4.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin ............................................................................12
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................14
2.1. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU .............................14
2.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ...................................14
2.2.1. Vật liệu ...........................................................................................................14
2.2.2. Hóa chất ..........................................................................................................14
2.2.3. Thiết bị nghiên cứu .........................................................................................15
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU. .......................................................................16
2.3.1. Quy trình sàng lọc lectin từ động vật bọt biển. ..............................................16
2.3.2 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC). ...16
2.3.3. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951). ..................17
2.4. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP ĐỂ CHIẾT
LECTIN TỪ BỌT BIỂN S. FLEXIBILIS ....................................................................19
2.4.1. Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ bọt biển. ................................................19
2.4.2. Xác định điều kiện chiết thích hợp để thu nhận lectin từ bọt biển S. flexibilis. .
........................................................................................................................20
2.4.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ CaCl2 (mM) ảnh hưởng đến hoạt độ
NKHC (TN1). ........................................................................................................20
2.4.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu: dung môi chiết (w/v) (TN2).
..............................................................................................................................21
2.4.2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ) (TN3) ..................22
2.4.4. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose. ............23
2.4.5. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200.......................24
2.4.6. Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp
PHỤ LỤC ....................................................................................................................45
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DC
: dịch chiết
HA
: hoạt độ ngưng kết hồng cầu
HC
: hồng cầu
HĐR
: hoạt độ riêng
HĐTS
: hoạt độ tổng số
NKHC
: ngưng kết hồng cầu
OD
Bảng PL 1. Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (μg/ml). ............ 45
Bảng PL 2. Giá trị Rf và lg M của protein trong thang chuẩn ................................... 45
Bảng PL 3. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC của
lectin................................................................................................................. 46
Bảng PL 4. Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin
.......................................................................................................................... 46
Bảng PL 5. Kết quả ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS và HĐR của lectin. .. 46
Bảng PL 6. Kết quả đo A 280 nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi chạy
sắc ký ion DEAE-Sepharose. ........................................................................... 47
Bảng PL 7. Kết quả đo A 280 nm và hoạt độ NKHC của các phân đoạn sau khi chạy
sắc ký lọc gel trên cột nhựa Sephadex S-200 .................................................. 49
Bảng PL 8. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ bọt biển
S. flexibilis. ....................................................................................................... 50
Bảng PL 9. Kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ bọt bển S.
flexibilis. ........................................................................................................... 50
DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Hình 1.1. Một số đại diện bọt biển (theo Hickman) ................................................................... 4
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình sàng lọc lectin ................................................................................... 16
Hình 2.2. Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry. ..................................................... 18
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ bọt biển S. flexibilis ........................................... 19
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ CaCl2 (mM). .......................................... 20
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ : dung môi chiết (w/v). ................................. 21
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết (giờ).............................................. 22
Hình 2.7. Đồ thị tương quan giữa lgM và Rf của protein trong thang chuẩn......................... 26
Hình 3.1. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 (mM) đến hoạt độ NKHC ....................... 30
của lectin........................................................................................................................................ 30
Hình 3.2. Kết quả ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) đến HĐTS và
HĐR của lectin.................................................................................................................... 31
học, y học tiềm năng đây là điều kiện thuận lợi cho việc đẩy mạnh các nghiên cứu về
các hợp chất cho nguồn gốc từ động vật biển mà đặc biệt là động vật thân lỗ.
Do đó, việc đa dạng hóa nguồn nguyên liệu thu nhận lectin là việc cần thiết để thực
hiện các nghiên cứu sâu hơn nhằm định hướng ứng dụng trong y dược cũng như ứng
dụng trong các lĩnh vực khác.
Xuất phát từ những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tinh
chế và đánh giá một số đặc tính hóa học của lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis”.
Mục tiêu nghiên cứu
- Sàng lọc lectin từ bọt biển và đánh giá hoạt tính sinh học của chúng. Chọn ra
loài bọt biển thích hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.
- Xác định điều kiện thích hợp để tách chiết, tinh sạch lectin từ bọt biển Stylissa
flexibilis.
2
- Xác định các tính chất hóa lý của lectin từ bọt biển Stylissa flexibilis.
Nội dung nghiên cứu
1. Tách, tinh chế lectin
- Nghiên cứu sàng lọc chọn ra mẫu thích hợp để tiến hành cho các nghiên cứu tiếp
theo.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết lectin từ bọt biển Stylissa
flexibilis.
- Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose.
- Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S-200.
2. Xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của lectin.
3. Nghiên cứu các đặc tính lý hóa của lectin
- Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến khả năng ngưng kết hồng cầu của lectin.
- Khả năng liên kết carbohydrate.
Ý nghĩa khoa học
Thu nhận thêm thông tin khoa học về lectin từ động vật bọt biển.
Homoscleromorpha thuộc Demospongiae, thực sự được phân tách rõ rệt. Do đó, chúng
gần đây đã được công nhận là loại bọt biển thứ tư.
Lớp bọt biển đá vôi (Calcarea)
Sống ở biển, có bộ xương là các gai xương đá vôi có một, ba hay bốn trục. Cơ
thể kiểu: ascon, leucon hay sycon. Các loài hiện còn sống chỉ có cấu trúc cơ thể kiểu
ascon [28].
4
Lớp bọt biển silic (Hexactinellida)
Sống đơn độc, thân cao, phân bố ở biển sâu của vùng cực đới xích đạo. Cấu trúc
cơ thể rất tinh tế và đối xứng, với gai silic 6 tia. Một số loài sống bám vào đáy mềm nhờ
các gai silic, tuy nhiên phần lớn sống trên nền đáy cứng. Cấu trúc cơ thể kiểu sycon hay
leucon. Lớp tế bào ngoài của bọt biển là hợp bào, tức là không có lớp mô bì dẹt. Đại
diện có các loài: Hyalonema, lophocalyx [28].
Lớp bọt biển mềm (Demospongiae)
Đây là lớp lớn, gồm 80% số loài hiện đang sinh sống, phân bố ở biển hay nước
ngọt. Cơ thể kiểu leucon, bộ xương là sợi spongin hay các gai silic gồm một hay bốn
trục, không có gai đá vôi [28].
Hình 1.1. Một số đại diện bọt biển (theo Hickman)
A: pseudocoralia
B:Ectyoplania
C: Monachora
1.1.4. Bọt biển Stylissa flexibilis.
Stylissa flexibilis thuộc lớp Demospongiae. Cơ thể xốp bao gồm silic và
sponginevezel và có khả năng hấp thụ rất nhiều nước. Tên khoa học của loài được xuất
Trong bọt biển có nhiều chất chuyển hóa có hoạt tính tốt có tiềm năng ứng dụng
trong y dược như khả năng chống viêm và chống virus. Hơn 5.300 sản phẩm khác nhau
được biết đến từ bọt biển và các vi sinh vật có liên quan và hơn 200 các chất chuyển hóa
mới từ bọt biển được báo cáo mỗi năm [30]. Một ví dụ được đưa ra vào năm 1999, khi
các nhà nghiên cứu cô lập C-nucleoside từ Cryptotethya crypta, chế tạo ra thuốc chống
ung thư đầu tiên có nguồn gốc từ sinh vật biển, được sử dụng lâm sàng để điều trị bệnh
bạch cầu [30]. Nhiều sản phẩm tự nhiên biển đã thành công tiến đến giai đoạn cuối của
thử nghiệm lâm sàng, như ara-A (vidarabine) một loại thuốc chống virus được sử dụng
chống lại virus viêm não herpes simplex. Hơn nữa, một số lượng lớn các loại bọt biển đã
được chọn làm thử nghiệm hứa hẹn cho việc đánh giá lâm sàng mở rộng, bao gồm cả
manzamine A (hoạt tính chống sốt rét, bệnh lao, HIV, và bệnh khác), lasonolides (hoạt
tính kháng nấm) và psammaplin A (hoạt tính kháng khuẩn) [1]. Do đó, có tiềm năng đáng
kể trong ngành công nghiệp dược phẩm như một phương tiện tạo ra các loại thuốc mới.
Bọt biển đã trở thành đối tượng nghiên cứu của nhiều ngành công nghiệp quan
trọng và hấp dẫn, với sản lượng khai thác hàng năm từ năm 1913-1938 thường xuyên
vượt quá 181 tấn và tạo ra hơn 1 triệu đô la Mỹ. Đối với năm 2003, nhu cầu về bọt biển
tăng cao là 2.127 tấn, sản lượng toàn cầu thu hoạch chỉ đáp ứng một phần tư số lượng
cần thiết [30].
1.2. TỔNG QUAN VỀ LECTIN
6
1.2.1. Lịch sử nghiên cứu lectin.
Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng
đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu. Tuy
nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ
nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho
các mục đích y tế. Năm 1884, Warden và Waddel đã giải thích nguyên lý gây độc của
các hạt Aprus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dịch lỏng
có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus precatorius là một protein. Những
cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [4]. Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài
lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ
(Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa
lectin [5].
Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được
trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [3]. Lectin từ họ Dâu
tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay (Artocarpus tonkinensis), Sakê chi
Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa lectin có hoạt tính NKHC rất cao [2].
Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin
ở nhiều loài của thực vật và động vật như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes)
và Rong (Algae) [22].
Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa
học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [1].
Sự phân bố lectin trong giới động vật
Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm. Lectin trong giới
động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus polyphemus).
Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật thuộc ngành Ruột
khoang mới đây là ngành động vật thân lỗ cũng đã được tiến hành điều tra.
Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang
- Khánh Hòa xuất hiện 10 loài có chứa lectin [1].
Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều tra
cơ bản. Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp
Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) cũng có chứa lectin. Ngoài
ra, còn có một số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng
cá vược (Perca piuviatitis). Một kết quả nghiên cứu khá thú vị, là ở mô người như mô
cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng
8
chứa lectin. Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin. Đó cũng là bằng chứng
9
1.3.2. Phân loại lectin từ bọt biển.
Lectin từ bọt biển thường được phân loại theo cấu trúc chính của chúng bao gồm
galectin, loại C, loại tachylectin và loại F.
- Galectin ( lectin loại S): là nhóm lectin liên kết đặc trưng với β-galectside, dựa
vào cấu trúc mà chia thành 3 loại: galectin - proto, galactin-chimra và galactin-tandemrepeat-type [10]. Các galectin nguyên mẫu thường ở dạng dimer. Galectin-chirma đều
có hai miền riêng biệt: galactin dạng N-terminal và galectin dạng C-terminal, chúng có
khả năng liên kết với các gốc thuốc không đường để tạo ra các gốc thuốc có đường. Tuy
nhiên, galectin từ bọt biển khác với galectin từ động vật bởi chúng chứa các đặc trưng
cấu trúc khác nhau [16].
- Lectin loại C: đây là lectin rất phổ biến có mặt trong vi khuẩn, thực vật và động
vật. Lectin này chứa các chất: ficolin, conglutinin, lõi proteoglycan, selectin, thụ thể
endocytic và thụ thể macrophage. Sự ràng buộc của các protein này với lượng
carbohydrate cụ thể được quy định bởi sự có mặt của Ca2+ trong môi trường [21].
- Tachylectin-like lectin: lectin này có khả năng liên kết với N-acetylglucosamine
và N-acetylgalactosamine. Lectin này gồm 6 tachylectin tandem repeat thường biểu hiện
khả năng kháng khuẩn chống lại sinh vật tiền nhân bằng cách liên kết màng carbohydrate
[7, 19].
- Lectin loại F: được đặc trưng bởi carbohydrate và cụ thể liên kết đặc hiệu với
fucose. Trong lectin loại F, Ca2+ không đóng vai trò quan trọng trong hoạt động gắn kết
nhưng giúp ổn định các protein [21].
1.3.3. Cấu tạo của lectin từ bọt biển.
Khối lượng phân tử của lectin từ bọt biển.
Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện di trên
gel polyacrylamide, phương pháp siêu ly tâm và phương pháp quang phổ khối ion hóa
phun điện tử (electron spray ionization-mass spectrometry) khối lượng phân tử của khá
nhiều dạng lectin đã được xác định.
Nói chung, các lectin đã được khảo sát cho thấy sự thay đổi lớn về khối lượng đơn
vị từ monomer đến octamer. Đa số các lecin đã được nghiên cứu thì khối lượng phân tử
Theo Sharon (1989), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người,
động vật mà còn có khả năng gây ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế
bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi [20].
Ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt độ của lectin
- Ảnh hưởng của pH
Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở
đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định.
11
So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ bọt biển có khoảng pH
thích hợp, hầu hết từ pH 6 đến 8 như các bọt biển thuộc loài Lubomirskia baicalensis,
Axinella corrugata, Ephydatia fluviatilis.
- Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường.
Lectin có bản chất là protein và glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt
độ của chúng. So với lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, hoạt độ của lectin từ bọt
biển khá ổn định. Lectin dạng C, lectin dạng F hay tachylectine từ bọt biển đa số được
nghiên cứu đều ổn định ở nhiệt độ 60 0C như loài Lubomirskia baicalensis, Pellina
semitubulosa, Crambe crambe, Ephydatia fluviatilis. Một phần của chúng đặc trưng khả
năng ngưng kết hồng cầu. Sự chịu nhiệt vừa phải này chủ yếu do sự hiện diện của các
liên kết disulfide trong cấu trúc của chúng [13, 23]. Các nghiên cứu khác cho thấy rằng
cũng có một số loài bọt biển ổn định ở 100 °C như loài Cinachyrella sp, Aplysina
archeri.
- Ảnh hưởng của một số nhân tố khác.
Enzyme có khả năng làm tăng hoạt độ lectin. Trong nhiều thí nghiệm, các hồng
cầu được xử lý bằng các enzyme như trypsin, papain thì chúng dễ bị lectin làm ngưng
kết. Sở dĩ có hiện tượng này là vì khi hồng cầu xử lý với enzyme thì chính enzyme đã
thủy phân giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm
carbohydrate của nó, vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dẫn
đến hoạt độ lectin tăng lên.
muối trung tính khác nhau nên kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính thường được sử
dụng trong các quy trình chiết xuất lectin nhằm cô đặc dung dịch protein cần tách.
Kết tủa phân đoạn bằng dung môi
Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như axetone,
polyetylenglycol, ethanol, làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng
có thể bị kết tủa nhanh chóng. Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây
biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành
ở nhiệt độ thấp.
Thẩm tích
Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm
với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn so với kích
thước phân tử của màng. Thẩm tích thường dùng để loại muối và những chất có khối
lượng phân tử nhỏ khác ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích.
1.4.2. Các kỹ thuật tinh chế lectin
Sắc ký trao đổi ion
Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy thuộc vào pH
của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng tính chất này người
13
ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm
chứa ion tích điện dương như DEAE-Sepharose, DEAE-xenluloza, DEAE-trisacryl,
được sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện
âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl, được sử dụng làm chất trao đổi
cation. Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là
dung lượng trao đổi. Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế
lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những
điều kiện môi trường pH nhất định.
Sắc ký lọc gel
Sắc ký lọc gel là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích
Copyright: Tài liệu đại học ©