BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ QUANG HIẾU
Mã sinh viên : 1201203

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TỒN DƯ
KHÁNG SINH NHÓM MACROLID VÀ
SULFONAMID TRONG MỘT SỐ
NGUỒN NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC
PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI- 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGÔ QUANG HIẾU
Mã sinh viên: 1201203

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ TỒN DƯ
KHÁNG SINH NHÓM MACROLID VÀ
SULFONAMID TRONG MỘT SỐ
NGUỒN NƯỚC THẢI NHÀ MÁY DƯỢC
PHẨM TRÊN ĐỊA BÀN HÀ NỘI
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:

1. PGS. TS. Nguyễn Thị Kiều Anh

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .................................................. 3
1.1.1. Clarithromycin, Azithromycin............................................ 3
1.1.2. Sulfamethoxazol, Trimethoprim......................................... 5
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu............................................. 8
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao .................................................. 8
1.2.2. Phương pháp chiết pha rắn ............................................... 13
1.3. Tổng quan về sản xuất kháng sinh tại Việt Nam ............................. 15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 18
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................. 18
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn ....................................................... 18
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị ................................................... 19
2.1.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc, dung dịch chuẩn làm việc
..................................................................................................... 19
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu ....................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................. 21
2.2.1. Khảo sát thực địa và lấy mẫu............................................ 21
2.2.2. Phương pháp xử lý mẫu.................................................... 22
2.2.3. Điều kiện phân tích bằng LC- MS/MS............................. 22


2.2.4. Đánh giá sự phù hợp của phương pháp phân tích đã lựa
chọn............................................................................................. 24
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu ................................................ 24

AR

: Thuốc thử phân tích

CLA

: Clarithromycin

CTPT

: Công thức phân tử

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC – MS/MS : Sắc ký lỏng khối phổ hai lần
LOD

: Giới hạn phát hiện

m/z

: Khối lượng/ điện tích

MeOH

: Methanol

MeCN


TB

: Trung bình

TMP

: Trimethoprim


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1.

Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm macrolid

3

Bảng 1.2.

Số SĐK kháng sinh từ 01/2010 đến 12/2015 ở Việt Nam

16

Bảng 2.1.

Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

18



trắng thêm chuẩn- (RSD)
Bảng 3.3.

Kết quả xây dựng đường chuẩn các kháng sinh nghiên

27

cứu
Bảng 3.4.

Kết quả xác định dư lượng kháng sinh của cơ sở 1 và 2

29

Bảng 3.5.

Kết quả xác định dư lượng kháng sinh của cơ sở 3 và 4

30


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1.

Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

Hình 1.2.


So sánh dư lượng kháng sinh (ng/l) tại vị trí 1 và 2 của cơ

36

sở 4
Hình 3.6.

Cấu trúc phân tử nằm trên bề mặt hạt trong cột HLB

38

Hình 3.7.

Vị trí lấy mẫu của cơ sở 1

39


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay thực trạng vi khuẩn kháng kháng sinh đang là vấn đề thời sự
toàn cầu và đặc biệt nghiêm trọng ở các nước đang phát triển, với gánh nặng
của các bệnh nhiễm khuẩn và những chi phí bắt buộc cho việc thay thế các
kháng sinh cũ bằng các kháng sinh mới, đắt tiền. Các bệnh nhiễm khuẩn
đường tiêu hoá, đường hô hấp, các bệnh lây truyền qua đường tình dục và
nhiễm khuẩn bệnh viện là các bệnh hàng đầu có tỉ lệ mắc và tỉ lệ tử vong cao
ở các nước đang phát triển [9]. Việc kiểm soát các loại bệnh này đã và đang
chịu sự tác động bất lợi của sự phát triển và lan truyền tình trạng kháng kháng
sinh của vi khuẩn.
Nguyên nhân bên cạnh việc sử dụng kháng sinh không theo hướng dẫn
của bác sĩ kê đơn, còn là do sự tích lũy kháng sinh trong môi trường tự nhiên,

azithromycin, sulfamethoxazol và trimethoprim trong nước thải nhà máy
dược phẩm bằng LC-MS/MS.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
1.1.1. Clarithromycin, Azithromycin
1.1.1.1. Cấu trúc và tính chất
Clarithromycin, azithromycin đều là kháng sinh nhóm macrolid có cấu
trúc hóa học cơ bản là vòng lacton (chứa từ 12-17 nguyên tử carbon - còn gọi
là vòng ester) có chứa 1 hay nhiều đường (deoxy sugar) (thường là cladinose
và desosamin). Dựa trên số nguyên tử carbon trên vòng, macrolid được chia
làm nhóm vòng lacton 14C, 15C, 16C [19].
Bảng 1.1. Cấu trúc vòng lacton các phân nhóm macrolid

Vòng lacton 14C
(erythromycin,
roxithromycin,
clarithromycin)

Vòng lacton 15C
(Azithromycin)

Vòng lacton 16C
(midecamycin,
spiramycin, josamycin)

Azithromycin

1.1.1.4. Phổ tác dụng
Macrolid có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu tập trung vào một số chủng
vi khuẩn gram dương và một số vi khuẩn không điển hình.
Macrolid có hoạt tính trên cầu khuẩn gram dương (liên cầu, tụ cầu), trực
khuẩn gram dương (Clostridium perfringens, Corynebacterium diphtheriae,
Listeria monocytogenes). Thuốc không có tác dụng trên phần lớn các chủng
trực khuẩn gram âm đường ruột và chỉ có tác dụng yếu trên một số chủng vi
4


khuẩn gram âm khác như H. influenzae và N. meningitidis, tuy nhiên lại có
tác dụng khá tốt trên các chủng N. gonorrhoeae. Kháng sinh nhóm macrolid
tác dụng tốt trên các vi khuẩn nội bào như Campylobacter jejuni, M.
pneumoniae, Legionella pneumophila, C. trachomatis, Mycobacteria (bao
gồm M. scrofulaceum, M. kansasii, M. avium-intracellulare – nhưng không
tác dụng trên M. fortuitum). Một số chủng liên cầu huyết tán bêta nhóm A và
tụ cầu kháng lại macrolid [5].
1.1.2. Sulfamethoxazol, Trimethoprim
1.1.2.1. Cấu trúc và tính chất
Sulfamethoxazol (SMX)
Sulfamethoxazol là thuốc thuộc nhóm sulfonamid.
- CTPT: C10H11N3O3S
- KLPT: 253,279
- Tên khoa học: N1-(5-methyl-3-isoxazolyl)
sulfanilami [6].
- Độ tan: SMX không tan trong nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong
ethanol 96%, tan trong dung dịch natri hydroxyd loãng và dung dịch acid
loãng [4].
Trimethoprim (TMP)
Trimethoprim là kháng sinh tổng hợp dẫn xuất pyrimidin.

Legionella pneumophilia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria menigitidis, E.
coli, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Proteus indol,
Klebsiella, Haemophilus influenzae… [5].
TMP chống lại tác nhân gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu như: E.coli,
Proteus,

Klebsiella,

Enterobacter,

Staphylococcus

saprophyticus,

Streptococcus faecalis và chống lại nhiều vi khuẩn dạng coli [5].
1.1.3. Tình trạng đề kháng của vi khuẩn tại Việt Nam
6


Vấn đề vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề nóng tại Việt Nam và
đương ở mức độ cao. Trong số các nước thuộc mạng lưới giám sát các căn
nguyên kháng thuốc châu Á (ANSORP), Việt Nam có mức độ kháng
penicillin ở mức 71,4% và kháng erythromycin ở mức 92,1%. 75% các chủng
pneumococci kháng với 3 loại kháng sinh trở lên [9].
Tình

trạng

kháng


Macrolid và Lincosamid- Bản chất của các yếu tố kháng thuốc và ý nghĩa lâm
sàng của chúng” của Roland Leclercq, việc kháng kháng sinh nhóm macrolid
và lincosamid đang gia tăng nhanh chóng trong các báo cáo về các ca lâm
sàng được phân lập có chứa vi khuẩn gram dương, với các cơ chế kháng
kháng sinh đa dạng bao gồm thay đổi cấu trúc ribosom, bất hoạt thuốc và kết
quả là tạo ra rất nhiều phenotype kháng thuốc. Sự kháng thuốc không chỉ xuất
hiện đối với chủng Staphylococci mà còn xuất hiện trên Streptococci [16].
7


Vi khuẩn kháng Sulfonamid có thể xảy ra thông qua đột biến gen DHPS
(folP) hoặc thay thế gen DHPS (sul), tạo ra sản phẩm có ái lực thấp với
sulfonamid [18]. Trong hai cơ chế trên thì gen sul là phổ biến nhất.
1.2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.2.1.1. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở
của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh rắn chứa trong cột, nhờ dòng di
chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp
thụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [2]
[3].
1.2.1.2. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng
một dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ
di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số
phân bố của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột
khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành píc, làm cơ sở cho
phân tích định tính và định lượng.
1.2.1.3. Sắc ký lỏng khối phổ
Khái niệm

9


không (khoảng 6-10 torr). Vì vậy, không thể trực tiếp bơm từ cột LC vào
nguồn MS. Nhìn chung, bộ phần chuyển là một phần cơ học đơn giản của hệ
thống LC-MS/MS chuyển lượng chất phân tích cực đại, loại bỏ một phần của
pha động được sử dụng trong LC và bảo vệ bản chất hóa học của các chất
phân tích. Theo yêu cầu, bộ phận chuyển không nên can thiệp vào hiệu quả
ion hóa và điều kiện chân không của hệ thống MS. Ngày nay, bộ phận chuyển
được áp dụng rộng rãi dựa trên các phương pháp ion hoá áp suất khí quyển
(API) như ion hoá bằng phun điện tử (ESI), ion hoá hóa học áp suất khí quyển
(APCI) và ion hoá bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI).
Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion
phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành
các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao.
Ion phân tử và các mảnh ion là các phân tử có khối lượng từ đó người ta
tính được tỷ số khối lượng ion/ điện tích (m/z).
Có ba kiểu ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion
hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization
– APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure
Photonization – APPI).
Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí
quyển. Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống
mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V. Đồng thời,
các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết
quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật
này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các
phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da.

10

toán, xử lý, báo cáo, kết xuất dữ liệu thô vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi
phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :
Quét toàn phổ (SCAN)
Khi xử lý số liệu với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh
ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân
tích. Thường dùng để định danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ
đủ lớn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được
lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con
tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và
bền nhất
Selected Ion Monitoring (SIM)
Trong chế độ SIM, đầu dò MS chỉ ghi nhận tín hiệu một số mảnh ion đặc
trưng cho chất cần xác định. Khối phổ SIM chỉ cho tín hiệu của các ion đã
được lựa chọn trước đó, do vậy không thể dùng để định danh hay so sánh với
các thư viện có sẵn. Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ SIM thường
được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ.
SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction
Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2
kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.

12


SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các
mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để
phát hiện.
MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi
lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi
phổ MRM thông dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ

có thể chia thành các loại cột có bản chất khác nhau, bao gồm: pha thuận, pha
đảo hay trao đổi ion.
Có 2 cơ chế tách chất phân tích khỏi mẫu nhờ chiết pha rắn:
Các chất tạp, nhiễu được rửa giải khỏi cột, chỉ có chất phân tích được lưu
giữ lại sao cho lượng tạp chất trong chất phân tích được giảm thiểu tối đa,
chất phân tích sau đó được rửa giải bằng một dung môi rửa giải mạnh, bay hơi
tới cắn hoặc trực tiếp đem đi phân tích.
Tạp chất, chất nhiễu được giữ lại trên cột, chất phân tích đi ra theo pha
lỏng được thu hồi.
Để xây dựng quy trình chiết pha rắn, cần tiến hành các bước như sau:
- Chọn pha rắn: tuỳ theo bản chất của chất phân tích mà lựa chọn pha rắn
có bản chất thích hợp. Mặt khác, tuỳ thuộc vào lượng chất phân tích trong
mẫu mà lựa chọn cột có lượng pha rắn và thể tích rửa giải khác nhau. Lượng
pha rắn dao động từ 50 mg đến 10 g, ứng với thể tích nền từ 125 µL đến 20
ml.
- Qui trình chiết (SPE cột pha đảo): gồm 4 giai đoạn
1. Hoạt hóa cột chiết: Cho dung môi phù hợp đi qua pha rắn để hoạt hóa
các nhóm hoạt động, đồng thời loại bỏ các khí trong cột và thay thế vào đó là
dung môi.
2. Nạp mẫu: Trước khi nạp mẫu vào cột, nếu cần phải xử lý mẫu sơ bộ
để đưa mẫu vào môi trường phù hợp sao cho giai đoạn này phải lưu giữ được
14


toàn bộ chất phân tích trên cột. Chất phân tích cùng một số chất khác được
giữ lại trên cột, các tạp chất đi ra khỏi cột càng nhiều càng tốt để tránh cạnh
tranh và ảnh hưởng đến quá trình tương tác của chất phân tích với pha tĩnh.
3. Rửa tạp chất: Sau khi nạp mẫu, trên cột vẫn còn nhiều tạp chất khác
có liên kết với pha tĩnh. Phải chọn được dung môi rửa tạp sao cho có thể hòa
tan và kéo được các tạp chất mà không kéo theo chất phân tích.

291

Erythromycin

75

Penicillin

35

Cefuroxim

198

Cefoperazon

71

Lincomycin

34

Cephalexin

184

Neomycin

71


148

Ceftazidim

61

Gentamycin

25

Cefaclor

129

Levofloxacin

60

Doxycyclin

21

Cefadroxil

113

Ampicillin

57


94

Tetracyclin

40

Rifampicin

11

Sulfamethoxazol

90

Clindamycin

39

Vankomycin

9

Cedinir

77

Tobramycin

35


azithromycin, clarithromycin, sulfamethoxazol, trimethoprim trong nước thải
nhà máy sản xuất dược phẩm. Do vậy đề tài này được thực hiện tiếp tục theo
hướng nghiên cứu này, ứng dụng phương pháp để xác định dư lượng kháng
sinh trong mẫu nước thải của một số nhà máy sản xuất dược phẩm trên địa
bàn Hà Nội nhằm cung cấp số liệu thực tế về tình trạng dư lượng
azithromycin, clarithromycin, sulfamethoxazol, trimethoprim trong nước thải
công nghiệp dược, từ đó tiến tới bước đầu xác định ảnh hưởng đến hệ vi sinh
vật dẫn tới tình trạng kháng kháng sinh.

17