BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG
HÀ NỘI - 2017

1201439

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI GLYCIN,
CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT
BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC
THÂN NƢỚC (HILIC) KHÔNG TẠO
DẪN XUẤT
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

1 - 2017
HÀ NỘI


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

ĐỖ THỊ TUYẾT NHUNG
1201439

XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP
PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI GLYCIN,
CYSTEIN VÀ AMONI GLYCYRRHIZAT
BẰNG SẮC KÝ LỎNG TƢƠNG TÁC
THÂN NƢỚC (HILIC) KHÔNG TẠO

Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2017,
Sinh viên

Đỗ Thị Tuyết Nhung

iii


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………………1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN.....................................................................................2
1.1. Tổng quan về sắc ký lỏng tương tác thân nước ...................................................2
1.1.1. Nguyên tắc ........................................................................................................2
1.1.2. Ưu điểm .............................................................................................................5
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ....................................................................6
1.2.1. Glycin ................................................................................................................7
1.2.2. Cystein ...............................................................................................................8
1.2.3. Amoni glycyrrhizat ...........................................................................................8
1.2.4. Một số phương pháp phân tích acid amin .........................................................9
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................13
2.1. Đối tượng nghiên cứu.........................................................................................13
2.2. Nguyên vật liệu ..................................................................................................13
2.2.1. Hoá chất ..........................................................................................................13
2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch ...................................................................................14
2.2.3. Chuẩn bị đệm ..................................................................................................15
2.2.4. Thiết bị, dụng cụ .............................................................................................15
iv

4.1. Kết luận ..............................................................................................................40
4.2. Kiến nghị ............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

AG

Ammonium glycyrrhrizate

Amoni glycyrrhizat

CYS

Cysteine


Pha thuận

RP

Reverse phase

Pha đảo

SP

Stationary phase

Pha tĩnh

UV

Ultraviolet

Tử ngoại

VIS

Visual

Khả kiến

vii



Hình 3.4: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp ..........................................................................28
Hình 3.5: Sắc ký đồ các mẫu tại hai bước sóng 254 nm và 200 nm .........................29
Hình 3.6: Kết quả độ phù hợp hệ thống ....................................................................31
Hình 3.7: Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic
của các chất glycin, cystein và amoni glycyrrhizat ...................................................33

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
Acid amin đóng vai trò rất quan trọng trong cơ thể sống, chúng thường có mặt
trong các thực phẩm bổ sung dinh dưỡng và các thuốc điều trị các triệu chứng suy nhược
do thiếu acid amin. Bên cạnh đó, chúng có thể được phối hợp trong các chế phẩm điều trị
với các mục đích khác [6] [15], trong đó, glycin và cystein kết hợp với amoni
glycyrrhizat trong chế phẩm thuốc tiêm nhằm làm giảm tác dụng phụ tăng aldosteron, hỗ
trợ gan thực hiện các phản ứng đào thải độc tố [21]. Việc kiểm nghiệm dạng thuốc này
còn gặp phải khó khăn do chứa glycin và cystein là hợp chất rất phân cực, chúng hầu như
không được lưu giữ khi phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng pha đảo. Thông thường, ta sử
dụng phản ứng tạo dẫn xuất cho các acid amin, sau đó định lượng bằng sắc ký pha đảo
[23] hoặc sắc ký trao đổi ion [2]. Những phương pháp này còn phức tạp ở khâu chuẩn bị
mẫu, khó khăn khi định tính, định lượng đồng thời cả ba hoạt chất trên trong chế phẩm.
Sắc ký lỏng tương tác thân nước là một kỹ thuật mới, có thể giải quyết được vấn
đề này. Dựa trên sự kết hợp giữa pha tĩnh phân cực và pha động phân cực [12], ưu điểm
của HILIC là khả năng lưu giữ hợp chất rất phân cực [24]. Do đó, HILIC có thể áp dụng
phân tích trực tiếp các acid amin mà không cần tạo dẫn chất. Hơn nữa, HILIC vẫn có khả
năng phân tích những hợp chất phân tử lớn, kém phân cực [18] như amoni glycyrrhizat,
có thể ứng dụng để phân tích đồng thời ba chất amoni glycyrrhizat, glycin và cystein
trong một chế phẩm. Tính đến thời điểm hiện tại, theo tìm hiểu của tôi, ở Việt Nam và
trên thế giới chưa có nghiên cứu phân tích đồng thời ba chất trên được công bố.
Từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phƣơng pháp phân tích đồng


2


Hình 1.1: Cơ chế tách của HILIC
Đây cũng coi là một nhược điểm của HILIC do quá trình phân tích rửa giải phụ
thuộc nhiều vào sự solvat hoá trên bề mặt các hạt pha tĩnh, cột HILIC cân bằng chậm,
khả năng lặp lại kém, bị ảnh hưởng nhiều bởi các yếu tố như pH, sự thay đổi nhỏ trong tỷ
lệ pha động. Đối với một số hợp chất, nhiệt độ quá trình tách và loại detector có thể ảnh
hưởng đến thời gian lưu, hình dạng pic sắc ký.
b. Pha tĩnh
Như đã được đề cập ở trên, pha tĩnh HILIC phân cực, điều này giúp tạo nên một
lớp chất lỏng thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh lưu giữ chất phân tích. Khi tăng nhóm
chức phân cực trên pha tĩnh, lớp chất lỏng thân nước trên bề mặt pha tĩnh sẽ tăng lên,
tăng thời gian lưu giữ chất phân cực.
Khi phân loại về mặt hoá học, pha tĩnh HILIC được phân loại thành các loại sau:
 Silica: Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề
mặt phân cực của silica.
- Nhóm này có 4 loại: Silica xốp hoàn toàn (được sử dụng phổ biến do dung tích cột
lớn tăng khả năng chứa một lượng mẫu tiêm lớn hơn, đồng thời kích thước hạt đa dạng
hơn); silica xốp bề mặt; silica nguyên khối (ứng dụng còn hạn chế với HILIC); ethylene
bridged hybrids (sử dụng trong vùng pH rộng).
 Dẫn xuất silica:

3


- Dẫn xuất silica trung tính: gồm amid silica, diol silica, cyanopropyl silica (ứng
dụng với HILIC còn hạn chế), cyclodextrin silica (được ứng dụng tách các chất trong
dịch chiết dược liệu và các amino acid).

đệm để đảm bảo rằng chất phân tích chỉ tồn tại ở 1 dạng ion nhất định. Với các chất phân
cực trung tính thì không cần sử dụng đệm. Trường hợp trao đổi ion ảnh hưởng đến thời
gian lưu, có thể giảm thời gian lưu bằng cách tăng nồng độ đệm, tuy nhiên nồng độ đệm
tăng có thể ảnh hưởng đến quá trình solvat hoá, hình dạng pic (ví dụ: pic kéo đuôi, kéo
dài thời gian tái cân bằng pha tĩnh).
1.1.2. Ưu điểm
Sắc ký pha đảo được sử dụng phổ biến trong phân tích, đặc biệt đối với các chất
trong ngành dược. Tuy nhiên, với những dược chất phân cực mạnh, chúng không được
lưu giữ hoặc lưu giữ không đủ lâu trong sắc ký pha đảo cổ điển, chúng thường được phân
tích bằng sắc ký pha thuận (normal phase liquid chromatography – NPLC) hoặc sắc ký
cặp ion.
HILIC cũng được ứng dụng trong trường hợp phân tích các hợp chất phân cực
này, do loại sắc ký này sử dụng cột pha tĩnh phân cực giống NPLC nhưng pha động phân
cực lại giống RPLC. Nhờ đặc điểm này, HILIC có nhiều lợi thế trong phân tách chất
phân cực hơn NPLC hay RPLC.
Thứ nhất, HILIC có nhiều ưu điểm trong phân tích các hợp chất rất phân cực so
với kỹ thuật tách RPLC hay NPLC. Khắc phục nhược điểm không lưu giữ các chất phân
cực của RPLC, như đã trình bày ở mục cơ chế tách HILIC, chất phân tích được phân bố ở
cả lớp dung môi thân nước bao trên bề mặt pha tĩnh và pha động khan nước, từ đó tăng
thời gian lưu của chất phân tích phân cực. Đối với NPLC, tuy có thể lưu giữ các chất
phân cực với thời gian lưu phù hợp, nhưng phương pháp này lại sử dụng dung môi pha
động độc hại, không thân thiện với môi trường, hoà tan kém các chất thân nước. Vì vậy
NPLC không phải lựa chọn tối ưu trong trường hợp này. Với sắc ký cặp ion, phương

5


pháp này cũng cho thời gian lưu chất phân cực phù hợp, nhưng nhược điểm là khả năng
đạt cân bằng chậm, dễ bị mất trạng thái cân bằng khi tiêm.
Thứ hai, với các chất phân cực hấp thụ UV kém, HILIC có thể giúp đơn giản hoá

Hình 1.2: Công thức cấu tạo glycin
Danh pháp: acid 2 - aminoacetic acid. Tên khác: acid aminoethanoic.
Công thức phân tử: C2H5NO2. Phân tử lượng 75,07 g/mol.
Tính chất vật lý: Tinh thể glycin màu trắng hoặc gần trắng, vị ngọt, dễ tan trong
nước; rất ít tan trong rượu.
Tính chất hoá học: pKa: 2,37 (20oC) với pK1: 2,34 và pK2: 9,6; pI: 5,97 [4].
Bảo quản: Dưới 40oC, không đông lạnh.
Chỉ định: Glycin là một acid amin không thiết yếu, được sử dụng như một thực
phẩm bổ sung, tưới rửa bàng quang trong phẫu thuật tiết niệu, kháng acid dạ dày trong
điều trị loét dạ dày [5]. Gần đây, glycin được chứng minh có vai trò hạ aldosteron, giảm
tác dụng không mong muốn khi điều trị dài ngày với glycyrrhizin [21], ứng dụng bổ sung
trong các chế phẩm chứa glycyrrhizin.

7


1.2.2. Cystein
Cystein (CYS) có công thức cấu tạo như sau:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo cystein
Danh pháp: acid 2-amino-3-sulfanylpropanoic.
Công thức phân tử: C3H7NO2S. Phân tử lượng: 121,0 g/mol.
Tính chất vật lý: Tinh thể màu trắng hoặc không màu, dễ tan trong nước, ít tan
trong cồn.
Tính chất hoá học: pK1: 2,35 và pK2: 9,05; pI: 5,14 [4].
Bảo quản: Tránh ánh sáng.
Tác dụng: Cystein là một acid amin không thiết yếu, sử dụng như thực phẩm bổ
sung, có trong các chế phẩm sử dụng trong nhãn khoa; thuốc nhỏ mắt để ngăn loét giác
mạc loét sau bỏng hóa chất. Gần đây, cystein được chứng minh có vai trò hỗ trợ phản
ứng thải độc ở gan, cải thiện tình trạng bệnh nhân [21], nên được ứng dụng bổ sung trong

di mao quản, sắc ký lỏng khối phổ, tuy nhiên, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất
là sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Các acid amin thường hấp thụ UV-VIS rất kém do trong cấu trúc hầu như không
có nhóm mang màu nên trong các phương pháp phân tích, acid amin thường được tạo dẫn
xuất trước hoặc sau cột phân tách để có thể phát hiện bằng detector UV-VIS hoặc
9


detector huỳnh quang [2]. Kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột còn có thể cho nhiều dẫn xuất
khác nhau của cùng một acid amin, do đó gây trở ngại cho việc biện giải kết quả phân
tích. So với kỹ thuật tạo dẫn xuất trước cột, kỹ thuật tạo dẫn xuất sau cột thường ít bị ảnh
hưởng hơn bởi các biến thiên trong việc thực hiện phép định lượng hơn.
Các tác nhân tạo dẫn xuất hóa sau cột hay được sử dụng là ninhydrin và
o-phthalaldehyd. Acid amin được tách ra khỏi nhau nhờ cột trao đổi cation sau đó được
cho phản ứng với ninhydrin tạo ra sản phẩm được nhận biết bằng detector UV-VIS hoặc
huỳnh quang. Ngoài ra, acid amin có thể được phân tích bằng cách tạo dẫn xuất trước cột,
sau đó các sản phẩm này được tách bằng hệ thống sắc ký pha đảo với detector UV hoặc
huỳnh quang. Các tác nhân hay được sử dụng là phenylisothiocyanate (PITC) và
(dimethylamino)azobenzenesulfonyl

clorid

(DABS-Cl);

6-aminoquinolyl-N-

hydroxysuccinimidyl carbamat (AQC); o-phthalaldehyd (OPA); 9-fluorenylmethyl
cloroformat (FMOC-Cl); tạo sản phẩm được phát hiện bằng detector UV – VIS hoặc
huỳnh quang [3]. Dưới đây là một số phương pháp nghiên cứu phân tích các acid amin và
acid glycyrrhizin.


Cột acquity
Các acid amin

RPLC: tạo dẫn xuất trước cột

Heinrikson,

(gồm glycin,

bằng phenylisothiocyanat

SC Meredith

cystein)

Cột C18
Pha động: amoni acetat và

[28]

acetonitril
3

NV
Komarova

Rơm khô

4 acid amin


phthaldialdehyd
Pha tĩnh: cột Spherisorb ODS

5

6

7

Phát hiện acid

Điện di mao quản

Chen và

glycyrrhizin và

Đệm: acetontril và natri

Shuenn-Jyi

acid

dihydro phosphat nồng độ

Sheu [14]

glycyrrhetinic


Shion-Jane

Thảo dược

Thảo dược

Acid

Sắc ký cặp ion trên cột pha đảo

Groot,

glycyrrhizin và

Cột C18.

Reinder

glycyrrhetic

Gerard De

Dịch sinh học

Koops,
Hogendoorn
[17]
8

Wenyi Yu,

12


CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Amiphargen. Mỗi
ống tiêm 20 ml chứa:
Amoni glycyrrhizat (Glycyrrhizin)

53 mg (40 mg)

Glycin

400 mg

L – cystein HCl.H2O (L – cystein. HCl)

22,3 mg (20 mg)

Natri sulfit

20 mg

Monoethanolamin

12 mg

H2O vừa đủ

20 ml


-

Acetonitril dùng cho HPLC. Công ty sản xuất: Merck – Đức.

-

Acid phosphoric: Sản xuất bởi Scharlau - Tây Ban Nha.

-

Kali dihydro phosphat: Sản xuất bởi Merck – Đức.

-

Nước cất hai lần.

13


2.2.2. Chuẩn bị các dung dịch
-

Dung dịch tá dược: Cân 0,05 g natri sulfit vào bình định mức 50,00 ml, nước cất

vừa đủ thu được dung dịch natri sulfit nồng độ 0,001 g/ml. Hút 0,5 ml monoethanol amin,
hoà tan trong chuẩn natri sulfit và định mức trong bình định mức 10,00 ml, thu được
dung dịch monoethanol amin nồng độ 5% (v/v).
-



10

Nồng độ chuẩn đơn gốc (µg/ml)

2642

1099

19740

Nồng độ chuẩn pha loãng 10 lần trong

264,2

109,9

1974

hỗn hợp (µg/ml)
- Bảo quản điều kiện thường, bọc tối.
- Mẫu placebo: là mẫu chứa 1,00 ml dung dịch monoethanol amin 5% (v/v), 1,00 ml
natri sulfit 0,001 g/ml pha loãng bằng nước và định mức trong bình định mức 10 ml. Lọc
qua màng lọc 0,45 µm.
- Dung dịch mẫu thử: Hút 1,00 ml dung dịch amipharghen vào bình 10,00 ml, định
mức vừa đủ bằng nước. Bọc tối.
- Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi chạy sắc ký.

14


300

1,75

0,0714

300

36

300

2,25

0,1836

600

92

600

2,5

0,1020

300

51


Pipet chính xác 0,5 ml, 1 ml, 1,5 ml, 2 ml, 3 ml; micro pipet 10 – 100 µl (Đức).
Bình định mức 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml.
Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong.

15


2.3. Nội dung nghiên cứu
Xây dựng phương pháp phân tích đồng thời glycin, cystein và amoni glycyrrhizat
trong chế phẩm thuốc tiêm bằng sắc ký lỏng tương tác thân nước (HILIC) không tạo dẫn
xuất.
Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ phù hợp hệ thống, độ chọn lọc, khoảng
nồng độ tuyến tính, độ lặp lại, độ thu hồi theo hướng dẫn của ICH Q2B.
Ứng dụng phương pháp trên phân tích ba thành phần glycin, amoni glycyrrhizat,
cystein trong chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường.
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên các nghiên cứu đã được công bố trên thế giới về phân tích acid amin,
amoni glycyrrhyzat sử dụng HILIC, kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí
nghiệm, tôi cố định hai thông số sắc ký là thể tích tiêm mẫu là 5 µl, pha động gồm hai
thành phần acetonitril và đệm phosphat. Tiến hành nghiên cứu một số thông số trong quá
trình chạy sắc ký.
a. Khảo sát điều kiện pha mẫu
Tiến hành chạy sắc ký, khảo sát sự thay đổi độ ổn định, hình dáng của pic sắc ký.
b. Khảo sát pha động
Từ nguyên tắc quá trình phân tách các chất của HILIC, có thể nhận thấy, kết quả
quá trình phân tách chịu ảnh hưởng rất lớn bởi việc lựa chọn điều kiện pha động. Dựa
trên bài các bài báo tham khảo, tôi tiến hành khảo sát các điều kiện pha động như sau:

16