MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ.................................................................................................................... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN ................................................................................................... 3
1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 3
1.1. Vai trò của vitamin A, vitamin D, vitamin E đối với cơ thể ....................................... 3
1.2. Đặc điểm lý, hóa của vitamin A, D, E ......................................................................... 4
1.2.1. Đặc điểm lý, hóa của vitamin A ............................................................................... 4
1.2.2. Đặc điểm lý, hóa của vitamin D ............................................................................... 5
1.2.3. Đặc điểm lý, hóa của vitamin E................................................................................ 5
2. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 7
2.1. Phương pháp tách chiết vitamin A, D, E ra khỏi mẫu thực phẩm ............................... 7
2.1.1. Xử lý mẫu sơ bộ ....................................................................................................... 7
2.1.2. Tách chiết vitamin ra khỏi nền mẫu ......................................................................... 7
2.2. Một số kỹ thuật định lượng vitamin A, D, E ............................................................. 12
2.2.1. Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) ................................................... 12
2.2.2. Điện di mao quản.................................................................................................... 12
2.2.3. Sắc ký khí (GC) ...................................................................................................... 13
2.2.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ...................................................................................... 13
PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 16

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................................. 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu................................................................................... 16
2.1.2. Phương tiện nghiên cứu ............................................................................... 16


2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 18
2.2.1. Phương pháp phân tích dự kiến .............................................................................. 18
2.2.2. Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký ........................................................................... 18

4.2. Về xử lý mẫu ............................................................................................................. 41
4.3. Về thẩm định phương pháp phân tích ....................................................................... 42
4.4. Kết quả phân tích mẫu thực ....................................................................................... 43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AOAC:

(Association of Official Analytical Chemists) - Hiệp hội các nhà
hóa học phân tích

ACN:

Acetonitril

BHT:

Butylate hydroxytoluenen

EtOH:

Ethanol

GC:



ppm:

(part per million) – phần triệu

RSD:

(Relative standard deviation) – độ lệch chuẩn tương đối

SD:

(Standard deviation) – độ lệch chuẩn

STT:

Số thứ tự

TCVN:

Tiêu chuẩn Việt Nam

THF:

Tetrahydrofuran.

UV-VIS:

(Ultra Violet – Visible) – tử ngoại khả kiến



HPLC................................................................................. .............................35


ĐẶT VẤN ĐỀ
Vitamin là những chất hữu cơ có phân tử lượng thấp, không cung cấp
năng lượng nhưng có vai trò quan trọng trong các quá trình chuyển hóa của cơ
thể, có ảnh hưởng đến sức khỏe và bệnh tật.
Tuy mỗi ngày cơ thể chỉ cần một lượng rất nhỏ tính bằng miligam,
thậm chí microgam, tuy nhiên thiếu hoặc thừa các vitamin trong khẩu phần ăn
gây ra nhiều xáo trộn cho hoạt động hàng ngày của cơ thể thậm chí có thể gây
bệnh. Do vậy vitamin có vai trò quan trọng góp phần duy trì cuộc sống, giúp
cơ thể khỏe mạnh.
Trong công nghiệp thực phẩm, nghiên cứu phát triển các dạng thực
phẩm bổ sung vitamin và các vi chất dinh dưỡng đã trở thành một lĩnh vực
được quan tâm hàng đầu bởi những giá trị thiết yếu của sản phẩm góp phần
đáp ứng nhu cầu của thị trường và hứa hẹn mang lại nhiều lợi nhuận cho các
nhà kinh doanh thực phẩm. Cũng vì lý do đó, lĩnh vực kiểm nghiệm thực
phẩm ngày càng tiếp nhận kiểm nghiệm nhiều loại thực phẩm bổ sung
vitamin nói chung, vitamin tan trong dầu (vitamin A, vitamin D, vitamin E)
nói riêng để đánh giá chất lượng sản phẩm trên thị trường theo yêu cầu của
khách hàng và cơ quan quản lý. Vitamin A, E đều có hàm lượng cao trong
thực phẩm bổ sung, nên hiện nay có một số phương pháp thường qui định
lượng đồng thời hai loại vitamin này; tuy nhiên chưa có phương pháp thường
qui nào phân tích đồng thời cả 3 loại vitamin A, D, E trong thực phẩm vì
vitamin D có hoạt lực mạnh nên chỉ được bổ sung với hàm lượng nhỏ. Nghiên
cứu xây dựng phương pháp chiết tách và định lượng đồng thời các vitamin A,
D, E trong thực phẩm đặc biệt là các thực phẩm có nền mẫu phức tạp như sữa
công thức và thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng giúp tiết kiệm thời gian,
hóa chất phân tích, cho độ chính xác cao, đơn giản, dễ áp dụng trong điều
kiện các phòng thí nghiệm trong nước là một nhu cầu thiết thực. Vì vậy,

hồi phục dần khi đã ngừng thuốc. Ðối với phụ nữ có thai 3 tháng đầu, nếu
dùng quá 10.000 đơn vị vitamin A mỗi ngày kéo dài dễ bị dị dạng thai nhi.
Vitamin D có vai trò rất quan trọng trong quá trình tạo xương nhờ tác
dụng trên chuyển hóa các chất vô cơ mà chủ yếu là calci và phosphat.
Vitamin D cũng giúp điều hòa nồng độ calci trong máu. Khi thiếu vitmin D,
ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm calci máu giảm, khi đó calci bị
huy động từ xương ra để ổn định calci máu nên gây hậu quả là trẻ em chậm
lớn, còi xương, chân vòng kiềng, chậm biết đi, chậm kín thóp. Người lớn sẽ bị
loãng xương, xốp xương, xương thưa dễ gãy. Phụ nữ mang thai thiếu vitamin
D có thể sinh ra trẻ khuyết tật ở xương. Ngoài ra, vitamin D còn tham gia quá
trình biệt hóa tế bào biểu mô và gần đây đang nghiên cứu về tác dụng ức chế
tăng sinh tế bào ung thư như ung thư tuyến tiết melanin, ung thư vú…[8].

3


Nhu cầu vitamin D hàng ngày ở người lớn khoảng 2,5 µg, ở trẻ em khoảng 10
µg.
Vitamin E có tác dụng chống oxy hóa (ngăn cản oxy hóa các thành
phần thiết yếu trong tế bào, ngăn cản tạo thành các sản phẩm oxy hóa độc hại),
bảo vệ màng tế bào khỏi sự tấn công của các gốc tự do, nhờ đó bảo vệ được
tính toàn vẹn của màng tế bào. Khi thiếu vitamin E có thể gặp các triệu
chứng: rối loạn thần kinh, yếu cơ, rung giật nhãn cầu, giảm nhạy cảm về xúc
giác, dễ tổn thương da, dễ vỡ hồng cầu, dễ tổn thương cơ và tim. Đặc biệt trên
cơ quan sinh sản khi thiếu vitamin E thấy tổn thương cơ quan sinh dục, gây
vô sinh [8]. Hàng ngày, người lớn cần khoảng 15 mg, ở trẻ em cần khoảng 7
mg vitamin E. Khi cơ thể thừa vitamin E có thể gặp các tác dụng phụ do
vitamin E thúc đẩy các tổn hại do quá trình ôxy hóa gây ra và khống chế các
tác nhân chống lão hóa khác. Biểu hiện dễ nhận thấy nhất khi dùng vitamin E
quá liều là tiêu chảy, đau bụng, rối loạn tiêu hóa, mệt mỏi, suy nhược...

giữa vitamin D2 và D3 [7].
Đề tài này tập trung nghiên cứu về vitamin D3 (cholecalciferol). Hoạt tính
của 0,025µg vitamin D3 bằng 1 đơn vị quốc tế vitamin D3.
Vitamin D3 là những tinh thể trắng hoặc gần như trắng, dễ biến đổi khi tiếp
xúc với không khí, nhiệt độ và ánh sáng. Trong dung dịch, tùy thuộc vào nhiệt
độ và thời gian mà có thể xẩy ra hiện tượng đồng phân hóa thuận nghịch
thành pre-cholecalciferol. Vitamin D3 dễ tan trong chloroform, ethanol 96%
và ether, tan trong dầu béo; thực tế không tan trong nước. Dung dịch trong
các dung môi bay hơi không vững bền, nên dùng ngay.
1.2.3. Đặc điểm lý hóa của vitamin E
Vitamin E là thuật ngữ chỉ một nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học tương
tự nhau là α, β, γ, δ tocoferol, trong đó α-tocoferol có hoạt tính mạnh nhất.
Hoạt tính của 1 mg α-tocoferol bằng 1 đơn vị vitamin E.
Các vitamin E và ester của chúng là chất lỏng sánh như dầu, màu vàng
sáng, hầu như không mùi, không vị; không tan trong nước, tan trong ethanol,

5


các dung môi hữu cơ và các dầu béo (riêng dạng muối succinat là bột màu
trắng). Do trong phân tử có các carbon bất đối nên vitamin E có các đồng
phân quang học. Các đồng phân hữu truyền (dạng D) thường có hoạt tính
mạnh hơn các đồng phân tả truyền (dạng L). Các tocoferol trong tự nhiên ở
dạng D, loại tổng hợp dạng racemic. Các vitamin E dễ bị oxy hóa với các tác
nhân: tia tử ngoại, chất béo đã bị ôi, một số kim loại nặng và môi trường kiềm.
Vì vậy, cần phải bảo quản vitamin E trong chai lọ kín, đổ đầy, thủy tinh màu
vàng, để chỗ nhiệt độ thấp, tránh sánh sáng [3], [4].
Vitamin E tự nhiên tồn tại dưới 8 dạng khác nhau, trong đó có 4 tocoferol
và 4 tocotrienol. Các tocoferol và tocotrienol đều có dạng α, β, γ, δ; mỗi dạng
có hoạt tính sinh học khác nhau chút ít. Dạng α-tocoferol có công thức phân

- Mẫu thực phẩm thực phẩm bổ sung dạng viên nén được nghiền, trộn kỹ;
dạng viên nang được chọn ngẫu nhiên; dạng siro, dạng lỏng được lắc đều trước
khi cân.
2.1.2. Tách chiết vitamin ra khỏi nền mẫu
Tỷ lệ chất béo trong các thực phẩm chứa vitamin tan trong dầu chủ yếu
gồm các triglycerid, một lượng rất ít các sterol, carotenoid, phospholipid và
một lượng nhỏ các thành phần gần giống mỡ. Tất cả các chất này ức chế khả
năng hòa tan của các loại vitamin tan trong dầu. Một phần các vitamin này
liên kết với phức hợp lipoprotein do đó cần phải phá vỡ liên kết để giải phóng
vitamin ra khỏi các phức hợp. Như vậy cần có phương pháp chiết tách phù
hợp để chiết các vitamin ra khỏi nền mẫu trước khi tiến hành định lượng [35].
Có một số phương pháp chiết vitamin tan trong dầu ra khỏi nền mẫu thực
phẩm như: xà phòng hóa, chiết bằng cồn, sử dụng enzym, chiết bằng dung
môi hữu cơ, chiết bằng dung môi siêu tới hạn [28,41,45,38,57,].
* Xà phòng hóa
Xà phòng hóa là cách truyền thống để giải phóng các vitamin trong các
nền mẫu phức tạp sau đó chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ.
Một phần các vitamin tan trong dầu trong thực phẩm tồn tại ở dạng liên
kết với các phức hợp lipoprotein, và do đó cần phá vỡ các liên kết protein chất béo để giải phóng các vitamin này. Xà phòng hóa thường được sử dụng
để giải phóng các liên kết hoặc phá vỡ dạng ester của vitamin A, D, E [23].

7


Quá trình xà phòng hóa được tiến hành trong môi trường kiềm mạnh; điều
này giúp giảm sự có mặt của các chất khác trong nền mẫu hòa tan vào dung
môi hữu cơ trong quá trình chiết sau này. Quá trình xà phòng hóa được tiến
hành bằng cách thêm dung dịch NaOH hoặc KOH ở nhiệt độ môi trường hoặc
nhiệt độ cao với sự có mặt của chất chống oxy hóa và môi trường khí trơ.
Ngay sau quá trình xà phòng hóa luôn luôn là quá trình chiết bằng dung môi

mỡ [53, 47]. Phương pháp chiết lỏng siêu tới hạn có ưu điểm nhanh, hạn chế
công sức, tốn ít dung môi nhưng chi phí trang bị đắt, hầu hết các phòng kiểm
nghiệm thực phẩm tại Việt Nam chưa ứng dụng được kỹ thuật này.
* Chiết pha rắn
Chiết pha rắn là phương pháp chiết dựa vào sự phân bố của chất phân
tích giữa hai pha lỏng và rắn. Pha rắn thường là các hạt nhỏ, xốp được nhồi
vào các ống nhỏ. Pha lỏng chảy qua ống, các chất phân tích tương tác với pha
rắn sẽ được giữ lại trên ống. Các chất này được rửa giải khỏi pha rắn bằng
một dung môi khác phù hợp. Thông thường thể tích dung môi rửa giải nhỏ
hơn nhiều so với thể tích dung dịch mẫu. Kỹ thuật này tiến hành khá nhanh,
độ thu hồi tốt, tốn ít dung môi hơn so với chiết lỏng – lỏng. Trong nhiều
nghiên cứu trước, các tác giả đã ứng dụng được kỹ thuật chiết pha rắn trong
phân tích vitamin D và các dạng chuyển hóa của nó trong máu, dịch cơ thể,
thức ăn chăn nuôi [41, 50, 58].
Bảng 1.1. Tóm tắt một số phương pháp xử lý mẫu phân tích vitamin A, D3, E
trong thực phẩm và thuốc
Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

A

D

X
Dược điển Việt
Nam IV [6]
X

KOH/ nước. Chiết bằng dung môi nhexan + methylen chloride (3:1).


Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

A

AOAC 995.05
[13]

D

X

X

TCVN 8973 :
2011 (EN
12821 : 2009)
[3]

Dạng bào chế/ nền
mẫu

Sản phẩm công
thức và hỗ trợ tiêu


X

X

Cao Công
Khánh (2010)
[8]

X

X

Nhiều loại thực
phẩm (bơ, dầu, mỡ,
margarin, các loại
thực phẩm khác)
Nước uống dinh
dưỡng
Sữa (bột, lỏng)

Dược điển Mỹ
36 [55]

X

X

X



Xà phòng hóa mẫu, chiết bằng dung
môi n-hexan, sau đó làm bay hơi
dung môi, rồi sử dụng chiết pha rắn,
dịch chiết đem định lượng.
Xà phòng hóa bằng KOH/ nước,
chiết bằng n-hexan : methylen
chlorid (3:1)
Xà phòng hóa bằng KOH/ ethanol +
chất chống oxy hóa acid ascorbic sau
đó chiết bằng dầu nhẹ/ n-hexan/
diethyl ether
Xà phòng hóa bằng KOH/Ethanol +
chất chống oxy hóa, sau đó chiết
bằng dung môi hữu cơ, làm sạch
bằng sắc ký lỏng bán điều chế, sắc
ký bản mỏng
Xà phòng hóa bằng KOH/ethanol
(hoặc methanol) + chất chống oxy
hóa, sau đó chiết bằng n-hexan
Hòa tan mẫu trong pha động A
(dung dịch acid formic 0.015%)
Xà phòng hóa bằng KOH/EtOH sau
đó chiết bằng dung môi n-henxan.
Phương pháp 1: Chiết trực tiếp bằng
dung môi n-hexan +
dimethylsulfoxide
Phương pháp 2: Xà phòng hóa bằng
KOH/ pyrogallol, chiết bằng dung
môi n-hexan + methylene chloride

pháp này phù hợp với việc chiết tách vitamin A, D, E, loại trừ chất béo và
lipid hiệu quả, chi phí thấp. Hơn nữa, nếu như trong các chế phẩm thuốc,
dạng tồn tại của các loại vitamin đã biết trước thì trong sữa công thức sử dụng
nguyên liệu từ tự nhiên nên các vitamin tồn tại ở nhiều dạng khác nhau; trong
thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng các vitamin A, E thường tồn tại ở dạng
ester để hạn chế sự oxy hóa. Ở khía cạnh đánh giá mức độ dinh dưỡng chỉ
quan tâm đến hoạt lực tổng của từng loại vitamin, do đó, phương pháp xà
phòng hóa không chỉ giúp giải phóng các vitamin ra khỏi liên kết với các
thành phần khác trong thực phẩm mà còn giúp chuyển vitamin từ dạng ester

11


sang dạng ancol, giúp tiết kiệm chi phí sử dụng chuẩn làm việc trong quá
trình phân tích, thuận tiện trong quá trình tính toán kết quả. Tuy nhiên, việc
bổ sung thêm enzym trong quá trình xà phòng hóa vừa giúp phá vỡ các liên
kết ester, vừa phá vỡ các liên kết peptid trong nền mẫu, do đó quá trình chiết
vitamin tiếp theo bằng dung môi diễn ra thuận lợi hơn [41, 54].
Các sterol, carotenoid, vitamin tan trong dầu không bị xà phòng hóa
nên được chiết ra khỏi hỗn hợp sau khi thủy phân bằng dung môi hữu cơ, sử
dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng, tiến hành chiết lặp lại nhiều lần để chuyển tối
đa lượng vitamin có trong mẫu phân tích sang pha dung môi hữu cơ. Quá
trình chiết thực hiện trong các dụng cụ thủy tinh tối màu, loại khí oxy bằng
cách sục nitơ, thêm chất chống oxy hóa để hạn chế tối đa các vitamin bị oxy
hóa. Dịch chiết được đem cất quay chân không để bay hơi dung môi. Quá
trình cất cần tiến hành trong bình cất quay luôn được làm đầy bởi dung môi
cất quay hoặc sục khí nitơ để hạn chế tối đa sự oxy hóa [48]. Cắn được hòa
tan bằng dung môi pha động với thể tích thích hợp để tiến hành chạy HPLC.
2.2. Một số kỹ thuật định lƣợng vitamin A, D, E
2.2.1. Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-VIS)

HPLC có một lợi thế quan trọng hơn so với GC và các kỹ thuật sắc ký
khác khi phân tích vitamin trong thực phẩm nói chung, vì HPLC có thể phát
hiện khá chọn lọc các loại vitamin, quá trình xử lý mẫu không quá phức tạp, ít
khi cần dẫn xuất hóa. Với lý do trên, để xác định các vitamin tan trong dầu
nói chung với một độ chính xác và độ lặp lại chấp nhận được thì HPLC là một
phương pháp được lựa chọn hiện nay [1,2,10-18].
Bảng 1.2. Một số điều kiện sắc ký lỏng phân tích vitamin A, D, E ở Việt Nam
và trên thế giới
Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu
Dược điển Việt
Nam IV [6]

A

D

X
X

E

Dạng bào chế/
nền mẫu

Điều kiện sắc ký


AOAC 992.03
[11]

X

X

TCVN 8973 :
2011 (EN 12821 :
2009) [3]

X

TCVN 8276 :
2010 (EN 12822 :
2000) [1]

X

Dionex (2009)
[31]

X

X

Cao Công Khánh
(2010) [8]

X

Sữa công thức
cho trẻ

X

AOAC 995.05
[13]

TCVN 89721:2011 (EN
12823-1 :2000)
[2]

E

X

X

Sản phẩm công
thức và hỗ trợ
tiêu hóa cho trẻ
nhỏ
Sữa công thức
cho trẻ

Thực phẩm

Pha động n-hexan : n-butanol (98: 2), tốc
độ dòng 2ml/ phút, cột pha thuận, thể tích
bơm 50µl.

trong 16,9 phút, từ 0  100% kênh A
trong 5 phút cuối cùng.
Pha động MeOH : nước theo gradient,
cột sắc ký pha đảo C18, tốc độ dòng 1ml/
phút, nhiệt độ cột 40ºC.
Pha động: n-hexan; cột 4,6mm*15mm,
hạt nhồi 3µm L8; tốc độ dòng 1ml/ phút,
detector UV 325nm.
Pha động: n-hexan + isopropyl alcohol
(99+1); cột 4,6mm*15mm, hạt nhồi 3µm
L8; tốc độ dòng 1ml/ phút, detector UV


Phƣơng pháp
tiêu chuẩn/ bài
báo khoa học/
công trình
nghiên cứu

A

D

E

Dạng bào chế/
nền mẫu

Semahat K., Onur
B., Huseyin K.

UV 291nm, nhiệt độ cột 40ºC.
4 phút đầu pha động TFA:MeOH (95:5),
6 phút sau giảm dần TFA và duy trì đến
20 phút tỷ lệ TFA:MeOH (5:95), cuối
cùng lại tăng dần TFA đến tỷ lệ
TFA:MeOH (95:5).
Pha động MeOH:nước (98:2), Cột C18
15cm*4,6cm, cỡ hạt 5µm, tốc độ dòng
1ml/ phút, thể tích tiêm 10µl, nhiệt độ cột
35ºC.

Từ bảng tóm tắt trên cho thấy, sắc ký lỏng hiệu năng cao là một
phương pháp rất phổ biến để định lượng các vitamin tan trong dầu, tuy nhiên
một số phương pháp phân tích thường qui hướng dẫn phân tích độc lập
vitamin A, D, E thì lại sử dụng cột sắc ký pha thuận, dung môi pha động là
các dung môi không phân cực như n-hexan, isooctan, có thể bổ sung thêm
butanol, diethylether [1, 2, 13, 15, 17].... Nhược điểm của phương pháp này là
dung môi độc hại, độ lặp lại của hệ thống khi sử dụng cột pha thuận thường
kém hơn pha đảo, thời gian lưu thường không ổn định.
Do đó, đề tài đã nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu bằng kỹ thuật xà
phòng hóa có bổ sung enzym, chiết tách vitamin bằng dung môi hữu cơ và tối
ưu hóa thông số sắc ký giúp định lượng đồng thời 3 loại vitamin A, vitamin D,
vitamin E trong thực phẩm bằng HPLC, sử dụng cột phân tích pha đảo.

15


PHẦN 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng và phƣơng tiện nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu

- Petroleum ether 30:60 (PA, Trung Quốc).
- Ethanol (EtOH, PA, Trung Quốc).
- Butyl Hydroxy Toluen (BHT, PA, Trung Quốc).
- Kali hydroxid (KOH), (PA, Trung Quốc).
- Enzym alkaline protease > 500 U/g (PA, Sigma, Mỹ).
* Pha các dung dịch chuẩn
- Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác 20 mg chất chuẩn vitamin A, 25 mg
chất chuẩn vitamin D, 500mg chất chuẩn vitamin E bằng cân phân tích hoà
tan và chuyển vào 03 bình định mức 100ml, định mức bằng methanol ở nhiệt
độ phòng, lắc kỹ được các dung dịch chuẩn gốc vitamin A 200 ppm, vitamin
D 250 ppm, vitamin E 5000ppm.
Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 4ºC, sử dụng ổn định được trong
6 tháng, kiểm tra lại nồng độ khi cần thiết.
- Dung dịch chuẩn trung gian: Lấy chính xác 1 ml mỗi loại dung dịch chuẩn
gốc vitamin A, D, E bằng pipet vào trong bình định mức 5ml, định mức tới
vạch bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc đều hỗn hợp, pha mới dung dịch
này hàng ngày.
- Dung dịch chuẩn làm việc: Từ các dung dịch chuẩn trung gian, tiến hành
pha loãng vào các bình định mức sao cho được dãy chuẩn dung dịch vitamin
A, D, E có nồng độ loãng 20; 50; 100; 500; 1000, 4000 lần so với các dung
dịch chuẩn gốc.

17


2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân tích dự kiến [11-16]
Dựa trên những phân tích trong phần Tổng quan ở trên, chúng tôi dự
kiến xây dựng phương pháp phân tích đồng thời vitamin A, vitamin D,
vitamin E trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

được với các chất khác trong mẫu phân tích. Xác định tính chọn lọc bằng cách
phân tích các mẫu trắng, mẫu trắng có thêm chất chuẩn, mẫu thử thêm chuẩn.
Với mẫu trắng phải không được cho tín hiệu phân tích. So sánh sắc ký đồ của
các mẫu để đánh giá tính chọn lọc dựa theo các tiêu chí: sự khác biệt thời gian
lưu của chất phân tích giữa mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn không có ý
nghĩa thống kê, so sánh phổ tại các điểm khác nhau trên pic sắc ký (đỉnh pic,
2 điểm tại 2/3 độ rộng của pic) để xác định độ tinh khiết của pic. Độ tinh khiết
pic được tính toán bằng phần mềm tích hợp sẵn với thiết bị HPLC.
2.2.4.2. Khoảng tuyến tính
Xây dựng đường chuẩn tuyến tính bằng cách chạy dãy dung dịch chuẩn
có nồng độ khác nhau pha từ chuẩn gốc và chuẩn trung gian cho phù hợp để
xác định khoảng nồng độ của chất phân tích trong đó có sự phụ thuộc tuyến
tính giữa tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích pic chất chuẩn với nồng
độ của chất đó.
Phương trình hồi quy tuyến tính y = ax + b
Trong đó : y là tỷ lệ diện tích pic chất phân tích/diện tích chất chuẩn
x là nồng độ chất khảo sát
Đường chuẩn xây dựng được phải có hệ số tương quan R ≥ 0,995, và
độ chệch thỏa mãn.
2.2.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)
- Giới hạn phát hiện LOD (Limit of detection) là nồng độ thấp nhất của chất
phân tích có thể phát hiện được trong điều kiện thí nghiệm cụ thể. Trong sắc
19