Xây dựng phương pháp định tính, định
lượng gentiopicrin trong Kem VIEMDA
AD bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tạ Văn Bình\ Lê Thị Hải Yến\ Ma Thị Hổng Nga\ Nguyễn Thị Quỳnh^ Nguyễn Thị Kiểu Anh^

^Trường Cao đẳng YHà Nội, ^Trường Đại học Dược Hà Nội

SUMMARY
The aim of this work is to develop ơn analysis of gentiopicrin in VIEMDA AD cream by high performance lipid chromatography.
The analysis process was conducted on on Inertsil Cl 8 column (250 mm X 4.6 mm, 5 ụm). The mobile phase of methanol: water (35:65,
v/v) was pumped at the flow rate of 1ml/min. Gentiopicrin was identified by UV-DAD detector at wavelength of270 nm. The obtained
results showed that linear range, overage recovery and precision were 0.10- 0.30 mg/ml, 100.70% and 2.07% (n = 12), respectively.
Consequently, this HPLC method was good linear, repeotobility and precision. This validated method is appropriate to quantity
gentiopicrin in VIEMDA AD creom.
Từkhoá: Kern VIEMDA AD, long đởm, gentiopicrin, HPLC

Đặt vấn đề

Viêm da cơ địa (còn gọi là chàm thể tạng - Atopic
dermatitis - AD) là một dạng viêm da mạn tính, bệnh
thường xuất hiện ở trẻ em nhưng có thể kéo dài đến
tuổi trưởng thành, ngoài ra bệnh còn gặp ở người
lớn [6], Theo nghiên cứu của Christina M Gelbard và
Adelaide A Hebert [4] bệnh viêm da cơ địa là bệnh
mãn tính ảnh hưởng đến 10 - 20% trẻ em và 1 - 3%
người lớn ở Mỹ. Các triệu chứng của bệnh thường
dẫn đến mất ngủ, tâm lý căng thẳng, lo lắng... gây
ảnh hưởng xấu tới công việc và học tập. Tại Việt Nam,
theo báo cáo của Viện Da liễu Trung ương, mỗi ngày
khoa khám bệnh tiếp nhận từ 400 - 600 người mắc
bệnh về da, trong đó bệnh do viêm da cơ địa (sẩn

HPLC hoặc PA (Merck - Đức).
Thiết bị
Hệ thổng HPLC - detector u v - DAD Agilent
Technologies 1260 Infinitive, Mỹ với phẩn mềm
Aligent Chemstation version B.
Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ (d = 0,01
mg); Máy siêu âm Ronorex RK 106, Đức; Máy lắc
xoáy Labinco L46, Hà Lan; Máy ly tâm lạnh Sartorius
sigma 2- 16K,Đức;Tủ lạnh Sanyo, Nhật; Nồi cách thủy
WiseCircu',Tây Ban Nha.
Các dụng cụ thủy tinh chính xác.


4

Phương pháp nghỉên cứu
-Điều kiện sắc ký:
+ Cột: Inertsil c^g(5 |am, 250 mm x4,6 mm)
+ Pha động: Methanol - nước (35:65)
+ Detector: u v 270 nm.
+Thể tích tiêm mẫu: 10 |jl
+ Tốc độ dòng: 1 ,0 ml/ phút
+ Nồng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu
tiêm: khoảng 0,2 mg/ml
- Chuẩn bị các dung dịch:
+ Dung dịch chuẩn gốc: cân chính xác một lượng
chất chuẩn tương đương khoảng 10 mg gentiopicrin
cho vào bình định mức 10 ml, hòa tan trong vừa đủ
thể tích bằng methanol. Bảo quản trong lọ thủy tỉnh
kín ở 2 - 8° c dùng trong vòng 1 tháng.

công bố [3 ,5 , 8], tiến hành khảo sát và lựa chọn điểu
kiện phân tích phù hợp và khả thi.
- Sử dụng cột sắc ký Inertsil ODS-3 (250 X 4,6 mm,
5 pm) trong nghiên cứu.
-Thực hiện sắc ký gentiopicrin (dung dịch chuẩn)
với các hệ pha động methanol - nước với tỷ lệ thay
đổi, của methanol 25 - 40%, nước 75 - 60% (AC = 5%),
tốc độ dòng 1,4 ml/ phút. Kết quả cho thấy khi nồng
độ methanol tăng thời gian lưu của pỉc gentiopicrin
giảm nhưng áp suất cột táng nhanh (hình 1 và 2 ). ở
tỷ lệ methanol 35%, nước 65% thời gian lưu khoảng 6
phút và áp suất khoảng 220 bar. Để áp suất làm việc
của hệ thống không quá cao (< 200 bar), tiến hành
giảm tốc độ dòng pha động từ 1,4 ml/ phút tới 1,0
ml/phút (AV = 0,1 ml) thì thấy rằng tại tốc độ dòng
pha động là 1 ml/phútvớitỷlệphađộng như trên thì
áp suất cột khoảng 170 bar và thời gian lưu của pic
gentiopicrin khoảng 8 phút. Đổng thời, thể tích tiêm
mẫu nhỏ (10 |jl) được thực hiện nhằm hạn chế doãng
pic và giảm thiểu mức độ gây bẩn cột khi sắc ký đối
với mẫu thử là dạng cream và có nguồn gốc dược liệu.
250

225
Xì

200

150
20

.a
.2

12

It
Dí) C '

•I

I

20

25

30

35

40

45

Nồng độ M eO H (%)

Hình 2. Ảnh hưởng củũ tỷ lệ thònỉì phân phũ động tới thời giQíì lưu CỦQgentiopiơin


Bước sóng phát hiện được lựa chọn là bước

khoảng 7 - 1 0 phút. Như vậy phương pháp có tính
chọn lọc cao.
Tính thích hợp của hệ thống
Được xác định dựa vào độ lệch chuẩn tương đối
(RSD) của diện tích pic và thời gian lưu của gentiopicrin
khi sắc ký 6 lẩn liên tiếp dung dịch chuẩn gentiopicrin
nồng độ 0,2 mg/ml. Kết quả cho thấy RSD của diện
tích pic và thời gian lưu của pic gentiopỉcrin lẩn lượt
là 0,18% và 0,23% (n = 6) đểu thấp hơn 2,0% do đó
hệ thống sắc ký phù hợp để định lượng gentiopicrin.
Khoảng nổng độ tuyến tính
Của phương pháp được xác định dựa trên mối
tương quan hồi quy giữa nồng độ và diện tích pic của
gentỉopicrin trong khoảng nồng độ khảo sát 0,10 0,30 mg/ml. Kết quả được trình bày ở bảng 1 .

•bÁÒVo-S;;;ã>Ò4Ri«^(AHffeSÚWAtk'.YÂÌN
mAU

120
100

10

mAU

ĩ
1

80



12

14 min

12

14

min


Bỏng I Kết quỏ khỏo sát khoỏng nống độ tuyến tính
Nồng độ gentiopicrin (mg/ml)

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Diện tích pic (mAU. giây)

1123,6

1912,5

(mAU.s)

Hàmlượng
gentiopicrin (%)

1

0,5100

2507,0

0,386

1

0,5030

2437,6

0,380

2

0,5096

2534,3

0,390

2


4

0,5011

2439,3

0,382

5

0,5038

2417,3

0,376

5

0,5053

2548,3

0,396

6

0,5083

2400,9


Hàmlượng trung bình gentiopicrin với n = 12 là: 0,383%
RSDvớin = 12là:2,07%

Độ đúng
Được xác định theo phương pháp thêm chuẩn bằng cách thêm một lượng chính xác chuẩn gentiopicrin
vào mẫu thử (khối lượng 0,50 g) ở 3 mức lần lượt là 0,2 mg; 0,4 mg và 0,6 mg (thêm 1,00 ml; 2,00 ml và 3,00 ml
dung dịch gentiopicrin chuẩn có nồng độ 0,2 mg/nnl) tương ứng lượng gentiopicrin thêm vào là khoảng 10 %;
20% và 30% lượng hoạt chất có trong mẫu thử. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký. Kết quả được trình bày ở bảng 3.
Bỏng 3. Két quở khâo sớt độ đúng (n=3)
Mức thêm

Lượng gentiopiain thêm vào
(mg)

Lượng gentiopicrin tìm lại được
(mg)

Tỷ lệ thu hổi (%)

RSD%

10%

0,20

0,1975

98,8


sản phẩm. Dược điển Việt Nam IV [1], trong chuyên
luận "Long đởm" mới chỉ để cập tới phương pháp
định tính Long đởm dựa vào chuẩn là dược liệu chuẩn
bằng sắc ký lớp mỏng và hóa học Các nghiên cứu xác
định (định tính, định lượng) gentiopicrin trong dược
liệu thường được thực hiện bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao [3,5 , 8].
Định tính, định lượng gentiopicrỉn trong Kem
VIEMDA AD - chế phẩm bào chế từ dược liệu Long
đởm - được thực hiện bằng phương pháp HPLC cho
phép tách hoạt chất ra khỏi nển mẫu phức tạp (tá
dược thuốc cream, thành phần khác trong dược liệu
Long đởm), định tính dựa vào thời gian lưu của pic
gentiopicrin trong sắc ký đổ của dung dịch chuẩn bị
từ mẫu chế phẩm và dung dịch chuẩn gentiopicrin;
định lượng theo phương pháp chuẩn ngoại chuẩn
hóa một điểm dựa trên so sánh diện tích pic của
gentỉopicrỉn trong dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn,
nổng độ gentiopicrin trong dung dịch mẫu chuẩn và
lượng mẫu thử đem định lượng. Quá trình tách, định
tính, định lượng hoạt chất được thực hiện đổng thời
trong cùng một phép phân tích nên phương pháp
được thực hiện nhanh, có tính kinh tế với độ chính
xác cao.
Phương pháp định tính, định lượng gentỉopicrin
trong chế phẩm xây dựng được đơn giản chỉ cán sử
dụng thiết bị HPLC detector uv là loại detector phổ
biến trong các phòng phân tích. Phương pháp có tính
chọn lọc cao (pic gentiopicrin tách khỏi các pic cản
trở, cân đối với thời gian lưu khoảng 8,10 phút), chính

là cơ sở để hoàn thiện Tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế
phẩm trong hổ sơ xin đăng ký sản phẩm nhằm sớm
đưa thuốc ra thị trường phục vụ cộng đổng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Bộ Y tế (2009), DƯỢC điển Việt Nam IV, tr. 812-813.

2.

Lê Hữu Doanh (2009), Tinh hình viêm da cơ địa tại viện Da liễu Quốc gia từ 1995 đến 2005, Tạp chíYhọc thực hành, (12).

3.

Chinese Pharmacopoeia Commission (2010), Pharmacopoeia of the People's Republic of China, pp. 204-205.

4.

Christina M Gelbard, Adelaide A Hebert (2008). Patient Preference and Adherence, Vol.2, p 387-392.

5.

Huang z, Lin s. (2005), Determination gentiopicrin in biyanqingdugmnuloe by SPE-HPLC, Zhong Yoo Col, 28(6), pp. 507-8.

6.

Donald Y.M. Leung, Mark Boguniewicz, Michael D. Howell, Ichiro Nomura, and Qutayba A. Hamid (2004), The Journal of Clinical
Investigation, Vol 113(5), pp. 651-657.