1

MỞ ĐẦU
Virus cúm thể độc lực cao (Highly pathogenic avian influenza - HPAI)
H5N1 thuộc type A, họ Orthomyxoviridae, là chủng có khả năng gây tử vong cao
trên 50% gia cầm bị nhiễm. Dịch cúm gia cầm H5N1 đã xuất hiện ở nhiều quốc gia
châu Á, châu Âu, châu Phi và đang thực sự là mối đe dọa nghiêm trọng đối với toàn
cầu. Từ khi dịch cúm gia cầm H5N1 xuất hiện tới nay, thế giới đã có hơn 250 triệu
gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho ngành chăn nuôi. Đặc biệt,
không chỉ gây bệnh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn có khả năng lây truyền từ
gia cầm sang người. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế gới, từ tháng 01/2003 đến
tháng 12/2016 đã có 856 trường hợp mắc cúm A/H5N1, trong đó 452 trường hợp tử
vong, chiếm 52,8% (www.wpro.who.int/emerging_diseases/AvianInfluenza/en).
Với độc lực mạnh, khả năng đột biến lớn, số lượng các vật chủ không ngừng tăng
lên, virus H5N1 trở thành mối đe dọa về một đại dịch xảy ra trên toàn cầu. Do đó,
việc nghiên cứu tìm ra biện pháp dự phòng và điều trị virus cúm A/H5N1 là vô
cùng cấp bách.
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các
tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước
chỉ trong một thời gian ngắn, hàng triệu gia cầm bị chết và tiêu hủy gây thiệt hại rất
lớn về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi. Sử dụng vắc xin cho gia cầm được xem là
một trong những biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn sự lan truyền của virus cúm
và giảm thiểu những thiệt hại do virus cúm gây ra đối với ngành chăn nuôi. Hai loại
vắc xin thương mại đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới để tiêm phòng cho gia
cầm là vắc xin bất hoạt và vắc xin sống nhược độc sử dụng vector virus làm dẫn
truyền. Cúm A/H5N1 vẫn là vấn đề có tính thời sự ở Việt Nam, tuy vắc xin phòng
cúm A/H5N1 đã được ứng dụng hơn 10 năm, nhưng hằng năm dịch bệnh vẫn xảy ra
và hiện nay có nguy cơ các phân type mới (H5N6, H5N2, H7N9) xâm nhập. Virus
cúm gia cầm biến đổi liên tục tạo nên những clade mới nên việc tiếp tục nghiên cứu
để có được công nghệ sản xuất vắc xin hiệu quả hơn, dễ tự động hóa hơn, cho phép


Nghiên cứu cải biến mã bộ ba và biểu hiện kháng nguyên HA1 trong nấm
men P. pastoris.

-

Nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên HA dưới dạng dung hợp trx không có
trình tự cắt của enterokinase và thrombin.

(3) Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố lên quá trình biểu hiện protein HA tái
tổ hợp; lên men và thu hồi protein HA tái tổ hợp.
(4) Đánh giá tính sinh miễn dịch trên gà của protein HA tái tổ hợp.


3

Đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình mới ở Việt Nam nghiên cứu biểu hiện kháng nguyên
HA tái tổ hợp của virus cúm A/H5N1 trong E. coli và nấm men P. pastoris, làm cơ
sở để tạo vắc xin phòng cúm A/H5N1. Từ các cấu trúc thiết kế biểu hiện gen khác
nhau, với nhiều chủng biểu hiện và điều kiện biểu hiện khác nhau chúng tôi đã
chọn được chủng nấm men P. pastoris SMD1168 biểu hiện TrxHA1. Sản lượng
HA được tổng hợp trong nồi lên men đạt 84 mg/l. Hiệu giá HI trung bình huyết
thanh gà sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc lại với 100 g TrxHA1 tái tổ hợp qua
đường tiêm dưới da cổ đạt 7-7,2 log2, hiệu giá HI sau 2 tuần gây miễn dịch nhắc
lại bằng đường nhỏ mắt mũi đạt 6,6 - 7,0 log2. Hiệu giá HI huyết thanh gà gây
miễn dịch với protein HA tái tổ hợp tương đương với hiệu giá HI huyết thanh gà
tiêm vắc xin bất hoạt Re-1.


4

nucleoprotein (NP) - thành phần của phức hệ phiên mã, chịu trách nhiệm vận
chuyển RNA giữa nhân và bào tương tế bào chủ. Phân đoạn M mã hóa cho protein
đệm - matrix protein của virus gồm hai tiểu phần M1 và M2 được tạo ra bởi những
khung đọc mở khác nhau của cùng một phân đoạn RNA. Protein M1 là một protein
nền, thành phần chính của virus có chức năng bao bọc RNA tạo nên phức hợp
ribonucleoprotein và tham gia vào quá trình “nảy chồi” của virus. Protein M2 là
chuỗi polypeptide ngắn, có khối lượng phân tử khoảng 11 kDa, protein M2 đâm
xuyên và nhô ra khỏi vỏ ngoài, chịu trách nhiệm tháo vỏ virus giải phóng hệ gen
virus vào bào tương tế bào chủ trong quá trình xâm nhiễm (Palese, 2007; Bouvier,
2008; Neumann, 2009).
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra 18 loại kháng nguyên HA (H1H18) và 11 loại kháng nguyên NA (N1-N11) (Tong, 2013). Trong lịch sử ghi nhận
chỉ phân type H1, H2, H3 và N1, N2 gây bệnh cho người. Gần đây phân type H5, H7,
H9 cũng gây bệnh cho người với mức độ nguy hiểm hơn (Li, 2015; Bui, 2016). Bệnh
dịch do chủng H5N1 gây ra có khả năng lây lan rất cao ở các động vật lông vũ, gây
chết hàng loạt ở chim và gia cầm (Webster, 2002; Schrauwen, 2014; Webster, 2014).
1.1.2. Chu trình tái bản của virus cúm A
Quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu
mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể vật chủ (Nicholson, 2003; Palese,
2007; Neumann, 2009; de Graaf, 2014). Các giai đoạn của quá trình xâm nhiễm như
sau (Hình 1.2):
Giai đoạn 1 - giai đoạn hấp phụ: các hạt virus gắn với tế bào chủ thông qua
liên kết giữa các phân tử HA với các thụ thể có chứa nhóm sialic acid trên bề mặt tế
bào chủ. Virus cúm gia cầm gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-3 galactose
(SAα2-3Gal) còn virus cúm người gắn đặc hiệu với thụ thể sialic acid α 2-6
galactose (SAα2-6Gal) (de Graaf, 2014). Do có tính đặc hiệu với thụ thể nên virus
cúm gia cầm không thể dễ dàng lây nhiễm sang người và ngược lại, hình thành rào
cản loài, thu hẹp khả năng lây nhiễm của virus trên một hoặc một số vật chủ nhất


6

endosome và giải phóng các phức hợp RNP vào trong bào tương tế bào.
Giai đoạn 4 - tổng hợp RNA và protein virus: Phức hợp RNP được vận
chuyển vào nhân tế bào để phiên mã tạo mRNA. Phân tử mRNA được phiên mã
trong nhân từ các chuỗi RNA sợi đơn (-) của virus khi sử dụng mồi là đoạn 10-13
nucleotide cắt ra từ đầu 5’ của mRNA có gắn mũ của vật chủ, sau đó được gắn đuôi
polyA cũng lấy từ mRNA của tế bào chủ. Enzyme cắt mồi là endonuclease do virus
mang theo. mRNA mới hoàn thiện của virus ra khỏi nhân, vào bào tương để tiến
hành tổng hợp protein. Kết quả của quá trình phiên mã từ 8 đoạn RNA hệ gen tạo ra
được 15 phân tử protein.
Trong nhân tế bào, các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ
khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ
gen của virus mới nhờ RNA - polymerase. Các sợi này không được adenine hóa
(gắn thêm các adenine) và gắn mũ ở đầu 5’ và 3’, chúng kết hợp với nucleoprotein
(NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein hoàn chỉnh và được vận chuyển ra tế
bào chất. Đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra
trong tế bào chất của vật chủ). Các protein PB1, PB2, PA, NP của virus sau khi
được tổng hợp sẽ được đưa vào nhân tế bào và kết hợp với RNA virus hình thành
các phức hợp RNP, sau đó các phức hợp lại được đưa trở lại bào tương. Các protein
khác (HA, NA, và M2) được glycosyl hóa ở mạng lưới nội chất và phức hệ Golgi
của tế bào.
Giai đoạn 5 - lắp ráp và giải phóng virus khỏi tế bào: sau khi trải qua cải
biến sau dịch mã, các protein HA, NA và M2 được đưa đến màng tế bào chủ và gắn
với lớp lipid kép. Khi mật độ các protein màng đủ lớn thì các phức hợp RNP và
protein M2 cũng tập hợp lại trên màng tế bào. Sau khi cả 8 phân đoạn RNA của hệ


8

gen và các thành phần khác được tập hợp đầy đủ thì các phức hợp RNP, protein vỏ
virus và protein nền M1 được lắp ráp lại với nhau để hình thành các hạt virus thế hệ

phần xuyên màng và peptit dung hợp màng. Cấu trúc bậc hai của HA2 là các đoạn
xoắn  kết hợp với nhau tạo thành vùng dạng sợi, gắn với vỏ virus. Cấu trúc HA0
được bền vững nhờ cầu nối disulfide giữa tiểu phần HA1 và HA2. Protein HA được
tổng hợp dưới dạng polypeptide HA0 ở mạng lưới nội chất, tại đây chúng tập hợp
lại thành dạng trimer. Sau đó, chúng được vận chuyển tới bề mặt tế bào thông qua
bộ máy Golgi. Tại bề mặt tế bào các enzym protease của tế bào chủ phân cắt HA0
thành HA1 và HA2 (Sriwilaijaroen, 2012).
Vùng nối giữa HA1 và HA2 có chứa một hoặc một số amino acid kiềm tính
chính là vùng phân cắt hai tiểu đơn vị của protein HA0 dưới tác dụng của protease.
Trình tự amino acid vùng phân cắt HA có vai trò quyết định độc lực của virus
(Velkov, 2013). Ở các chủng virus, điển hình là H5N1 thể độc lực cao, chuỗi amino
acid kiềm tính trên vùng phân cắt HA được nhận biết bởi các protease nội bào phổ
biến, giúp virus có thể lây nhiễm và tái bản ở nhiều mô cơ quan khác nhau trong cơ
thể vật chủ và gây nên các triệu chứng toàn thân nặng nề (Perdue, 2000; Luczo,
2015). Ngược lại, vị trí phân cắt giữa hai tiểu phần HA1, HA2 ở các chủng virus thể
độc lực thấp chỉ có 1 amino acid kiềm là Arg và một số amino acid kiềm ở vị trí -3
hoặc - 4 nên chỉ chịu tác dụng của các protease ngoại bào (trypsin-like). Do đó,
virus H5N1 thể độc lực thấp chỉ có thể nhân lên ở các mô cơ quan có các enzym
này như ở đường tiêu hóa và đường hô hấp (Steinhauer, 1999; Gambotto, 2008).
Có khoảng 400 phân tử HA trên bề mặt capsid của một virus. HA có vai trò
quan trọng trong quá trình nhận diện, gắn vào tế bào chủ và khởi động quá trình
xâm nhiễm của virus vào tế bào chủ (Bender, 1999). Sự xâm nhiễm của virus được
khởi đầu bằng sự kết hợp đặc hiệu giữa HA của virus với thụ thể trên bề mặt tế bào
vật chủ, sau đó vỏ virus hòa với màng tế bào và giải phóng RNA hệ gen vào tế bào
vật chủ. Quá trình kết hợp phụ thuộc vào sự phù hợp cấu hình không gian của thụ
thể chứa sialic acid của tế bào đích với vị trí gắn với thụ thể này trên phân tử HA
của virus cúm, quyết định sự xâm nhiễm dễ dàng của virus ở các loài vật chủ khác.
Vị trí amino acid 226 (aa226) của tiểu đơn vị HA1 được xác định là vị trí quyết
định phù hợp gắn HA với thụ thể đặc hiệu của nó. Ở hầu hết các chủng virus cúm A


và thoát khỏi các chất ức chế không đặc hiệu. Cùng với vai trò của kháng nguyên
HA, cả 3 khâu tác động trên của NA đều tham gia làm gia tăng độc lực gây bệnh


11

của virus cúm A ở cơ thể vật chủ. Do đó, NA là đích tác động của các thuốc hóa
dược ức chế virus không đặc hiệu hiện nay, ví dụ Oseltamivir (biệt dược là Tamiflu)
phong tỏa enzyme NA, ngăn cản sự giải phóng hạt virus mới khỏi các tế bào đích,
bảo vệ cơ thể (Aoki, 2007).
NA là một kháng nguyên bề mặt của virus, tham gia kích thích hệ thống
miễn dịch của cơ thể chủ, sinh ra kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên NA của các
chủng virus đương nhiễm (Kilbourne, 2004; Rockman, 2013). Tương tự kháng
nguyên HA, hàm lượng kháng nguyên NA trên bề mặt virus khá lớn, tỷ lệ HA:NA
là 4:1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng nguyên này trong vắc xin phòng cúm trên
mô hình chuột thực nghiệm cho thấy NA không có khả năng bảo hộ hoàn toàn cơ
thể chống lại virus cúm nhưng lại có khả năng hạn chế hữu hiệu sự phát triển của
virus. Vì vậy, kháng nguyên NA được sử dụng như một nhân tố bổ trợ giúp tăng
khả năng bảo vệ của vắc xin (Kilbourne, 2004; Doyle, 2013; Eichelberger, 2015).
1.1.3.3. Kháng nguyên M2
Phân đoạn M có kích thước 1027 bp, mã hóa cho protein nền M1 của virus
và protein kênh ion M2. Hai protein này được mã hóa bởi những khung đọc mở
khác nhau của phân đoạn M. Các phân tử M1 liên kết với nhau thành một lớp kín
lót trong vỏ lipit kép, cùng với HA, NA và M2 hình thành nên vỏ capsid bao bọc
các phức hợp RNP. M2 là một protein xuyên màng bao gồm 97 amino acid với 3
vùng: vùng đầu N gồm 24 amino acid, nằm ở phía ngoài màng; vùng xuyên màng
gồm 19 amino acid; vùng nằm ở phía bào tương gồm 54 amino acid. Khối lượng
phân tử M2 khoảng 15 kDa. Chức năng của protein M2 là tạo kênh ion H+ cần thiết
cho khả năng lây nhiễm của virus ( Holsinger, 1994; Huang, 2008; Wang, 2011). Sự
hình thành nên kênh ion có vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus,

thường xuyên bị đột biến tạo nên các kháng nguyên mới, giúp virus thoát khỏi hệ
miễn dịch của vật chủ đó là các đột biến ở vị trí amino acid 136-141; vị trí amino
acid 152-153 và vị trí amino acid 124-129 (Smirnov, 2004; Hanson, 2016). Hiện
tượng lệch kháng nguyên là nguyên nhân gây ra các đợt dịch nhỏ, tản phát.
1.1.4.2. Hiện tượng trộn kháng nguyên
Hiện tượng trộn kháng nguyên xảy ra khi hai hay nhiều chủng virus cúm A
khác nhau, với nhiều đoạn RNA khác biệt nhau về mặt di truyền cùng lúc xâm


13

nhiễm vào một cơ thể vật chủ. Các phân đoạn gen của virus hoán vị với nhau. Kết
quả là tạo ra biến chủng virus mới có thể lây nhiễm vào vật chủ mới mà bố mẹ
chúng không có khả năng gây nhiễm hoặc gia tăng độc lực gây bệnh. Do đó, trộn
kháng nguyên được coi là nguyên nhân gây ra các đại dịch cúm (Macken, 2006;
Chen, 2008). Các virus HPAI H5N1 ở khu vực Đông Nam Á đều có gen HA và
NA có nguồn gốc từ chủng gốc Gs/Gd/1/96 trong khi 6 gen còn lại được lấy từ các
nguồn khác nhau do hiện tượng trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen. Chính
hiện tượng trộn kháng nguyên này đã tạo virus H5N1 gây ra đại dịch ở người năm
1997 và tiếp sau đó các dịch cúm gia cầm năm 2001 và 2002 (Chen, 2008).
Năm 1997, ở Hồng Kông virus cúm A/H5N1 lây trực tiếp từ gà sang người
đã giết chết 6 trên tổng số 18 người bị nhiễm. Virus này tiếp tục lan truyền sang
ngỗng ở miền Nam Trung Quốc và thay thế ngay các kiểu gen khác gây bệnh ở gà
nhưng không gây bệnh ở vịt. Năm 2001, 6 kiểu gen đã được xác định là A, B, C,
D, E và X0. Các kiểu gen này đều giống nhau về đột biến xóa 5 amino acid (vị trí
80-84) của protein NS1, ngoại trừ kiểu gen chủng Gs/Gd/1/96 và kiểu gen X0.
Năm 2002, có 8 kiểu gen mới xuất hiện là V, W, X1, X2, X3, Y, Z và Z +, trong
khi các chủng A, C, D và E không thấy nữa. Kiểu gen HPAI H5N1 trong giai đoạn
này mang đột biến mất 5 amino acid của NS1 và đột biến mất 20 amino acid (4968) trên vùng thân của NA. Đến năm 2003, thêm 3 kiểu hình chính nữa là Y, Z + và
V được phát hiện. Kiểu gen G được hình thành do sự trao đổi và tích hợp giữa

có 2 vị trí N-glycosil hóa liên tiếp ở amino acid 165 và 166 trên protein HA
(Nguyễn Nam Thắng, 2012).
Các nghiên cứu cho thấy đặc điểm glycosyl hóa protein HA liên quan chặt
chẽ đến khả năng xâm nhiễm, khả năng bám gắn và đặc điểm kháng nguyên của
virus cúm. Người ta thấy rằng, nếu gắn thêm gốc carbonhydrate vào gần vị trí phân
cắt tiểu đơn vị HA1, HA2 của protein HA thì gốc carbonhydrate có thể ngăn cản sự
tiếp xúc với protease. Do đó protein HA không phân cắt sẽ làm virus mất khả năng
xâm nhiễm tế bào. Nếu gốc carbonhydrate nằm gần vị trí gắn thụ thể thì các đột
biến này ảnh hưởng trực tiếp tới quá trình nhân lên và giải phóng virus. Nguyên
nhân là do gốc carbonhydrate tham gia điều chỉnh ái lực bám gắn và kiểm soát tính
đặc hiệu thụ thể (Deshpande, 1987; de Vries, 2010).


15

Hiện tượng “lệch kháng nguyên” và “glycosyl hóa” xảy ra liên tục theo thời
gian, còn hiện tượng “trộn kháng nguyên” có thể xảy ra với tất cả các chủng của
virus cúm A khi cùng nhiễm vào một tế bào ở tất cả các loài vật chủ khác nhau. Đây
cũng chính là vấn đề đáng lo ngại của virus cúm A/H5N1 hiện nay. Mặc dù virus
này chưa có sự thích nghi lây nhiễm dễ dàng ở người, nhưng nó có khả năng gây
bệnh cho người. Hơn nữa, rất có thể virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp gen HA hay NA
hoặc cả hai gen của các chủng virus cúm A đã thích nghi ở người để tạo ra một biến
chủng virus mới thích ứng lây nhiễm dễ dàng ở người, gây ra nguy cơ của một đại
dịch cúm mới (Hilleman, 2002; Watanabe, 2012).

1.2. NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN PHÒNG CÚM A/H5N1
1.2.1. Nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm trên thế giới
1.2.1.1. Vắc xin bất hoạt truyền thống
Hai dạng vắc xin thương mại đã được sử dụng để chủng ngừa cho gia cầm
chống lại sự lây nhiễm của virus cúm A/H5N1 là vắc xin bất hoạt sản xuất theo

1.2.1.2. Vắc xin phòng cúm A/H5N1 tạo ra bằng công nghệ gen
Vắc xin thế hệ mới là các loại vắc xin được tạo ra bằng công nghệ tái tổ hợp
DNA và kỹ thuật di truyền ngược được sử dụng để thay thế các vắc xin bất hoạt
truyền thống. Trong nhóm vắc xin thế hệ mới có nhiều loại vắc xin cúm A/H5N1
được tạo ra gần đây đã được thử nghiệm và sử dụng có hiệu quả như: vắc xin H5N1
có hệ thống dẫn truyền của adenovirus; vắc xin vector dẫn truyền virus đậu chim
Trovac-AIV-H5; vắc xin vector dẫn truyền virus Newcastle; vắc xin tái tổ hợp dưới
đơn vị; vắc xin tạo ra bằng phương pháp di truyền ngược.
Vắc xin phòng cúm A/H5N1 sử dụng vector virus dẫn truyền
Virus đậu gia cầm fowlpox là một thành viên của họ Poxviridae, hệ gen là
DNA sợi kép có kích thước lớn, gây bệnh ở một số loài gia cầm (Weli, 2011).
Fowlpox tái tổ hợp đã được sử dụng thành công làm vector biểu hiện gen mã hóa
cho kháng nguyên của một số virus gây bệnh nhằm phát triển vắc xin phòng bệnh
cho gia cầm (Boyle, 1993; Paoletti, 1996). Vector dẫn truyền virus đậu gà có khả
năng mang gen mã hóa HA, NA và tổng hợp protein này trong tế bào chủ mà virus
nhiễm. Các kháng nguyên này kích thích đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch


17

qua trung gian tế bào chống lại virus cúm A/H5N1 (Swayne, 2000a; Bublot, 2006).
Vắc xin tái tổ hợp sử dụng virus đậu gia cầm làm vector dẫn truyền mang gen mã
hóa HA, NA từ chủng H5N1 (rFPF-HA-NA) bắt đầu phát triển vào năm 1999, sau
khi phát hiện chủng H5N1 độc lực cao A/goose/Guangdong/1/96 (Qiao, 2003). Vắc
xin được chế tạo bằng cách nuôi cấy virus mang gen mã hóa HA, NA của virus cúm
A/H5N1 trên tế bào phôi gà, thu hoạch virus, bổ sung chất ổn định, đông khô tạo
thành sản phẩm cuối cùng. Vắc xin được tiêm một mũi cho gà một ngày tuổi, gà tạo
đáp ứng miễn dịch vào thời điểm 7 ngày sau khi gây miễn dịch và có khả năng bảo
vệ gà ít nhất 20 tuần (Bublot, 2006; Qiao, 2006; Qiao, 2009). Trong giai đoạn 2005
- 2008, khoảng 615 triệu liều vắc xin rFPF-HA-NA được sử dụng phòng dịch cúm

Di truyền ngược là một công nghệ mới đã được ứng dụng để tạo ra virus
RNA sống trong phòng thí nghiệm từ các gen virus độc lập. Dựa trên công nghệ này
nhiều chủng vắc xin cúm A/H5N1 được tạo ra để sản xuất vắc xin (Neumann,
2003). Tian và cộng sự, 2005 đã tạo ra chủng nhược độc H5N1 mang hai gen mã
hóa HA, NA lấy từ chủng A/goose/Guangdong/1/96, 6 gen khung còn lại (mã hóa
protein M, NS, NP, PA, PB1 và PB2) từ chủng A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), đây là
chủng thích ứng tốt trên phôi gà nên được sử dụng làm bộ khung của chủng vắc
xin. Để giảm độc tính, trình tự amino acid kiềm vùng phân cắt HA
RERRRKKRGLF được thay bằng RETRGLF (Tian, 2005). Virus tái tổ hợp có đặc
điểm kháng nguyên bề mặt giống với chủng hoang dại A/goose/GD/1/96 (H5N1),
chủng nhược độc tạo ra có tên là Re-1. Vắc xin Re-1 sau đó được sử dụng phổ biến
để phòng cúm H5N1 cho gia cầm ở Trung Quốc và xuất khẩu sang một số nước có
dịch cúm A/H5N1 như Indonesia, Ai Cập, Việt Nam...Cùng với sự xuất hiện các
clade mới, chủng Re-1 (A/goose/Guangdong/1/96) lần lượt được thay thế bởi các
chủng Re-4 (A/chicken/Shanxi/2/2006 clade 7) giai đoạn 2006-2007, Re-5
(A/duck/Anhui/1/2006,

clade

2.3.4)

giai

đoạn

2008-2012,

Re-6

(A/duck/Guangdong/ S1322/2010, clade2.3.2) từ năm 2012 đến nay (Lee, 2014).

biểu hiện gen ha (Athmaram, 2011). Kháng nguyên H5 tái tổ hợp từ chủng virus
cúm A/Hong Kong/156/97/H5N1 và A/Hong Kong/483/97/H5N1 biểu hiện trong
hệ bacculovirus/tế bào côn trùng đảm bảo tính an toàn và tính sinh miễn dịch trên
người

tình

nguyện

(Treanor,

2001).

Tiểu

phần

HA1

của

chủng

A/goose/Guangdong/97 (H5N1) biểu hiện trong hệ bacculovirus/tế bào côn trùng
đạt hiệu suất 68 mg/l. Với liều gây miễn dịch 50 µg HA1 trên chuột lang, hiệu giá
HI và hiệu giá kháng thể trung hòa sau 2 tuần gây miễn dịch lần 2 đạt 1:160 (Nwe,
2006). HA5 dạng monomer, dimer và trimer được biểu hiện thành công trong hệ


20



21

thương mại VLP phòng cúm được công bố. Đây là một hướng nghiên cứu mới đầy
triển vọng, đang được triển khai nghiên cứu và thử nghiệm tại nhiều phòng thí
nghiệm tiên tiến và các công ty dược phẩm hàng đầu trên thế giới (Crevar, 2008;
Shimizu 2013; Nguyễn Thị Hoa, 2015).
1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 trong nước
1.2.2.1. Tình hình dịch cúm A/H5N1 ở Việt Nam
Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối năm 2003 ở các
tỉnh phía Bắc, sau đó nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ
trong một thời gian ngắn. Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại
Việt Nam và có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề đến
nền kinh tế quốc dân. Có thể phân chia thành các đợt dịch lớn sau
()
Đợt thứ nhất từ tháng 12/2003 đến 30/3/2004, dịch cúm xảy ra ở các tỉnh Hà
Tây, Long An và Tiền Giang. Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng
đã xuất hiện ở 57/64 thành trong cả nước. Tổng số gà và thủy cầm mắc bệnh, chết
và thiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm. Trong đó, gà chiếm
30,4 triệu con, thuỷ cầm 13,5 triệu con. Ngoài ra, có ít nhất 14,8 triệu chim cút và
các loại khác bị chết hoặc tiêu huỷ. Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus
cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịch này.
Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17 tỉnh,
thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ
còn một điểm phát dịch. Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này
là 84.078 con. Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và 19.950 con chim cút. Và đã
có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó có 9 ca tử vong.
Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005: dịch cúm gà xảy ra trên
36 tỉnh thành trong cả nước. Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là

Clade 1 và clade 1.1 lưu hành phổ biến ở tỉnh phía Nam và Đồng bằng sông Cửu
Long. Vắc xin Re-1 (chủng vắc xin clade 0), Re-5 (chủng vắc xin clade 2.3.4) nhập
khẩu từ Trung Quốc được sử dụng để tiêm phòng cho gia cầm. Cũng trong giai
đoạn này, lần đầu tiên phát hiện clade 7 ở cửa khẩu Lạng Sơn (Le TH, 2014).


23

Clade 2.3.2 xuất hiện từ năm 2005 đến 2007, sau đó biến mất. Năm 2010
xuất hiện clade mới 2.3.2.1 thay thế cho nhánh virus cũ 2.3.4 (Okamatsu, 2013),
clade này sau đó tiến hóa, phát triển thành clade 2.3.2.1a, 2.3.2.1b. Gia cầm tiêm
phòng vắc xin cúm gia cầm thuộc clade 1 không bảo hộ được với virus cúm
A/H5N1 clade 2.3.2.1 (Nguyễn Ngọc Tiến, 2011). Ở khu vực phía Nam clade 1.1
tiến hóa thành các clade 1.1.1 và 1.1.2. Giai đoạn 2011- 2014, clade 2.3.2.1 tiếp tục
gây bệnh ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây Nguyên, cụ thể: clade 2.3.2.1a
xuất hiện ở hầu khắp các tỉnh miền Bắc, miền Trung, Tây Nguyên và Đông Nam
Bộ. Vắc xin Re-5 vẫn còn bảo hộ đối với clade 2.3.2.1a. Clade 2.3.2.1b xuất hiện ở
một số tỉnh miền Bắc, năm 2013 không ghi nhận sự xuất hiện của clade này. Vắc
xin Re-5 không bảo hộ được với virus cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1b. Clade 2.3.2.1c
xuất hiện năm 2012, gây bệnh khắp các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ và duyên hải
miền Trung, gây bệnh và làm chết nhiều vịt, ngan. Hiện nay clade 2.3.2.1a, c lưu
hành khắp cả nước vắc xin đang sử dụng có hiệu lực bảo hộ thấp đối với clade
2.3.2.1c. Ở miền Nam chủ yếu lưu hành các clade 1.1.1, 1.1.2, vắc xin Re-1, Re-5
vẫn còn hiệu quả đối với nhánh virus này (Le TH, 2014; Le, 2015; Cuong, 2016;
Nguyễn Lê Khánh Hằng 2016).
1.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất vắc xin phòng cúm gia cầm H5N1 ở Việt Nam
Từ năm 2003, khi dịch cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam, Nhà nước đã có
chủ trương nhập khẩu vắc xin để phòng chống dịch cúm gia cầm. Chi phí cho việc
này lên đến hàng trăm tỷ đồng mỗi năm, có những thời điểm dịch cúm gia cầm diễn
biến rất phức tạp nên việc nhập khẩu vắc xin phòng cúm gia cầm đã gặp không ít

biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên HA trong thực vật đang được tiến hành ở
một số phòng thí nghiệm. Việc nghiên cứu gen ha đã thành công trên cây thuốc lá,
đậu tương và bèo tấm. Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng sinh đáp
ứng miễn dịch trên động vật khi ăn thực vật chuyển gen này còn ở mức thấp. Huyết
thanh gà ăn bèo tấm Lemma bibba và Lemna minor chuyển gen H5 có chứa kháng
thể kháng H5 với hiệu giá HI 2-3log2 (Lê Văn Sơn, 2009; Lê Huy Hàm, 2011).
Cùng với việc nghiên cứu vắc xin phòng cúm A/H5N1 cho gia cầm, các
nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người được triển khai tại Viện Vệ
sinh Dịch tễ Trung ương, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, Viện Pasteur TP Hồ Chí
Minh. Nguyễn Thu Vân và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình công nghệ


25

sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 (FLUVAC) trên tế bào thận khỉ tiên phát ở quy mô
phòng thí nghiệm từ chủng di truyền ngược rgH5N1. Vắc xin đã được tiến hành thử
nghiệm lâm sàng trên người ở giai đoạn 3 (Nguyễn Thị Thu Vân, 2007). Nghiên
cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 cho người trên trứng gà có phôi từ chủng
NIBRG-14 cũng được tiến hành tại viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế (Nguyễn Thị
Minh Hiền, 2009; Dương Hữu Thái, 2013; Nguyễn Thị Lan Phương, 2015). Một số
nghiên cứu sản xuất kháng nguyên HA bằng hệ biểu hiện baculovirus và công nghệ
hạt tương tự virus đã được tiến hành ở một số phòng thí nghiệm (Nguyễn Thị Hoa,
2015; Phạm Thanh Hồng, 2015).
1.3. HỆ BIỂU HIỆN VI KHUẨN E. COLI VÀ NẤM MEN P. PASTORIS
1.3.1. Hệ biểu hiện E. coli
E. coli thuộc loại vi khuẩn Gram âm, có khả năng sinh sản nhanh với tốc độ
cao trên những môi trường nuôi cấy đơn giản và điều đặc biệt là chúng có khả
năng thu nhận rất nhiều các yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài như
plasmid, phage,…. Các yếu tố này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế
bào E. coli. Vì vậy, E. coli đã được cải biến để sử dụng như một vật chủ hữu