Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

MỞ ĐẦU
Virus suy giảm miễn dịch ở người (Human immunodeficiency virus - HIV)
là nguyên nhân chính gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired
Immunodeficiency Syndrome - AIDS) và là một trong những virus gây bệnh nguy
hiểm nhất hiện nay. Theo các tài liệu đã công bố, có ít nhất hai type HIV gây nên
AIDS đó là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2), nhưng HIV-1 là nguyên
nhân chính gây ra AIDS trên toàn thế giới.
Theo số liệu của Tổ chức Y tế Thế giới, tính đến cuối năm 2009 có khoảng 33,3
triệu người đang sống chung với HIV/AIDS, khoảng 1,8 triệu người đã chết vì AIDS
và có thêm 2,6 triệu trường hợp mới bị nhiễm virus này. Ở Việt Nam, theo báo cáo Cục
phòng chống HIV/AIDS - Bộ Y tế tính đến 31/3/2011, toàn quốc đã phát hiện người
nhiễm HIV tại hơn 75,2% xã/phường, gần 97,9% quận/huyện và 63/63 tỉnh/thành phố.
Tổng số trường hợp nhiễm HIV là 235.535 người, số bệnh nhân AIDS là 94.613 người,
số trường hợp tử vong đến cuối kỳ báo cáo là 49.912 người.
Trong chu trình sống của HIV-1, protease là enzyme không thể thiếu.
Enzyme này cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) tại những vị trí nhất định để
tạo thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Vì thế
protease được xem là một trong các đích tác động quan trọng nhất cho liệu pháp tìm
ra thuốc điều trị HIV/AIDS. Tuy nhiên, do HIV sao chép nhanh, enzyme phiên mã
ngược có tỷ lệ sai sót cao tạo ra sự biến đổi liên tục trong cấu trúc hệ gen của các
nhóm HIV dẫn đến tình trạng kháng thuốc. Mặc dù ngày càng nhiều chất ức chế
protease chống HIV được sản xuất và thương mại hóa nhưng việc tìm các chất ức
chế mới của protease vẫn luôn được quan tâm.
Bên cạnh đó, các đột biến kháng PI tương đối đặc hiệu cho từng loại thuốc
riêng biệt, do đó thay thế một loại thuốc khác trước khi có sự tích lũy đột biến thì
các phác đồ sau vẫn thành công (Hoffmann và tập thể, 2007). Vì vậy, xét nghiệm


2

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về HIV
1.1.1. HIV/AIDS
Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải được gọi tắt là AIDS, do virus HIV gây ra
sự suy giảm miễn dịch ở người được phát hiện ở Mỹ năm 1981, đến nay đã
trở thành “căn bệnh thế kỷ” trên toàn thế giới.
Về phân loại, HIV là các Retrovirus có bộ máy di truyền thuộc họ
Retroviridae với hai type chính là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV-2),
trong đó HIV-1 gây ra 98% sự lan truyền còn HIV-2 chỉ chiếm ưu thế ở vùng tây
châu Phi, ít lan truyền trên thế giới [1, 15]. Vì vậy, HIV-1 được xem như là nguyên
nhân chính gây nên AIDS.
HIV-1 được chia thành 3 nhóm là M (main), O (outlier), nhóm N (new) trong
đó hơn 90% sự lây nhiễm của HIV thuộc nhóm M. Trong nhóm M gồm các phân
nhóm A, B, C, D, F, G, H, J, K và nhiều dạng tái tổ hợp khác (circulating
recombinant form-CRF). Các phân nhóm khác nhau chủ yếu ở cấu trúc của các
protein vỏ và đặc trưng cho sự truyền nhiễm theo khu vực địa lý. Đây là một đặc
điểm đáng lưu ý trong các nghiên cứu để tìm ra thuốc điều trị cho các bệnh nhân
HIV/AIDS theo từng khu vực [14].
Về cấu trúc, HIV có dạng hình cầu với kích thước khoảng 120 nm, được mô

tiền thân dưới dạng polypeptide thành các protein cấu trúc và chức năng cần cho sự
hình thành của thể virus. Gen env mã hóa cho các glycoprotein capsid của virus; sản
phẩm của gen env (gp160) được cắt bởi protease của tế bào chủ thành gp120 và
gp41 sau đó lắp ráp lại thành cấu trúc tam phân trong lớp vỏ virus. Ngoài 3 gen
chính, HIV còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa
cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm khác nhau
hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [5, 17, 22].

Hình 1: Cấu tạo của HIV [40]

HIV truyền nhiễm theo 4 con đường, bao gồm con đường tiêm truyền do
dùng chung kim tiêm, lây nhiễm do truyền máu và các sản phẩm của máu, từ mẹ bị
nhiễm bệnh sang thai nhi và qua quan hệ tình dục không an toàn [1, 15].
Quá trình tiến triển của bệnh được chia thành 3 thời kì. Sự lây nhiễm HIV
ban đầu gọi là quá trình nhiễm sơ cấp, thường kéo dài từ 3-6 tuần, sau đó virus đi
khắp cơ thể, nhân bản mạnh trong khi không có bất cứ đáp ứng miễn dịch thích hợp

Lớp Cao học K18
2011

4

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn


Lớp Cao học K18
2011

5

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

phường và 97,8% quận, huyện trên toàn quốc báo cáo có người nhiễm HIV/AIDS.
Thành phố Hồ Chí Minh vẫn là địa phương có tỷ lệ bệnh nhân HIV/AIDS cao nhất
với 23% tổng số bệnh nhân trong cả nước. Phân tích hình thái lây nhiễm cho thấy,
trong số những người mới được phát hiện nhiễm HIV trong 3 quí đầu năm 2010 có
49% bị nhiễm qua đường máu, 38% qua đường tình dục, 3% qua đường mẹ - con và
10% không rõ đường lây. Tỷ lệ nam giới nhiễm HIV chiếm 70,8% và nữ giới chiếm
29,2%. Phần lớn người nhiễm HIV được phát hiện trong 9 tháng qua ở tuổi từ 20-39
(chiếm 82%), trẻ em dưới 15 tuổi chiếm gần 3%. Theo đánh giá chung, tình hình
nhiễm HIV/AIDS có xu hướng giảm nhưng đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn
tập trung – xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt trong
nhóm tiêm chích ma túy và nhóm người mại dâm.
Do những hậu quả to lớn của đại dịch HIV/AIDS đối với sự phát triển xã hội
trên phạm vi toàn cầu, việc tìm ra vaccine phòng ngừa hiệu quả và thuốc đặc trị cho
căn bệnh này là vấn đề cấp thiết đối với các nhà khoa học y học và sinh học phân tử.
1.1.3. Phương pháp điều trị HIV/AIDS
Cách điều trị HIV/AIDS phổ biến nhất là dùng thuốc chống virus, đây là
thuốc có tác dụng ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác

Protease HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của
virus. Protease cần thiết để phân cắt các tiền chất polyprotein virus gag và gag-pol
thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trưởng thành của virus
[39]. Các nghiên cứu cho thấy, khi ức chế hoạt tính của protease hoặc gây đột biến
trên gen mã hóa cho protease, các hạt virus được hình thành nhưng không có khả
năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Với vai trò đặc biệt quan trọng như trên,
protease HIV-1 là một trong các đích nghiên cứu nhằm tìm ra loại thuốc ngăn chặn
sự nhân lên của HIV.
1.2.1. Gen mã hóa protease HIV- 1
Hệ gen của HIV-1 nằm trong phần lõi của virus và bao gồm hai sợi RNA (+)
đơn, mỗi sợi có chiều dài khoảng 9,8 kb và có 9 gen mã hóa cho 15 protein khác nhau.
Trên mỗi sợi RNA có 3 gen cấu trúc là gag, pol và env; trong đó gag có nghĩa “groupantigen” (kháng nguyên nhóm), pol là “polymerase” và env là “envelope” (vỏ). Các
gen gag và env mã hóa cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã
hóa cho 3 enzyme: reverse transcriptase, integrase và protease. Ngoài ra, HIV-1 còn có
6 gen (vif, vpu, vpr, tat, rev và nef) ở vùng RNA 9 kb (Hoffmann và tập thể, 2007).
Do tốc độ sinh sản nhanh của HIV – 1, có khoảng 10 triệu hạt virus mới được
tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót rất cao của enzyme reverse transriptase (1/10.000
base) dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm
chí khi chưa dùng thuốc. Nghiên cứu trên các bệnh nhân nhiễm chủng CRF01_AE
thất bại trong điều trị HAART ở Nonthaburi, Thailand được đăng ký trên GenBank
với số hiệu từ FJ463512- FJ463596, phát hiện các đột biến phụ (minor) kháng thuốc

Lớp Cao học K18
2011

7

Khóa 2009-



lực của saquinavir tăng cường (Valer và tập thể, 2002).
1.2.2. Cấu trúc của protease HIV-1
Có nhiều cách phân loại protease, dựa vào vị trí cắt trên chuỗi polypeptide,
protease được chia thành hai nhóm chính: exopeptidase và endopeptidase.
Exopeptidase cắt liên kết peptide ở gần đầu N hoặc đầu C của cơ chất, trong khi đó

Lớp Cao học K18
2011

8

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

endopeptidase cắt liên kết peptide nội chuỗi. Dựa vào cấu trúc của “nhóm chức” có
mặt trong trung tâm hoạt động, protease lại được chia thành bốn nhóm chính:
protease serine, protease aspartyl, protease cysteine/thiol và protease chứa kim loại
(metallo protease), tiếp đó protease lại tiếp tục được phân chia thành nhiều họ khác
nhau dựa vào trình tự axit amin [34]. Theo cách phân loại này, protease HIV-1 là
một protease aspartyl hay protease axit.
Navia và tập thể tại phòng thí nghiệm Mecrk [27] là nhóm đầu tiên tạo được
cấu trúc tinh thể của protease HIV-1 vào năm 1989, kể từ đó cấu trúc của protease
đã được nghiên cứu rộng rãi cả về chức năng, tính đặc hiệu cơ chất cũng như sự liên
kết với các chất ức chế. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt
nhau được sắp xếp gần như theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lượng khoảng


nước từ vị trí hoạt động. Có một phân tử nước được giữ lại hình thành nên cầu nối
giữa chất ức chế và nhóm –NH- của Ile 50/50’ –NH- ở các mũ. Phân tử nước này
rất thiết yếu cho sự thủy phân của protease và có thể bị thay thế bởi một nhóm
cacbonyl có trong một chất ức chế thích hợp nào đó. Các nghiên cứu cũng đã chứng
minh rằng các mũ của protease thực sự mềm dẻo và tính chất mềm dẻo này có thể
quan trọng đối với hoạt tính của enzyme. Nếu đột biến xuất hiện ở vị trí mũ có thể
làm giảm mạnh hoạt tính của enzyme [11, 39].

Hình 2: Cấu trúc không gian của protease HIV-1 [39]

1.2.3. Chức năng của protease HIV-1
Protease là enzyme không thể thiếu có vai trò quan trọng trong quá trình tái
bản của HIV-1. Nó cắt phân tử polyprotein (gag, gag-pol) thành các protein cấu
trúc, có chức năng cần thiết cho virus trưởng thành. Cụ thể, protease HIV-1 nhận
biết 9 trình tự peptide khác nhau trên polypeptide gag để tạo ra các protein cấu trúc:
matrix, capsid, nucleocapsid cùng với các protein có khối lượng phân tử bé p2, p1
và p6 có vai trò trong quá trình lắp ráp và xác định hình thái của lớp vỏ trưởng
thành; thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành 3 enzyme: protease, RT và

Lớp Cao học K18
2011

10

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng



Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

1.2.4. Tạo protease HIV-1 tái tổ hợp
Do vai trò quan trọng của protease HIV-1, việc sản xuất và tinh sạch với
lượng đủ lớn enzyme này là cần thiết cho các nghiên cứu nhằm phát triển các loại
thuốc ức chế protease trong điều trị bệnh HIV/AIDS. Chính vì vậy từ khi HIV được
phát hiện cho đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV1 bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E. coli hoặc trên nấm men Saccharomyces
cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học monomer 99 axit amin. Tuy nhiên, quá
trình sản xuất protease HIV-1 gặp nhiều trở ngại trong việc biểu hiện và tinh sạch.
Năm 1989, Darke và tập thể [8] đã sử dụng promoter trp của vector pPRT để
biểu hiện protease HIV-1. Protease sau khi được tinh sạch qua hệ thống cột DEAEsephadex A-25 và phosphocellulose có khối lượng khoảng 11 kDa, bao gồm 99 axit
amin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng như phân cắt cơ
chất tổng hợp. Kết quả nghiên cứu tính chất cũng cho thấy, hoạt tính của protease
tinh sạch bị ức chế bởi pepstatin A và khi gây đột biến thay Asp-25 thành Asn-25,
protease chỉ còn 1% hoạt tính so với dạng protease nguyên bản ban đầu.
Năm 1990, Cheng và tập thể [6] đã sử dụng tế bào E. coli JM105 đồng nhiễm
với phage αCE6 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 với số lượng lớn. Protease
HIV-1 thu được chủ yếu ở dạng thể vùi, sau đó được hòa tan bằng ure 8 M, tinh sạch
qua cột lọc gel ACA54 rồi được hồi tính để thu được dạng hoạt động và thử hoạt tính
với cơ chất tổng hợp. Kết quả, protease HIV-1 được tinh sạch với hiệu suất 20 mg từ
1 lít môi trường nuôi cấy, có khả năng phân giải peptide với hoạt độ 450
nmol/phút/mg protein, một bước tinh sạch qua cột tiếp theo làm tăng hoạt độ lên 800
nmol/phút/mg. Khi so sánh với protease HIV-1 thu được từ các điều kiện không biến
tính cho thấy protease ở dạng biến tính sau đó sẽ được hồi tính hiệu quả.
Năm 1992, Rangwala và tập thể [32] đã biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn

nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đặc hiệu. Trong phản ứng PCR thứ hai,
C-terminal His-tag và các nhân tố điều hòa cần thiết cho biểu hiện protein ở hệ
thống tế bào nhân sơ dựa trên T7 polymerase (T7 promoter, vị trí liên kết ribosome
của vi khuẩn, T7 terminator, mã mở đầu, mã kết thúc) được bổ sung vào. Sản phẩm
PCR cuối cùng có thể biểu hiện trực tiếp protein không cần bất kỳ bước tinh sạch
nào. Phân tích phân đoạn hòa tan và không tan của hệ thống biểu hiện bằng điện di
protein cho thấy thu nhận được protease mong muốn chủ yếu ở phân đoạn hòa tan.
Khi được biểu hiện ở E. coli, protease HIV-1 có khả năng gây độc giết chết tế
bào [34]. Để hạn chế tính độc này, một vài nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu
hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện và quy trình biểu hiện
khác nhau như sử dụng các promoter trp, λPL, T7, araBAD và tac [8, 18, 35]. Nghiên
cứu biểu hiện protease dưới dạng dung hợp với nhiều protein khác nhau để tăng tính
tan của protease như β-galactosidase, dihydrofolate reductase, β-lactamase, maltose
hoặc gắn với phân tử IgG [10, 24, 35]. Protease được liên kết với IgG bởi liên kết
peptide Asp-Pro, liên kết này không bị cắt bởi protease của virus. Protein dung hợp
có khối lượng phân tử 25,4 kDa vẫn có hoạt tính xúc tác, cắt cơ chất peptide tại đúng

Lớp Cao học K18
2011

13

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn


14

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh đã bất hoạt virut lấy từ các bệnh nhân đang điều trị
kháng virut tại Bệnh viện Nhiệt đới Trung ương.
2.1.2.Các hệ vector và chủng vi sinh vật
Đoạn gen mã hóa protease của HIV được đưa vào vector nhân dòng
pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể [2].
Vector nhân dòng pGEM-T của hãng Promega. Các vector: pET28a,
pET32a và pET43a của hãng Novagen (Mỹ).
Các chủng vi khuẩn E. coli DH5α; E. coli BL21 (DE3) pLysS; E. coli BL21
(DE3) RIL được mua từ hãng Novagen.
2.1.3. Hóa chất
Thang chuẩn protein nhuộm sẵn, hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và
dTTP) của hãng Fermentas. Các oligonucleotide được thiết kế và đặt mua từ hãng
Invitrogen. Kit tinh sạch DNA trên gel điện di của hãng Bioneer và Fermentas. Các
hoá chất giải trình tự do hãng Beckman Coulter cung cấp. Kháng thể đơn dòng
kháng protease HIV-1 được mua từ hãng Gene-Tex. Gel sắc ký ái lực His-bind của
hãng Novagen. Các hoá chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dùng cho nghiên cứu sinh
học phân tử.

với cột được nhiều nhất. Cột sau đó được chuyển sang ống eppendorf mới và được
rửa 2 lần bằng đệm AW1 và AW2 kết hợp ly tâm ở 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
Cuối cùng, cột được chuyển sang một ống eppendorf mới. 60 µl đệm AVE được bổ
sung, hỗn hợp được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 1 phút để thu hồi lại RNA.
Mẫu được bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng.
2.2.2. Tổng hợp cDNA từ RNA virus
RNA của HIV-1 được chuyển thành cDNA bằng enzyme M-MLV reverse
transcriptase của Hãng Enzynomics.
cDNA được tổng hợp theo quy trình: 10 µl RNA của HIV-1 và 1 µl mồi
ngẫu nhiên (0,2 µg) được biến tính ở 70oC trong 5 phút, làm lạnh trên đá. Hỗn hợp
phản ứng sau đó được bổ sung 2 µl đệm M-MLV reverse transcriptase 10x, 2,5 µl
hỗn hợp dNTP (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) 2 mM, 3,5 µl H2O, 0,5 µl chất ức
chế ribonuclease và 0,5 µl M-MLV reverse transcriptase, hỗn hợp phản ứng được ủ
ở 37oC trong 90 phút, phản ứng được kết thúc bằng xử lý nhiệt ở 70 oC trong 10 phút
và làm lạnh trên đá. Các mẫu cDNA sau đó được bảo quản ở -20 oC để dùng cho các
thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2. Tách chiết và định lượng DNA
DNA plassmid được tách chiết theo kit của Hãng Fermentas.
Nguyên lý: Màng tế bào bị dung giải bằng SDS để giải phóng plasmid. Trong
môi trường kiềm, trong khi DNA nhân sẽ bị biến tính và kết tủa khi hỗn hợp được
trung hòa bằng axit thì plasmid do có cấu trúc siêu xoắn nên quá trình biến tính xảy
ra ở mức độ vừa phải và sẽ nhanh chong được hồi tính khi trung hòa, do vậy,

Lớp Cao học K18
2011

16

Khóa 2009-


Quy trình tiến hành: Gel agarose được chuẩn bị trong đệm TAE với
nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA
được trộn với đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene
cyanol và Ethidium bromide 50 µg/ml sau đó tra vào Đường chạy. Điện di được

Lớp Cao học K18
2011

17

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

tiến hành với điện thế ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30
phút. Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi và chụp ảnh dưới ánh
sáng tử ngoại của máy soi gel Doc (Bio-Rad).
2.2.4. Nhân bản các đoạn gen bằng kỹ thuật PCR
Sử dụng cặp mồi HIV Fw/Rv được thiết kế để nhân bản đặc hiệu đoạn gen
mã hóa cho protease HIV-1 từ nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể
[2]. Để thuận tiện cho quá trình biểu hiện sau này, có vị trí cắt giới hạn của enzyme
BamHI trên mồi xuôi và enzyme XhoI trên mồi ngược. Ngoài ra, trên mồi xuôi còn
có thêm 21 nucleotide mã cho trình tự tự cắt gồm 7 axit amin, Gly-Thr-Val-SerPhe-Asn-Phe, tương ứng với vị trí cắt đặc hiệu giữa p17 và p24 trên gen gag của
HIV-1. Trình tự cặp mồi như sau (vị trí cắt enzyme giới hạn được thể hiện bằng chữ
có gạch chân; trình tự tự cắt được thể hiện bằng chữ in nghiêng):
• HIV-Fw: 5’-GGGCGGATCCACTAGT

HIV-Rw 10 pmol

1

pCR2.1-Prot

0,5

Tổng thể tích

25

Lớp Cao học K18
2011

18

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

94oC-40 giây
Với chu trình nhiệt như sau: 40 chu kỳ

53oC-30 giây
72oC-30 giây


1

4

Vector pGEM-T

1

5

ddH2O

1

Tổng thể tích

10

Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22oC trong 3 tiếng, sau đó sử dụng cho biến nạp vào
tế bào khả biến E. coli chủng DH5α
Tế bào khả biến E. coli DH5α được lấy ra từ tủ lạnh sâu -80 oC để trên đá 10
phút cho tan dần, sau đó được bổ sung hỗn hợp phản ứng gắn ở trên, trộn nhẹ và để
trên đá 20 phút tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào. Hỗn hợp biến nạp
được làm sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây, làm lạnh trên đá 2 phút rồi bổ sung 500 µl

Lớp Cao học K18
2011

19

Quy trình tiến hành: Khuôn cho phản ứng PCR được chuẩn bị để xác định
trình tự, sản phẩm PCR đoạn gen mã hoá cho protease HIV-1 được pha loãng ở
nồng độ thích hợp (khoảng 50-100 pmol).
Thành phần phản ứng PCR cho xác định trình tự gồm: 6 µl hỗn hợp DTCS
(Dye terminator cycle sequencing) Master mix, 1 µl khuôn, 1 µl mồi (mồi xuôi
hoặc mồi ngược), H2O vô trùng vừa đủ 20 µl.

Lớp Cao học K18
2011

20

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Phản ứng PCR được thực hiện 35 chu kỳ gồm 3 bước: 96 oC trong 30 giây,
56oC trong 30 giây, 60oC trong 4 phút. Sản phẩm của phản ứng PCR này được xử lý
trước khi đưa vào máy đọc trình tự. Quá trình xử lý mẫu gồm các bước sau:
- Dung dịch dừng phản ứng gồm: 20 µl CH3COOK 3 M pH 5,2, 20 µl EDTA
100 mM pH 8, 10 µl glycogen và trộn đều. 5 µl dung dịch dừng phản ứng được bổ
sung vào 1 phản ứng PCR 20 µl và trộn đều.
- Bổ sung vào hỗn hợp 60 µl ethanol 95% giữ ở -20oC. Sau đó, hỗn hợp phản
ứng được ly tâm ngay ở 13.000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 0C. Dịch nổi được hút
bỏ và thu kết tủa. Kết tủa được rửa 2 lần, mỗi lần bằng 200 µl ethanol 70% giữ ở
-20oC và được ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được hút bỏ cẩn


dd H2O

37 µl

37 µl

BamHI (20 đơn vị/µl)

3 µl

3 µl

XhoI (20 đơn vị/µl)

5 µl

5 µl

Sản phẩm cắt enzyme giới hạn được điện di trên gel agarose 1%. Sau khi các
băng DNA đã phân tách, phần gel chứa DNA quan tâm được cắt riêng, chuyển sang
ống eppendorf sạch. Quy trình tinh sạch DNA từ gel agarsore bằng kit thôi gel của

Lớp Cao học K18
2011

21

Khóa 2009-


hoà trở lại trong đệm có bổ sung PMSF 1 mM. Dịch tế bào được làm lạnh trên đá,
siêu âm để phá màng tế bào, giải phóng protein, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 20
phút ở 4oC để thu dịch chiết.
2.2.8. Tinh sạch protease HIV-1 bằng cột sắc ký ái lực His-bind (Novagen)
Nguyên tắc: các protein chứa trình tự Histidine (His-tag) có ái lực cao với ion
Ni2+. Do vậy, những protein này có thể được tinh sạch bằng sắc ký ái lực trên gel His-

Lớp Cao học K18
2011

22

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

bind (có giá thể được gắn thêm gốc Ni 2+), sau đó protein đích gắn trên cột được thu lại
bằng cách rửa chiết protein ra khỏi gel với Imidazol, là chất có cấu tạo tương tự His.
Tiến hành: Gel His-bind ở dạng trương nở sẵn được nhồi vào cột (kích thước
1x2 cm) để có thể tích cột gel 2 ml. Cột gel được xử lý Ni2+ nồng độ 50 mM để tạo
phức hệ gắn; sau đó được cân bằng với đệm A (Tris-HCl 20 mM pH 7,9 có chứa
NaCl 100 mM, ure 8 M, và Imidazol 5 mM). Phân đoạn kết tủa tế bào chứa protease
HIV-1 được cho lên cột với tốc độ 10 ml/giờ. Các protein không gắn với gel được
loại bỏ dần bằng cách rửa cột với đệm A có Imidazol 20 mM đến khi OD280 ‹ 0,1.
2.2.9. Điện di trên gel polyacrylamide có chứa SDS (SDS-PAGE) theo phương
pháp của Laemmli [20]

APS 10%

30 µl

20 µl

TEMED

7 µl

5 µl

Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp được trộn đều đúc vào
khuôn kính đã được gắn sẵn trên giá đỡ. Gel tách được đúc trước, bề mặt gel được
phủ một lớp butanol tuyệt đối để mặt gel phẳng. Sau khi phần gel tách được trùng
hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và cài lược để tạo các Đường chạy, để gel
trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di.

Lớp Cao học K18
2011

23

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn



Màng được rửa 3 lần bằng đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%
để loại bỏ BSA thừa.



Màng sau đó được ủ với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (kháng
thể sơ cấp), lắc nhẹ trong ít nhất 1 giờ, ở 37oC.



Kháng thể sơ cấp bám không đặc hiệu trên màng được loại bỏ bằng cách
tráng rửa màng 3 lần trong đệm PBS 1X, pH 7,4 có bổ sung Tween 80 0,1%.

Lớp Cao học K18
2011

24

Khóa 2009-


Luận văn Thạc sĩ Khoa học
Dũng

Nguyễn Văn

Sau đó màng được ủ với kháng thể thứ cấp thích hợp có gắn phosphatase
kiềm. Kháng thể thứ cấp bám không đặc hiệu cũng được loại bỏ bằng cách

Lớp Cao học K18
2011

25

Thể tích (μl)
136
150
12
2
300

Khóa 2009-