ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------

MẪN HỒNG PHƢỚC

NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA
VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ
Epinephelus sp. PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI
TỔ HỢP

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

HÀ NỘI - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------

MẪN HỒNG PHƢỚC

NGHIÊN CỨU KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP CỦA VIRUS
GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ Epinephelus sp.
PHỤC VỤ SẢN XUẤT VẮC XIN TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60.42.01.07

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC


1.1.1. Cá mú ................................................................................................................4
1.1.2. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN) ..................................6
1.1.3. Tình hình dịch bệnh VNN .................................................................................7
1.1.4. Phòng và điều trị bệnh VNN .............................................................................9
1.2. VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS VIRUS NNV) ..........................................................................................................................10
1.2.1. Nguồn gốc .......................................................................................................10
1.2.2. Bộ gen của Betanodavirus ..............................................................................10
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus ...............................................................13
1.3. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ XƢƠNG VÀ VẮC XIN PHÒNG BỆNH VNN
CHO CÁ MÚ ............................................................................................................16
1.3.1. Đáp ứng miễn dịch ở cá xƣơng .......................................................................16
1.3.2. Một số kết quả nghiên cứu vắc xin phòng bệnh VNN ở cá mú ......................19
1.3.3. Các loại vắc xin sử dụng cho cá ......................................................................20
1.3.4. Nguyên tắc dùng vắc xin cho cá ....................................................................22
1.4. MỘT SỐ ENZYME VÀ VECTOR PLASMID SỬ DỤNG TRONG KỸ
THUẬT GEN ............................................................................................................25
1.4.1. Các enzyme sử dụng trong kỹ thuật gen .........................................................25
1.4.2. Vector plasmid ................................................................................................27
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................30
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...............................................................................30
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu......................................................................................30
2.1.2. Các sinh phẩm .................................................................................................30


2.1.3. Hóa chất ..........................................................................................................30
2.1.4. Môi trƣờng và dung dịch .................................................................................31
2.1.5. Thiết bị ............................................................................................................32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................33
2.2.1. Phƣơng pháp tách dòng ...................................................................................33
2.2.2. Phƣơng pháp biểu hiện ....................................................................................41

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng xử lý pGEM - T/T4 bằng enzyme hạn chế ...........40
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng ghép nối gen T4 vào pET-32a(+) .........................42
Bảng 3.1 So sánh mức độ tƣơng đồng của trình tự đoạn gen T4 thu đƣợc...............59
Bảng 3.2. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử
thần kinh ở hệ thống in vitro .....................................................................................73
Bảng 3.3. Kết quả xác định hiệu giá kháng thể trung hòa virus gây bệnh hoại tử thần
kinh ở mô hình in vivo...............................................................................................73
Bảng 3.4. Kết quả xác định hiệu giá sinh đáp ứng miễn dịch chống lại virus ..........75


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Một số loài cá mú nuôi chủ yếu ..................................................................4
Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Betanodavirus ...................................................10
Hình 1.3. Cấu trúc gen của Betanodavirus ...............................................................11
Hình 1.4 Sơ đồ pGEM – T vector dùng trong tách dòng gen ...................................28
Hình 1.5. Plasmid pET-32a+ .....................................................................................28
Hình 2.1. Quy trình tách dòng gen T4 ......................................................................33
Hình 2.4. Quy trình biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV ............41
Hình 2.5. Quy trình đánh giá khả năng tạo kháng thể của kháng nguyên tái tổ hợp 46
Hình 3.1. Biểu hiện của cá mú khi mắc bệnh hoại tử thần kinh ...............................52
Hình 3.2. Kết quả điện di RNA tổng số ....................................................................53
Hình 3.3. Kết quả RT-PCR của 10 mẫu RNA tổng số..............................................54
Hình 3.4. Kết quả tinh sạch sản phẩm RT-PCR........................................................55
Hình 3.5 Quy trình tạo vector tái tổ hợp pGEMT- T4 ..............................................56
Hình 3.6. Nuôi cấy vi khuẩn biến nạp trên môi trƣờng LB có Ampicilin, chất chỉ thị
màu X-gal, chất cảm ứng IPTG ................................................................................57
Hình 3.7 Tách plasmid từ khuẩn lạc trắng ................................................................57
Hình 3.8 Điện di PCR kiểm tra sự mang gen T4 của plasmid tách đƣợc. ................58
Hình 3.9 Điện di sản phẩm phản ứng cắt kiểm tra sự mang gen T4 của plasmid tách
đƣợc bằng EcoRI. ......................................................................................................58

: Central nervous system

CPE

: Cytopathic effect

ELISA

: Enzyme linked immunosorbent assay

GGNNV

: Greasy grouper nervous necrosis virus

GNNV

: Grouper nervous necrosis virus

GS

: Grouper spleen

IFAT

: Indirect fluorescent antibody test

IPTG

: isopropyl β-D- thiogalactoside


: Viral nervous necrosis

TBS

: Tris Buffer Saline

TBST

: TBS - Tween


BSA

: Bovine Serum Albumin

EDTA

: Ethyllene diamine tetra acetic acid

TAE

: Tris - acetate - EDTA

LB

: Lubria – Bertani

PBS

: Phosphate buffer

quan tâm phát triển. Tuy nhiên, khi phát triển nuôi cá mú với mật độ cao và nuôi
thâm canh thì cũng phát hiện một số bệnh ảnh hƣởng đến năng suất và chất lƣợng
cá. Qua nghiên cứu, ngƣời ta đã chỉ ra rằng những tác nhân gây bệnh chủ yếu trên
cá mú thƣờng là virus, nấm, vi khuẩn mà trong đó nguy hiểm nhất là bệnh hoại tử
thần kinh (Viral Nervous Necrosis-VNN) hay bệnh não và võng mạc (VER-Viral
1


Encephalopathy) do Betanodavirus còn gọi là Piscine nodavirus gây ra. Chúng gây
bệnh trên cá mú ở tất cả các độ tuổi, song thƣờng gặp nhiều nhất ở giai đoạn ấu
trùng (từ 10-25 ngày tuổi) và cá giống. Biểu hiện lâm sàng là cá bỏ ăn, bơi lờ đờ
trên mặt nƣớc, bơi không định hƣớng. Não xung huyết, cá nhiễm bệnh có biểu hiện
rối loạn về thần kinh nhƣ: bơi không bình thƣờng, lòng vòng không định hƣớng,
mất thăng bằng, đầu chúc xuống dƣới. Cá bệnh ít hoạt động, đầu treo trên mặt nƣớc
hoặc nằm dƣới đáy bể, đáy lồng. Cá chết sau 3-5 ngày có dấu hiệu bệnh với tỷ lệ
cao, có thể từ 80-100%. Ở nƣớc ta, bệnh xuất hiện ở hầu hết các vùng nuôi cá mú
trên cả nƣớc từ tháng 5-10, đặc biệt khi mƣa nhiều, khi nhiệt độ khoảng 25-30ºC.
Tỷ lệ chết do bệnh gây ra dao động từ 50- 100% tùy thuộc vào loài và giai đoạn
xuất hiện bệnh [4].
Từ tình hình dịch bệnh hoại tử thần kinh trên cá mú đang ngày càng gia tăng
đòi hỏi các biện pháp phòng bệnh hiệu quả. Cá mú có khả năng sinh đáp ứng miễn
dịch khi tiếp xúc với kháng nguyên, do đó vắc xin phòng bệnh cho cá là giải pháp
hữu hiệu. Ở nƣớc ta hiện tại vắc xin sử dụng để phòng bệnh cho cá mú là vắc xin
bất hoạt, tỷ lệ bảo hộ chỉ đạt khoảng 60-65%. Vì vậy, cần có một vắc xin có hiệu
lực cao hơn, đem lại khả năng phòng bệnh tốt hơn, giúp giảm thiểu sự thất thoát do
bệnh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi hƣớng đến việc tạo ra chủng vi khuẩn tái tổ
hợp biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của NNV làm tiền đề cho việc
nghiên cứu tạo vắc xin phòng bệnh cho cá mú, chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên
cứu kháng nguyên tái tổ hợp của virus gây bệnh hoại tử thần kinh ở cá mú
Epinephelus sp. phục vụ sản xuất vắc xin tái tổ hợp”.

1.1. SƠ LƢỢC VỀ BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ MÚ
1.1.1. Cá mú
Cá mú hay cá song là giống cá có tên khoa học là Epinephelus (tên tiếng
Anh: groupers) thuộc họ (Serranidase), bộ cá vƣợc (Perciformes), lớp cá vây tia
(Actinopterygii), ngành Chordata [65].

Cá mú hoa nâu
Epinephelus malabaricus

( Epinephelus fuscoguttatus)

Cá mú chấm đỏ (Epinephelus

Cá mú dẹt (Cromileptes altivelis)

akaara)

Cá mú bleekeri (Epinephelus bleekeri)

Cá mú chấm tổ ong (E. merra)

Hình 1.1. Một số loài cá mú nuôi chủ yếu
Cá mú là loại cá nƣớc mặn, sống tại những vùng nƣớc ấm, phân bố chủ yếu ở
vùng biển nhiệt đới và á nhiệt đới, tập trung nhiều loài ở vùng biển Thái Bình
Dƣơng. Theo Viện Hải dƣơng học Nha Trang, nƣớc ta có khoảng trên 30 loài cá
mú, trong đó có nhiều loài có giá trị kinh tế cao, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu nhƣ: cá
4


mú vạch (E. brunneus), cá mú chấm tổ ong (E. merra), cá mú đỏ (E. akaara), cá mú

ngoài việc đánh bắt tự nhiên, phong trào nuôi cá mú lồng bè cũng rất phát triển. Cá
mú có thể đƣợc nuôi trong các lồng tre, bè gỗ có phủ lƣới, đƣợc đặt cố định hay thả
nổi ở các vùng biển ít gió bão, sóng nhẹ nhƣ các vịnh, đầm phá. Tuy nhiên, cá mú
thƣờng gặp một số bệnh do vi sinh vật gây ra nhƣ: bệnh đốm đỏ, bệnh hoại sơ, bệnh
đƣờng ruột, bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết…[3]. Một trong những bệnh nguy
hiểm nhất do vius gây ra là bệnh hoại tử thần kinh, thƣờng xảy ra ở giai đoạn ấu
trùng và cá giống. Cá bị bệnh thƣờng có tỉ lệ chết cao và nhanh. Hiện nay chƣa có
thuốc đặc trị đối với bệnh này, biện pháp chủ yếu vẫn là phòng ngừa bằng cách đảm
bảo vệ sinh và cách ly với các nguồn virus tiềm tàng.
1.1.2. Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrocis - VNN)
Bệnh hoại tử thần kinh hay gọi là bệnh não và võng mạc do Betanodavirus
còn gọi là Piscine nodavirus gây ra [66]. Virus này ký sinh trong tế bào chất của tế
bào thần kinh trong não và trong võng mạc mắt. Bệnh xuất hiện ở nhiều loài cá biển
và phân bố rộng rãi ở nhiều vùng địa lý khác nhau [22]. Những chi tiết đầu tiên mô
tả về bệnh vào những năm 1989 - 1991, bệnh đƣợc phát hiện gần nhƣ đồng thời tại
Úc, Na Uy, Pháp và Nhật Bản [14],[15],[28],[41]. Bệnh VNN sau đó đã đƣợc phát
hiện trên 30 loài cá biển thuộc 14 họ trên vùng biển Thái Bình Dƣơng, khu vực Địa
Trung Hải, Scandinavia và Bắc Mỹ [24]. Bệnh thƣờng gặp ở cá nuôi lồng nhƣ cá
mú điểm đai (Epinephelus malabaricus) - Thái Lan, cá mú mỡ (E. tauvina) Singapore, cá mú vân mây (E. moara), cá mú chấm đỏ (E. akaara) - Nhật Bản, cá
mú bảy sọc (E. septemfasciatus) - Hàn Quốc, cá mú lƣng gù (Cromileptes altivelis)
- Indonesia. Khi nhiễm bệnh, cá thƣờng bỏ ăn, bơi lội mạnh không định hƣớng, đầu
chúc xuống dƣới, chết rải rác, có sự xung huyết trong não mà có thể nhìn thấy đƣợc.
Cá chết và hấp hối hầu hết đều có bóng hơi trƣơng phồng. Cá chết sau 3 - 5 ngày có
dấu hiệu bệnh, tỷ lệ chết 70 - 100% ở cá hƣơng (2,5 - 4 cm), khi cá lớn (15 cm) tỷ lệ
chết giảm còn 20%. Ở Việt Nam, các loài cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng
thƣờng gặp bệnh hoại tử thần kinh. Bệnh phát từ tháng 5 đến tháng 10, đặc biệt khi
mƣa nhiều, nhiệt độ thích hợp cho bệnh phát triển là từ 25 - 30oC [67].
6




Bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển tại Việt Nam đƣợc báo cáo lần đầu tiên
vào năm 2002 trên cá mú (Epinephelus spp) nuôi lồng ở Hạ Long - Quảng Ninh.
Kết quả điều tra ở huyện Vân Đồn, Quảng Ninh (2002) có số lồng bị bệnh. Bệnh
VNN phát triển mạnh vào mùa có nhiệt độ cao, ở nhiệt độ 28oC độc lực của virus
này mạnh hơn nhiều so với nhiệt độ 16oC [67].
Ở Khánh Hòa (2008), có khoảng 30% hộ nuôi cá biển chịu tác hại của bệnh
này. Giai đoạn cá nhỏ (5 - 20 cm) thƣờng chịu tác hại nặng hơn giai đoạn cá lớn. Tỷ
lệ chết có thể đến 50 - 100% và đây là bệnh không có mùa vụ rõ ràng. Cũng ở Khánh
Hòa vào tháng 7 năm 2008, ngƣời ta đã phát hiện bệnh VNN trên cá mú cỡ 5 - 6 cm
nuôi tại bè của trƣờng Đại học Nha Trang, bệnh lây lan rất nhanh và gây chết 100%
cá trong vòng một tuần. Khi cá trong lồng bị bệnh, ngƣời ta còn quan sát đƣợc một số
loài cá khác sống xung quanh lồng cũng có dấu hiệu tƣơng tự. Kết quả điều tra sơ bộ
của khoa Nuôi trồng thủy sản - Đại học Nha Trang cho thấy cá nuôi tại vùng biển
Khánh Hòa thƣờng gặp bệnh có dấu hiệu tƣơng tự nhƣ bệnh hoại tử thần kinh [4].
Vào tháng 5/2010, tại hai khu vực nuôi cá mú nƣớc lợ bằng lồng của chi hội
nghề cá Hƣơng Giang và chi hội nghề cá Thái Dƣơng Thƣợng Tây thuộc xã Hải
Dƣơng, huyện Hƣơng Trà, tỉnh Thừa Thiên Huế đã diễn ra hiện tƣợng cá mú đang
nuôi từ một đến hai tháng tuổi chết hàng loạt, số lƣợng thiệt hại ƣớc tính trên 25 vạn
con thả nuôi với tổng giá trị thiệt hại khoảng 450 triệu đồng. Cá bị bệnh có dấu hiệu
bỏ ăn, màu sậm, xƣơng sống cong lên, mắt lồi, bơi lòng vòng, chết rất nhanh, chết
đồng loạt.
Theo số liệu của Nguyễn Ngọc Du và cộng sự, đối với cá mú nuôi tại Vũng Tàu,
bệnh VNN thƣờng xảy ra trên cá giống, 53/64 mẫu bị nhiễm bệnh (tƣơng ứng 82,8%), tỷ
lệ chết do virus gây hoại tử thần kinh là từ 90 - 100% [2].
Một nghiên cứu của tác giả Phạm Thị Vân và Bùi Ngọc Thanh (2006) về VNN
trên cá song chấm nâu tại tỉnh Hải Phòng và Nghệ An cũng cho thấy có dấu hiệu của VNN
thông qua kết quả biểu hiện bệnh lý bên ngoài và kết quả nghiên cứu mô bệnh học [7].

8



1.2. VIRUS GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH (NERVOUS NECROSIS
VIRUS - NNV)
1.2.1. Nguồn gốc
Virus gây bệnh hoại tử thần kinh (NNV) thuộc giống Betanodavirus, họ
Nodaviridae. Tên gọi Nodavirus đƣợc bắt nguồn từ tên của một ngôi làng ở Nhật Bản là
Nodamura (hiện nay là thành phố Nodashi), nơi mà Nodavirus đƣợc phân lập đầu tiên
[52].
1.2.2. Bộ gen của Betanodavirus
1.2.2.1. Cấu trúc gen của Betanodavirus

Hình 1.2. Cấu trúc không gian của Betanodavirus
Betanodavirus không có màng bao, hình cầu, đƣờng kính 25 - 30 nm, 20 mặt
đối xứng, vỏ bao gồm 180 protein.
Bộ gen của Betanodavirus là RNA mạch đơn, sợi (+), tuyến tính hai phía, có
cấu trúc phân đoạn gồm hai tiểu phần RNA-1 và RNA-2.
- Tiểu phần lớn RNA-1 dài 3103 nucleotit mã hóa cho 2 protein: RNA
polymerase phụ thuộc RNA hay gọi là protein A (chứa khoảng 982 axit amin, khối
lƣợng phân tử ƣớc tính 110 kDa) và protein B (11 kDa).
10


- Tiểu phần nhỏ RNA-2 dài 1433 nucleotit mã hóa cho phân tử protein vỏ
lớn có kích thƣớc 42 kDa. Trên RNA-2 chứa một khung đọc mở mã hóa cho một
protein vỏ, có hai vùng bảo tồn cao là T2 (870 bp) và T4 (420 bp) [41],[53].

Hình 1.3. Cấu trúc gen của Betanodavirus
- Đôi khi bộ gen của Betanodavirus có sở hữu thêm một phân đoạn RNA3. RNA-3 là một hệ gen phụ (371 nucleotit) có chứa một khung đọc mở (ORF)
mã hóa protein B2 (giả thuyết là một protein không cấu trúc, có chức năng ức


20 - 25ºC

B

Tiger puffer

20ºC

necrosis virus)
TPNNV
(Tiger puffer nervous
necrosis virus)
BFNNV
(Barfin flounder

C

Các loài cá nƣớc lạnh: Atlantic
halibut, Atlantic cod, flounders...

15 - 20ºC

nervous necrosis virus)
RGNNV
(Red-spotted grouper
nervous necrosis virus)

Các loài cá nƣớc ấm: Groupers,
C

nucleotit 2753 đến 2980 là đoạn gen mã hóa cho protein B có kích thƣớc 75 axit
amin, kích thƣớc protein này tƣơng đƣơng giữa nhiều loài NNV ở những kiểu gen
khác nhau, vai trò của protein B trong quá trình tái bản của NNV chƣa đƣợc làm rõ.
RNA-2 của RGNNV có kích thƣớc 1434 bp, trong đó từ nucleotit 27 đến 1043 mã
hóa cho protein vỏ của virus có kích thƣớc 338 axit amin. Hai vùng 5' NCR và 3'
NCR có kích thƣớc lần lƣợt là 26 nucleotit và 390 nucleotit. Khối lƣợng phân tử
ƣớc tính của RNA-2 là 459.025 Da và mã hóa cho protein capsid khối lƣợng
khoảng 37.004 Da [16],[36],[45],[58].
1.2.3. Cơ chế gây bệnh của Betanodavirus
1.2.3.1. Sự xâm nhập của virus
Những tổn thƣơng mô bệnh học liên quan tới nhiễm Betanodavirus đều
chứng minh một cách rõ ràng rằng virus tấn công trƣớc tiên vào hệ thần kinh
trung ƣơng (CNS) và võng mạc, nơi có vị trí tái bản của nó. Tuy nhiên còn có

13


những quan điểm khác nhau về con đƣờng cũng nhƣ phƣơng thức lây truyền của
NNV trong cơ thể cá.
Theo Nguyen và cộng sự (1996), một trong số những điểm tái bản đầu tiên
có thể là ở tủy sống. Từ đó virus có thể tới não đầu tiên và sau đó là tới võng mạc
thông qua dây thần kinh thị giác [46].
Munday (1992) và Grotmol (1999) lại đƣa ra giả thuyết rằng lớp biểu mô
phân tầng của ruột trƣớc có thể là điểm tái bản đầu tiên của virus. Virus đƣợc đƣa
vào thông qua nƣớc và thức ăn, ở đây chúng dễ dàng tƣơng tác và thông qua dây
thần kinh sọ não, virus có thể đƣợc đƣa đến não và gây bệnh tích điển hình tại đây
[29],[43].
Ngoài ra, Mladineo (2003) còn phát hiện kháng nguyên ở thùy khứu giác,
điều ấy cho thấy khoang mũi cũng có khả năng là một đƣờng vào của virus bên
cạnh đƣờng qua mang, miệng, da (Peducasse, 1999) [40],[50].

phân lập đƣợc virus từ nguồn thức ăn hàng ngày cho cá nhƣ: Artemia salina,
Tigriopus japonicas, Acetesinte medius và khẳng định đó cũng là một trong những
nguồn lây nhiễm virus [19]. Những nghiên cứu của Mori (2005) tiếp đó cũng đã
củng cố thêm cho nhận định trên. Ngoài ra, việc những con cá trong cùng một bể
nuôi ăn thịt lẫn nhau cũng đƣợc xem nhƣ là một con đƣờng lây nhiễm virus [38].
b) Sự truyền bệnh theo phương dọc
Giả thuyết về sự lây truyền theo phƣơng dọc đƣợc đƣa ra khi Arimoto (1992)
phát hiện thấy virus ở trứng đã thụ tinh của striped jack bằng phƣơng pháp ELISA
[8]. Liên tục tiếp đó là những phát hiện tƣơng tự bằng phƣơng pháp PCR và IFAT
đƣợc báo cáo. Một số báo cáo cũng chứng tỏ sự truyền theo phƣơng dọc đã đƣợc
phát hiện ở cá chẽm châu Âu, cá bơn Nhật Bản, cá chẽm châu Á [11],[21],[61].

15