XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN GÂY BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH NERVOUS NECROSIS
VIRUS TRÊN CÁ CHÌNH NUÔI TẠI THỪA THIÊN HUẾ
Phạm Thị Tâm
1
, Phạm Công Hoạt
2
, Nguyễn Quang Linh
3
1
Khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội
2
Bộ Khoa học và công nghệ
3
Trường Đại học Nông lâm Huế
TÓM TẮT
Từ 30 mẫu cá chình thu thập ở vùng biển Thừa Thiên- Huế nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh đã phát hiện
được 4 mẫu có bệnh tích ở mô não cũng như bệnh tích trên tế bào mẫn cảm GS. Bằng phương pháp giải trình tự
vùng biến đổi T4 trên RNA2 đã xác định được 04 chủng này thuộc nhóm viếu gây bệnh hoại tử thần kinh trên cá
chình Châu Âu (European Nervous Necrosis Virus )
Từ khóa: cá chình, vùng biến đổi T4, European Nervous Necrosis Virus
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh hoại tử thần kinh (Nervous necrosis disease) do Nervous Necrosis Virus- NNV là
bệnh cấp tính, xuất hiện trên 22 loài cá, trong đó có các loài: mú (Epinephelus sp.), cá chình
(Anguilla anguilla), chẽm (Lates calcarifer), giò (Racycentron canadum). Bệnh chủ yếu trên cá
giống, tỷ lệ chết có thể lên đến 90 – 100%.
Hầu hết những nghiên cứu về VNN đều cho thấy: mô đích của NNV là hệ thần kinh trung
ương (gồm não và tuỷ sống) và võng mạc [5]. Virus này gây hoại tử các nơron thần kinh dẫn đến
những biểu hiện bất thường như bơi không định hướng, chủ yếu theo hình trôn ốc hoặc lao
thẳng, nhanh về phía trước [5].
NNV được xác định loài dựa vào trình tự của vùng biến đổi nằm trên phân tử RNA2 mã
hóa protein vỏ của virus. Tại Việt Nam, virus này đã được xác định trên cá mú [1], trong nghiên

0
C,
hàng ngày bổ sung môi trường nuôi cấy tế bào và quan sát CPE.
2.2.4 Phương pháp xác định liều gây chết 50% tế bào (TCID
50
)
Tế bào GS được nuôi cấy để đạt mật độ khoảng 5x10
5
/ml trong đĩa 96 giếng rồi bổ sung
20 µl dịch virus được pha loãng ở các nồng độ khác nhau theo hệ số 10. Giữ đĩa nuôi cấy trong
tủ ấm 37
0
C trong 1h để virus hấp phụ lên tế bào rồi tiếp tục bổ sung 80 µl môi trường Leibovit' L
15 5-10% huyết thanh bào thai. Nuôi cấy virus ở nhiệt độ 25-30
0
C, hàng ngày bổ sung môi
trường nuôi cấy tế bào và quan sát CPE. TCID50 được xác định theo công thức của Reed và
Muench (1938).
2.2.5 Phương pháp RT-PCR
ARN tổng số của NNV được tách bằng kit Quick Prep Total RNA Isolation (Pharmacia
biotech). ADN bổ sung được tạo thành từ phản ứng RT- PCR với bộ kit RT-PCR (Pharmacia
biotech) và cặp mồi PCR F2 – R3 (invitrogen). Phản ứng được thực hiện với 30 chu kỳ theo các
chu trình nhiệt: 90
0
C/5 phút, 55
0
C/45 giây, 72
0
C/1 phút. Sau đó, phản ứng được tiếp tục ở
72

7.5
, 10
7.2
, 10
5.3
.
Như vậy, 04 mẫu các cá chình ký hiệu A-HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17 bị
nhiễm virus, 26 mẫu bệnh phẩm còn lại không gây bệnh tích tế bào và có thể kết luận các mẫu
này hoàn toàn không có Betanodavirus.
Hình 3.2 Bệnh tích của tế bào GS sau khi gây nhiễm các mẫu cá bệnh
3.2 Xác định loài virus gây bệnh trên cá chình bằng phương pháp giải trình tự gen
Cấu trúc genome của NNV gồm 02 phân tử RNA1 và RNA2, trong đó RNA1 mã hóa
enzyme RNA polymerase có tính đặc trưng cho họ Betanodavirus. Còn RNA2 mã hóa
glycoprotein cấu tạo vỏ virus mang tính đặc trưng cho từng loài NNV, có kích thước 1,410 base,
trong đó chứa một vùng bảo thủ trình tự xác định 93% và một vùng biến đổi có trình tự xác định
là 62%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định trình tự vùng biến đổi T4 của gen mã hóa
protein vỏ của 04 chủng virus phân lập.
Cặp mồi F2 (5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’) và R3 (5’-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3’)
được sử dụng để tách dòng đoạn gen T4 kích thước khoảng 400bp ở 04 chủng virus ký hiệu A-
HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17. Các trình tự gen được xác định bởi hệ thống giải trình
tự ABI 3110 PRISM (Perkin- Elmer) đồng thời tham khảo 03 trình tự gen sẵn có của GeneBank
(bảng 3.1) để so sánh mối tương quan chéo về mặt di truyền của các chủng cho kết quả như sau:
Bảng 3.1 Môi quan hệ chéo về tỷ lệ trình tự gen T4 của 04 chủng virus phân lập từ
cá chình nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh
Ghi chú:
• A-HUI01, A-HUI06, A-HUI12 và A-HUI17: các chủng virus phân lập từ cá chình
nghi mắc bệnh hoại tử thần kinh
• ENNV: European Nervous Necrosis Virus (Chi,và cộng sự, 2003)
• GNNV: Grouper Nervous Necrosis Virus (Chi,và cộng sự, 2003)
• JFNNV: Japanese Flounder Nervous Necrosis Virus (Nishizawa và cộng sự, 1995)