09/02/2015

Phần 1
Chuyên đề

Ứng dụng CNSH để khai thác
các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học

Hệ thống trao đổi chất
ở sinh vật

06/02/2015

Trao đổi sơ cấp
• Trao đổi chất sơ cấp là một loại trao đổi chất liên quan trực tiếp
đến sự sinh trưởng, phát triển và sinh sản bình thường của sinh
vật. Trao đổi chất sơ cấp liên quan trực tiếp đến các chức năng
sinh lý bình thường của sinh vật.
• Quá trình chuyển hóa xảy ra bên trong một tế bào hoặc một sinh
vật cần thiết để duy trì hoạt động sống. Trong trao đổi chất nhiều
chất bị phân giải để thu nhận năng lượng trong khi những chất
khác cần thiết cho sự sống lại được tổng hợp.
• Trao đổi chất sơ cấp xảy ra ở tất cả các sinh vật, mang tính đặc thù
loài, tế bào, mô.
• Ngược lại, trao đổi chất thứ cấp không liên quan trực tiếp đến các
quá trình trên nhưng có vai trò về chức năng sinh thái. Trao đổi
chất sơ cấp có mặt ở một số taxon (thực vật, nấm, vi khuẩn…).

•
•
•

Metabolic control analysis
Metabolome
Metabolomics (the study of global metabolite
profiles in a system (cell, tissue, or organism)
under a given set of conditions.

• Là một loạt các phản ứng hóa học xảy ra trong
một tế bào thường được xúc tác bởi enzyme, ion
kim loại, vitamin, cofactor.
• Tập hợp các con đường trao đổi chất đan xen với
nhau được gọi là mạng lưới trao đổi chất.
• Các con đường trao đổi chất giúp duy trì mối cân
bằng động bên trong tế bào hoặc cơ thể.
• Catabolic pathway (con đường dị hóa) và
Anabolic pathway (con đường đồng hóa) trái
ngược nhau. Con đường đồng hóa tạo ra các
phân tử sinnh học mới.

1


09/02/2015

Trao đổi chất…
• Một con đường trao đổi chất liên quan đến sự biến đổi từng
bước của một phân tử ban đầu thành sản phẩm khác. Sản
phẩm trao đổi chất có thể được sử dụng theo 3 cách:
 Sử dụng ngay, khi sản phẩm cuối cùng của con đường trao đổi chất
vừa được tạo ra.
 Khởi động con đường trao đổi chất khác (tiền chất cho con đường



09/02/2015

Trao đổi chất kị khí

Metabolic pathways

Các thành phần chính của con đường trao đổi
chất và chất trao đổi sơ cấp

•
•
•
•
•
•

Trao đổi chất thứ
cấp

Amino acids and proteins
Lipid
Carbohydrates
Nucleotides
Coenzymes
Minerals and cofactors

Shikimic acid pathway


Tương tác protein – protein
• Calmodulin (CALcium MODULted proteIN)
– Gắn Ca++ với calmodulin dẫn đến thay đổi hình
dạng và cho phép gắn và hoạt hóa một số enzyme

4


09/02/2015

Gắn calcium vào Calmodulin thay đổi hình
dạng protein
Unbound Calmodulin on left
Calcium bound Calmodulin
on right. Stars indicate
exposed non-polar ‘grooves’
that non-covalently binds
proteins

Điều hòa hoạt động enzyme bằng tương tác
cộng hóa trị
• Enzymes activating enzymes allows for
amplification of a small regulatory signal

Điều hòa bởi tương tác cộng hóa trị
Phosphorylation và Dephosphorylation
• Gắn hoặc loại bỏ nhóm Phosphate (serine,
threonine, or tyrosine)  thay đổi hoạt tính
enzyme


Những nhóm hợp chất tự nhiên quan trọng

Định nghĩa
• Terpenoid: tổng hợp từ Acetyl-CoA theo con đường

•

Là hợp chất hóa học được tạo ra một cách tự nhiên bởi sinh vật

mevalonic (sesquiterpene và các dẫn xuất)

có hoạt tính sinh dược học sử dụng để sản xuất dược phẩm,

• Phenol/polyphenol: những hợp chất chứa vòng thơm

thuốc…
•

được tổng hợp theo con đường acid shikimic hoặc acid

Hợp chất tự nhiên cũng bao gồm các hợp chất được tổng hợp

malonic (flavonoid)

hoàn toàn bằng con đường hóa học với các đặc điểm và tính

• Hợp chất chứa nitơ: từ các amino acid (alkaloid)

chất giống với các hợp chất được tổng hợp bởi sinh vật.


Tubulin và chất gắn với tubulin
•

Vi ống là những protein dạng sợi được cấu
tạo từ tubulin. Trong quá trình phân bào, các
NST gắn vào vi ống để di chuyển về phía
trung tử.

•

Các tế bào ung thư phân chia rất mạnh. Nếu
can thiệp vào quá trình gắn của các vi ống với
NST sẽ ức chế quá trình nhân lên của tế bào
ung thư.

•

Gắn với tubulin sẽ ức chế được tế bào ung

Tương tác của các chất
gắn tubulin sẽ dẫn đến
thay đổi cấu trúc và ảnh
hưởng đến chức năng của
tế bào

thư.

Topoisomerase

Topoisomerase

Mô thực vật
Sinh vật biển (rong, tảo)
Động vật (trên cạn, biển)
Nọc độc
Nấm/vi nấm
Vi sinh vật

Những khó khăn trong khai thác
các hợp chất tự nhiên
• Chỉ có mặt ở một số loài sinh vật nhất định
• Chỉ có hoạt tính trong điều kiện nuôi trồng tự
nhiên
• Chỉ có hoạt tính khi ở dạng cấu trúc nhất định, các
dạng đồng phân khác không có hoạt tính hoặc
hoạt tính thấp
• Cải biến đặc hiệu vị trí bằng con đường hóa học
rất khó khăn (gắn các nhóm chức).
• Hàm lượng thấp, khó tinh sạch

8


09/02/2015

Khai thác hợp chất tự nhiên
Lên men vi sinh vật
Nuôi cấy mô tế bào thực vật
Nuôi vi tảo
Khó khăn: hoạt tính thấp hoặc không
có hoạt tính


Các con đường tổng hợp

Vi khuẩn

MVA hoặc MEP

Vi khuẩn cổ

MVA

Tảo lục

MEP

Thực vật

Shikimic, MVA, MEP

Động vật

MVA

Nấm

MVA

MVA và MEP

9


Làm thế nào để có tiền chất?
Plants

Mevalonate
pathway
(MEP)

Microalgae

Microbe

Sikimic acid
pathway

Công nghệ sinh học trong sản xuất
hợp chất tự nhiên

Non-mevalonate
pathway (MVA)

Tế bào có nhiều con đường trao đổi chất  có thể thu
được tiền chất

Nguồn gene
Khai thác dữ liệu
Các con đường trao đổi chất

Chuyển gene
mong muốn


UV-vis
HPLC
Spectrofluorometer
NMR
MALDI MS

– Thực vật: photobioreactor
– Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men

• Chuyển gene
– Thực vật: photobioreactor
– Vi sinh vật (nấm, vi tảo): lên men

Nâng quy mô lớn

Phát triển sản phẩm

10


09/02/2015

Reference data, Martin et al., 2001; Jackson et al., 2003; Martin et al., 2003; Ro et al., 2006; Takahashi et al., 2007, Asadollahi et al.,
2008; Wang et al., 2011a; Albertsen et al., 2011; Peralta-Yahya et al., 2011; Westfall et al., 2012

Ví dụ

Artemisinin


Ví dụ: Sản xuất axit glutamic

Nắm được các con đường trao đổi chất
(khai thác các CSDL)

Nakamura J et al. Appl. Environ. Microbiol. 2007;73:4491-4498

11


09/02/2015

Terpene production in E. coli: FPP source of host cell
Mevalonate vector

Acetyl-CoA

Pyruvate

Glyceraldehyde-3-phosphate

Acetyl-CoA

Acetyl-CoA acetyltransferase

pAC-Mev

Ptac

DXP synthase

HMG-CoA
synthase genes

2NADPCoA

MVA
ATP

MVA kinase
ADP

CDP-ME

ATP

DPMVA decarboxylase

Terpenoids

HMB-PP synthase

HMB-PP

DPMVA

IPP
isomerase

Sesquiterpene



MEcPP
ADP

Cmr
P15A ori

ATP

CDP-ME kinase
Mevalonolacto
ADP
CDP-ME-2-phosphate
ne

PMVA

8.5 kbp

Cải biến hóa học
Chuyển hóa bằng enzyme

Pi

ATP

PMVA kinase

pAC-Mv


quinone and cell wall
biosynthesis

Cytochrome P450

Cytochrome P450
Hệ thống enzyme oxy hóa khử vô
cùng hiệu quả

• Phản ứng phổ biến được xúc tác bởi P450 là phản ứng
monooxygenase (đưa một nguyên tử oxy vào cơ chất, trong khi
nguyên tử oxy khác sẽ bị khử thành nước).

• P450s được rất nhiều các nhà nghiên cứu quan tâm
• P450s sử dụng trong các phản ứng oxy hóa vào những vị trí khó
(tổng hợp hoặc chuyển hóa hóa học không thể thực hiện được).
1.
2.

Phản ứng oxy hóa định hướng (stereospecific conversion )
Có khả năng đưa nguyên tử oxy vào các vị trí liên kết đôi hoặc các liên kết
C-H chưa hoạt hóa, hoặc các vị trí nguyên tử C đã bão hòa (allylic
positions)

Tỉ lệ các thuốc kháng nấm được chuyển hóa bởi
enzyme Cytochrome P450

12




Deer tick

Cytochrome P450

Valencene

Nootkatone

13


09/02/2015

Chuyển hóa valencene thành nootkatone

Sử dụng vi tảo làm Bioreactor

Mục đích
• Sử dụng hệ thống tế bào để chuyển hóa các hợp
chất ít giá trị thành các hợp chất có giá trị cao
hơn nhiều.
• Ứng dụng để tạo ra các hợp chất mới có hoạt tính
sinh học cao hơn, giá thành rẻ hơn.
• Phát triển các sản phẩm ứng dụng trong nông
nghiệp, bảo vệ thực vật, thuốc, mỹ phẩm…

Hướng tiếp cận
• Khai thác cơ sở dữ liệu các hợp chất và các gene chuyển hóa cũng
như con đường chuyển hóa các chất đó.

kinase isomerase reductase synthase

DPMVA
decarboxylase

Removal of the
HMG-CoA
reductase and
HMG-CoA
synthase genes

Gene mong muốn:
Tách dòng từ các nguồn tự nhiên
Đặt tổng hợp từ các công ty (synthesized genes)

Cmr

pAC-Mv

Sử dụng các hệ thống vector biểu
hiện tương ứng ở các tế bào chủ khác
nhau.

P15A ori

8.5 kbp
TrrnB
IPP
DPMVA
PMVA

Chuyển gene vào nấm men
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản
• Có thể chuyển nhiều gene xen nhập vào
genome thông qua trao đổi chéo các đoạn
tương đồng
• Tốc độ sinh trưởng nhanh
• Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường
• Khó khăn: Dễ lẫn tạp, môi trường nuôi cấy chi
phí cao. Các con đường chuyển hóa hạn chế,
cần phải cung cấp tiền chất

Chuyển gene vào thực vật
•
•
•
•

Sự phức tạp của hệ thống biểu
hiện gene ở thực vật
Mỗi gene chịu sự kiểm soát của 1
promoter
Kết hợp sử dụng hệ thống tái tổ
hợp ở nấm men để chuyển nhiều
gene vào 1 vector
Ưu điểm: Con đường trao đổi
chất rất phong phú

CaMV 35S promoter
HindIII (11702)
PstI (11694)

AvaI (2485)

pCAMBIA-INO

NptII (Neomycin resistance)

AvaI (3115)

12463 bp

ClaI (8945)
AvaI (8913)

Left border
AvaI (4246)

Kanamycin resistance

AvaI (4726)
ApaLI (6995)

ClaI (5550)

ApaLI (6497)

Chuyển gene vào vi tảo
• Quy trình chuyển gene tương đối đơn giản
• Tốc độ sinh trưởng nhanh, ít lẫn tạp, môi
trường nuôi rẻ. Dễ dàng nâng quy mô lớn
• Dễ dàng tiết ra ngoài môi trường