BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
….WUX….

LÊ THỊ THU HÀ

ĐỊNH LƯỢNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VIRUS PRRS
TRÊN ĐÀN HEO GIỐNG TỈNH ĐỒNG NAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành Phố Hồ Chí Minh
Tháng 12/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
**********

LÊ THỊ THU HÀ

ĐỊNH LƯỢNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VIRUS PRRS
TRÊN ĐÀN HEO GIỐNG TỈNH ĐỒNG NAI

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60.42.80
LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Hướng dẫn Khoa học:
1. PGS.TS TRẦN THỊ DÂN
2. TS. NGUYỄN ĐÌNH QUÁT



PGS.TS TRẦN THỊ DÂN
Hội Thú Y Việt Nam

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên Lê Thị Thu Hà sinh ngày 07 tháng 07 năm 1974 tại Phú Yên. Con
Ông Lê Văn Luân và Bà Đặng Thị Tâm.
Tốt nghiệp tú tài tại Trường phổ thông trung học Trần Quốc Tuấn, tỉnh Phú
Yên năm 1991.
Tốt nghiệp Đại học ngành Chăn nuôi –Thú y hệ chính quy tại trường Đại học
Tây Nguyên, năm 1998.
Tháng 09 năm 2007 đến nay theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại
trường Đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
Tháng 07/1998 – 02/2000 làm việc tại Dự án phát triển cộng đồng (VnPlus)
thuộc huyện Định Quán – Đồng Nai, phụ trách huấn luyện kỹ thuật Chăn nuôi –
Thú Y cho nông dân vùng Dự án.
Tháng 02/2000 – 01/2003: Công tác tại Phòng Khoa học, Trung tâm NC và
HLCN Bình Thắng -Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.
Tháng 01/2003 – 06/2006: Công tác tại Phòng Di truyền giống vật nuôi –
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.
Tháng 07/2006 đến nay công tác tại Phòng Công nghệ Sinh học – Viện Khoa
học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam.
Tình trạng gia đình: họ và tên chồng là Lê Việt Khoa, nghề nghiệp chuyên
viên Thẩm định giá, kết hôn năm 2005, con gái tên là Lê Thu Giang sinh năm 2006.

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông lâm, Ban chủ nhiệm và Thầy Cô giáo
Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Chăn nuôi – Thú Y, Phòng Đào tạo sau đại học
đã giảng dạy, truyền đạt kinh nghiệm, kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cũng như
những hỗ trợ khác để chúng tôi hoàn thành khóa học.
Ban Giám đốc Viện KHKTNNMN, lãnh đạo Phòng CNSH, TS Chung Anh
Dũng đã tạo điều kiện cho tôi tham gia khóa học và hoàn thành luận văn này.
TS Phạm Hùng Vân và các bạn Ngọc, Trang, Yến… phòng RD - Cty Nam
Khoa đã hỗ trợ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài.
Các trại heo giống Hố Nai, Vĩnh Cữu, Gia Kiệm, Trảng Bom và Anh Lê Việt
Trương đã tạo điều kiện cho tôi thu thập mẫu để phục vụ thí nghiệm. Các bạn Thu
Phương (Navetco), Khánh Hưng (ĐHNL), Thu Hương, Thu Hường (Chi cục thú y
Tp.HCM), Khánh Tùng (Viện Thú Y), tập thể lớp Cao học K.2007 và các bạn đồng
nghiệp Viện KHNNMN đã giúp đỡ và động viện tôi trong suốt quá trình học tập.
Xin gửi đến lời biết ơn và lòng yêu thương chân thành nhất đến chồng và con
tôi vì đã luôn động viên, giúp đỡ cho tôi trong công tác và hoàn thành luận văn này.
Chân thành cám ơn
Lê Thị Thu Hà

iv


TÓM TẮT
Đề tài “Định lượng và giải trình tự của virus PRRS trên đàn heo giống
tỉnh Đồng Nai” được tiến hành tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam
và Cty Nam Khoa từ tháng 6/2009 – 9/2010. Đề tài được thực hiện với 3 nội dung
nhằm phát hiện, định lượng và xác định đặc tính di truyền của virus thực địa, từ đó
hỗ trợ cho việc phát hiện sớm và phòng chống dịch PRRS một cách hiệu quả hơn.
Kết quả thu được gồm:
Cặp mồi và mẫu dò Taqman được sử dụng trong quy trình real-time RT-PCR
cho phép phát hiện và định lượng virus PRRS trên hai dòng Bắc Mỹ (NA), Châu Âu

Primer and Taqman described by Lurchachaiwong et al (2008) and
Kleiboeker et al (2005) were used in the protocol. The detection limit of the assay
was approximately 102/ml copies of EU-strain RNA (from Amervac-vaccine virus),
and 103/ml copies of NA-strain RNA (from the cell culture liquid of LMY/2002
strain).
Of the 50 samples tested by real-time RT-PCR using Taqman, 22 samples
were NA-strain positive, 19 samples EU-infected, and 7 samples positive to both
NA and EU. The detected quantities of RNA copies in samples were highest at 108
copies/ml and lowest 102 copies/ml for NA strain. With EU geneotype, quantities of
RNA copies in samples were highest at 107/mll and lowest 102/ ml copies. The
range was 102 - 104 copies/ml as samples infected with both NA and EU geneotype.
Only NA geneotype was used for phylogenetic analysis. Sequence analysis
revealed that these collections shared a close relationship with Chinese virulent
PRRSV and 07QNVN isolated in Vietnam in 2007 as well as JXA-1 vaccine virus
(95,2 -100%). All three samples collected from Dong Nai, Binh Duong and Ho Chi
Minh City were identical 95,2 – 98,5 %, and only 85,2 – 88% to commercial
vaccine.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang chuẩn y ...............................................................................................................i
Lý lịch cá nhân ........................................................................................................... ii
Lời cam đoan ............................................................................................................. iii

2.4.2 Phân biệt chủng virus PRRS dựa vào giải trình tự ..........................................21
2.5 Lượt khảo các công trình nghiên cứu về PRRS tại Việt Nam ............................22
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................25
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................25
3.1.1 Thời gian ..........................................................................................................25
3.1.2 Địa điểm. ..........................................................................................................25
3.2 Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................25
3.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị................................................................................25
3.3.1 Vật liệu mẫu:. ...................................................................................................25
3.3.2 Hóa chất nghiên cứu.........................................................................................27
3.3.2.1 Hóa chất tách chiết RNA...............................................................................27
3.3.2.2 Hóa chất dùng trong phản ứng RT-PCR và real-time RT-PCR....................27
3.3.2.3 Hóa chất và kít điện di Chip..........................................................................28
3.3.2.4 Hóa chất tinh sạch sản phẩm RT-PCR ..........................................................28
3.3.3 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ........................................................................29
3.4 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................29
3.4.1 Thu thập mẫu....................................................................................................29
3.4.2 Tách chiết RNA................................................................................................29
3.4.3 Khuếch đại vùng gene ORF7 bằng kỹ thuật RT-PCR .....................................29
3.4.4 Thực hiện real-time RT-PCR định tính với RNA chuẩn dựa vào ORF7 .........30
3.4.5 Định lượng virus PRRS trong mẫu thực địa bằng real-time RT-PCR .............31
3.4.6 Giải trình tự chuỗi ORF5 và xây dựng cây sinh dòng .....................................32
3.4.6.1 Khuếch đại gene ORF5 .................................................................................32
3.4.6.2 Giải trình tự gene ORF5 trên hai dòng NA, EU ...........................................33

viii


3.4.6.3 Phân tích trình tự chuỗi và xây dựng cây sinh dòng .....................................33
3.5 Phân tích dữ liệu..................................................................................................35

Threshold cycle

EAV

Equine arteritis virus

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

EU

European

IC

Internal control

IFA

Indirect flourescent antibody

IPMA

Immunoperoxidase monolayer assay


PCR quantitative

nRT-PCR

Nested reverse transcriptase

RT-PCR

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

SHFV

Simian hemorrhagic fever virus

SIRS

Swine infertility and respiratory syndrome

SN

Serum neutralization

SQ

Starting quantity

TBE

Tris borate EDTA


Hình 4.4: Biểu đồ khuếch đại mẫu chuẩn ở 3 độ pha loãng..................................... 39
Hình 4.5: Đường chuẩn tuyến tính các độ pha loãng dòng EU ............................... 40
Hình 4.6:Biểu đồ khuếch đại của các độ pha loãng từ 10-3 đến10-8 ......................... 40
Hình 4.7: Đường chuẩn tuyến tính dựa vào 3 độ pha loãng chuẩn dòng NA .......... 41
Hình 4.8: Kết quả real-time RT-PCR kênh HEX dòng NA giữa chuẩn và mẫu ...... 42
Hình 4.9: Kết quả real-time RT-PCR dòng EU kênh FAM giữa chuẩn EU và mẫu 42
Hình 4.10: Tương quan giữa mật độ hùynh quang và Ct dòng NA ......................... 44
Hình 4.11: Tương quan giữa mật độ huỳnh quang và Ct dòng EU.......................... 45
Hình 4.12: Tương quan giữa mật độ huỳnh quang và Ct 2 dòng EU và NA ........... 46
Hình 4.13: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại dòng NA ..................................... 47
Hình 4.14: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại dòng EU ..................................... 48
Hình 4.15: Cây sinh dòng của virus PRRS dựa vào vùng ORF5 ............................. 54

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (porcine reproductive and
respiratory syndrome – PRRS) là bệnh truyền nhiễm lây lan nhanh, xảy ra trên heo
mọi lứa tuổi, ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế của ngành chăn nuôi heo công
nghiệp trên toàn cầu. Tại Việt Nam dịch PRRS chính thức bùng nổ năm 2007, hiện
vẫn đang diễn biến phức tạp trên các tỉnh trong toàn quốc.Tính đến 25/9/2010 dịch
PRRS bùng phát trở lại với 32 tỉnh thành công bố dịch, trong đó có Đồng Nai.
Để phát hiện virus PRRS, các phương pháp huyết thanh học, nuôi cấy tế bào
được sử dụng phổ biến. Gần đây kỹ thuật RT-PCR đã được áp dụng rộng rãi do
những tính ưu việt của nó, tuy nhiên, RT-PCR cũng cho kết quả dương tính giả.
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, kỹ thuật real-time RT-PCR đã được
áp dụng để khắc phục những hạn chế của các phương pháp huyết thanh học, phân

virus PRRS trên đàn heo giống Tỉnh Đồng Nai” là cần thiết thực nhằm phát hiện
sớm lượng nhiễm virus, và đặc điểm của virus thực địa thông qua kết quả định trình
tự chuỗi sẽ giúp hiếu biết thêm về đặc điểm dịch tễ, đánh giá được khuynh hướng
biến đổi di truyền của chủng virus thực địa và góp phần nâng cao hiệu quả sử dụng
vaccine, giảm thiệt hại kinh tế.
1.2 Mục tiêu của đề tài
- Ứng dụng real-time RT-PCR trong việc phát hiện mẫu nhiễm và định lượng
virus PRRS trên heo.
- Xác định đặc tính di truyền dựa trên vùng ORF5 của virus gây bệnh trên đàn
heo giống tỉnh Đồng Nai.
1.3 Yêu cầu của đề tài
- Thăm dò quy trình real-time RT-PCR với RNA chuẩn của virus PRRS.
- Định lượng virus PRRS dựa trên ORF7 bằng quy trình real-time RT-PCR
đã thiết lập.

2


- Giải trình tự chuỗi ORF5 của virus PRRS trên mẫu ở Đồng Nai và hai địa
phương lân cận, từ đó so sánh với các chủng trên thế giới từ Ngân hàng gene.

3


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS)
Hội chứng PRRS xảy ra trên heo mọi lứa tuổi, triệu chứng biểu hiện trên heo
nái với đặc điểm sẩy thai ở giai đoạn mang thai cuối, làm chết thai, heo con sinh ra
yếu, tỉ lệ chết cao ở heo sơ sinh, nái phối nhiều lần không đậu. Biểu hiện rối loạn

ta và từ đó đến nay dịch vẫn liên tục xảy ra ở một số đại phương trong cả nước.
Tính đến ngày 25/9/2010 cả nước có 32 tỉnh là là Nghệ An, Cao Bằng, Sóc Trăng,
Tiền Giang, Long An, Bình Dương, Bạc Liêu, Quảng Nam, Đồng Nai, Bình Phước,
Đà Nẵng, Vĩnh Long, Khánh Hòa, Đăk Lăk, Hậu Giang, Lâm Đồng, Tây Ninh, Bà
Rịa Vũng Tàu, An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Kiên Giang, Cà Mau,
Kon Tum, Đăk Nông, Gia Lai, Trà Vinh, Bình Thuận, Ninh Thuận và Phú Yên có
dịch PRRS chưa qua 21 ngày (Cục Thú Y tháng 9/2010).
2.2 Virus PRRS
Virus PRRS thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades cùng
với virus gây viêm động mạch trên ngựa (Equine arteritis virus- EAV), virus gây sốt
xuất huyết trên khỉ (Simian hemorrhagic fever virus -SHFV) và virus gây tăng men
lactate dehydrogenease chuột (Lactase dehydrogenease elevating virus - LDV)
(Thiel và cs, 1993; Cavanagh, 1997; Dea và cs, 2000).
2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc của virus PRRS
Virus PRRS là virus sợi đơn, thẳng, có vỏ bọc với đường kính 50 – 60 nm, bề
mặt khá nhẵn và có lõi nucleocapsid hình khối với đường kính 25 – 35 nm
(Cavanagh, 1997; Cho và Dee, 2006; Zimmerman và cs, 2006).
Các ORF của bộ gene mã hóa cho sáu protein cấu trúc của virus lần lượt là
GP2, GP3, GP4, GP5, M, N. Trong đó GP5, M và N là 3 protein cấu trúc chính;
GP2, 3 và 4 là những protein cấu trúc thứ cấp. Trình tự ORF5 của hai dòng virus
Châu Âu và Bắc Mỹ có sự khác biệt lớn nhất, do đó protein GP5 (25kDa) là protein
cấu trúc khác biệt nhiều nhất và chỉ có khoảng 51 -55% acid amin (aa) tương đồng.

5


Trong khi đó protein M (do ORF6 mã hóa), có khối lượng 18 kDa, không liên kết
với phân tử đường, là protein ổn định nhất, có 78- 81% aa tương đồng. Protein M có
rất nhiều trong lưới nội chất, hình thành các phân tử dị hợp liên kết với GP5 bằng
cầu nối disulfide. Các phân tử dị hợp này không liên kết chặt chẽ trong hạt virus và

Gene mã hóa RNA polymerase

Các gene cấu trúc

ORF1a, ORF1b: Protein không cấu trúc
ORF2a, ORF3, ORF4 (GP2, GP3, GP4): Protein màng
ORF5 (E): Protein vỏ ngoài
ORF6 (M): Protein gian màng
ORF7 (N): Protein Capsid

Hình 2.1: Cấu trúc bộ gene virus PRRS
(www.porcilis-prrs.com/images/genome.jpg)
2.2.2 Phân loại dòng virus
Hiện nay, virus PRRS đã được xác định với hai kiểu gene chính, đó là kiểu
gene có nguồn gốc từ châu Âu (EU- type 1) và kiểu gene có nguồn gốc từ Bắc Mỹ
(NA- type 2) (Meulenberg và cs, 1993; Nelsen và cs, 1993; Murtaugh và cs, 1995;
Nelsen và cs, 1999). Nhiều báo cáo về so sánh chuỗi gene đã cho thấy sự khác biệt
di truyền quan trọng giữa hai nhóm này. Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gene NA, mặc
dù một số báo cáo cho thấy đã phân lập được kiểu gene EU (Ropp và cs, 2004). Ở
Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gene trên đã được xác định. Tuy nhiên, bên trong
mỗi kiểu gene lại có sự khác nhau giữa các chủng. Sự khác nhau này phụ thuộc vào
sự khác nhau trong chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng virus.

7


Theo Mardassi (1994) và Meng (1995), sự tương đồng về trình tự nucleotidee
giữa virus thuộc kiểu gene Châu Âu và kiểu gene Bắc Mỹ chỉ khoảng 67 %. Những
nghiên cứu về trình tự virus hai kiểu gene này cho thấy chúng ít tương đồng về trình
tự nucleotidee và aa (Allende và cs, 1999; Nelsen và cs, 1999; Suarez và cs, 1996).

virus PRRS gây ra trận dịch từ 2007 tại Việt Nam có độ tương đồng khoảng 99%
chủng virus Trung Quốc (Feng và cs, 2009).
2.3 Các phương pháp chẩn đoán
Để có kết luận chính xác về hội chứng PRRS, cần phải kết hợp việc tìm hiểu
thông tin về quá trình phát triển bệnh, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và điều
không thể thiếu là các thông tin về tình hình bệnh trong trại chăn nuôi và vùng chăn
nuôi lân cận. Việc phối hợp giữa chẩn đoán phân biệt các bệnh dựa trên triệu chứng
lâm sàng và thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm PRRS là hết sức cần thiết để nâng
cao hiệu quả trong việc phát hiện bệnh, giảm thiệt hại kinh tế cho trại chăn nuôi.
Cần thực hiện chẩn đoán phân biệt PRRS với các bệnh như: cúm heo, dịch
tả, viêm não Nhật Bản, giả dại, bệnh do Circovirus type 2, Enterovirus, Parvovirus,
Leptospira...Trong chẩn đoán virus, có thể sử dụng các phương pháp huyết thanh
học như: kháng thể huỳnh quang, hóa mô miễn dịch, ELISA. Phương pháp nuôi cấy
phân lập virus cho độ chính xác cao nhưng tốn nhiều thời gian. Gần đây, các
phương pháp sinh học phân tử như: RT- PCR, nested RT- PCR, real-time RT- PCR,
phân tích trình tự đã được sử dụng phổ biến giúp chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh
đạt hiệu cao hơn.
2.3.1 Các phương pháp xét nghiệm kháng thể
Các phương pháp như phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp – IFA,
trung hòa huyết thanh – SN, miễn dịch với peroxidase một lớp – IPMA, và ELISA
được dùng để phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus PRRS. Xét nghiệm kháng thể
huỳnh quang gián tiếp IFA (indirect flourescent antibody) có độ đặc hiệu cao đến
99,5% nhưng độ nhạy khác nhau giữa các cá thể. Độ nhạy phụ thuộc vào thao tác
xét nghiệm, sự khác biệt giữa kháng nguyên và kháng thể trên heo. IFA cho phép
phát hiện kháng thể virus PRRS đối với heo đã nhiễm từ 2- 3 tháng, nhưng không
thể phát hiện kháng thể virus PRRS ở heo bị nhiễm sau 5 tháng (Yoon và cs, 1992;
Yoon và cs, 1995; Christopher-Hennings và cs, 2002).

9


10


MARC-145) (Benfield và cs, 1992; Kim và cs, 1993). Nuôi cấy trên môi trường
PAM có độ nhạy hơn MARC-145 (Yoon và cs, 2003), các dòng Châu Âu thích hợp
hơn khi nuôi cấy trên môi trường PAM. Các mẫu thu nhận từ phổi, huyết thanh,
hạch bạch huyết, hạch amidan, hầu họng đều thích hợp cho việc nuôi cấy phân lập.
RNA virus phân lập từ dịch chiết tế bào cho tỉ lệ thành công trong RT-PCR cao hơn
RNA thu nhận từ mẫu trực tiếp. Mặc dù nuôi cấy phân lập là phương pháp truyền
thống trong việc xác định virus PRRS nhưng tốn nhiều thời gian và khó thực hiện.
2.3.3 Phương pháp khuếch đại
2.3.3.1 Phương pháp RT-PCR
Trong những năm gần đây, phương pháp RT-PCR (reverse transcriptase
polymerase chain reation) được sử dụng rất nhiều để phát hiện virus PRRS trong
huyết thanh và các mẫu xét nghiệm khác (Christopher-Hennings và cs, 1995;
Legeay và cs, 1997; Spagnuolo-Weaver và cs, 2000; Christopher-Hennings và cs,
2001) và phân biệt hai dòng Châu Âu và Bắc Mỹ (Mardassi và cs, 1994; Egli và cs,
2001). Christopher-Hennings và cs (2001) cho rằng virus PRRS không những được
phát hiện trong tinh dịch vào 11 ngày sau khi lây nhiễm cho heo mà còn có thể tìm
thấy trong huyết thanh, bạch cầu đơn nhân và mô của heo đực Yorkshire,
Hampshire và Landrace bằng phản ứng PCR. Phương pháp RT-PCR phát hiện virus
thường khuếch đại vùng gene ORF6, ORF7, đó là vùng có trình tự nucleotidee bảo
tồn nhất mà có thể phân biệt giữa hai dòng virus PRRS. Trong khi đó vùng ORF5
cho thấy có sự biến đổi của virus nhiều nhất (Wasilk và cs, 2004). Kết quả nghiên
cứu ở Thái Lan trên 2/3 chủng được tìm thấy đều thuộc dòng châu Âu, có lẽ vì Thái
Lan là nước liên tục nhập heo từ cả Châu Âu và Bắc Mỹ (Larochelle và cs, 2003).
So với các phương pháp phân lập virus, hóa mô miễn dịch và kháng thể
hùynh quang, phương pháp RT-PCR có các ưu điểm hơn ở độ nhạy và tính đặc
hiệu, ít tốn thời gian hơn, phát hiện được virus trên heo nhiễm cấp và mãn tính và
trong một số trường hợp như thai tự tiêu, mẫu tinh dịch, phân. Phương pháp này hỗ