TAP CHỈ KHO A HOC DH Q G H N , KHTN & CN,

T.xx, sỏ' 4,

2004

TINH SẠCH CHẤT ứ c CHE TRYPSIN (TI) TỪ HẠT ĐẬU TƯƠNG
(G L Y C I N E M A X L.)
P h a n T u â n N g h ĩa , Đ ặ n g Q u a n g H ư n g
K hoa S in h học, Trường Đ ại học K hoa học T ự n h iên , Đ H Q G H N

1. Đ ặ t v ấ n đề
H ạt đậu tương 0Glycine m ax L.) có chứa h ai ức chế try p sin điển h ìn h với khôi lượng
p hân tử 8 kDa và 20 kD a và được gọi tương ứng là c h ấ t ức c h ế B ow m an-Birk và ch ất ức chê
K unitz theo cách gọi của các tác giả lần đầu tiên p h á t hiện và tin h sạch chú ng [2, 4,]. Cho
đến nay các tính c h ấ t của cả hai c h ất ức c h ế này đã được nghiên cứu r ấ t kỹ [1, 6]. Cả hai
chất đều đã được một số h ã n g hoá c h ấ t tin h sạch và sả n x u ấ t làm các protein c h u ẩn cho việc
xác định khôi lượng p h â n tử b ằn g sắc ký lọc gel và b ằ n g điện di. Tuy nhiên, ở Việt N am cho
đến nay chưa có công trìn h nào báo cáo về việc tin h sạch các c h ấ t ức chê này. N ghiên cứu
này n hằm mục đích th iế t lập một qui trìn h tương đôi đơn giản, dề áp d ụ n g đê tin h sạch ch ất
ức chê K unitz (KI), với khôi lượng 20 kDa vốn k h á bền với nhiệt, có h à m lượng tương đôi cao
trong nguồn nguyên liệu bột đậu tương dễ kiếm, giá rẻ để có th ế sử d ụn g n h ư một protein
chuấn cho việc đ á n h giá khối lượng của các protein th a y cho việc n h ậ p ngoại giá cao.
2. N g u y ê n liệ u v à p h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u
2.1. N g u yên liệ u
H ạ t đậu tương (G lycine m a x L.) được m ua từ h à n g h ạ t giống Hà Nội và được định tên
khoa học bới chuyên gia p h â n loại thực vật.
Trypsin của h ă n g Sigma (Mỹ), các protein c h u ẩ n của h ã n g P h a rm a c ia (Thụy điển).
Trypsin-Sepharose được ch ú ng tôi tự tông hợp bằng cách gắn try p sin tin h k hiết của hãng
Sigma vào S epharose 4B đã được h o ạt hoá bằn g B rC N của H ã n g P h a rm a c ia. Các hoá chất
còn lại đều đ ạ t độ tin h k h iế t d à n h cho p h â n tích.

3. K ế t q u ả v à t h ả o l u ậ n
3.1. C h u ấ n bị d ịc h c h iế t h ạ t đ ậ u tư ơ n g
H ạ t đậu tương được nghiền mịn. 20 g bột nghiền mịn được loại mõ b ằ n g ete etylic
(theo tỷ lệ 1 g bột 5 ml

ete). P h a nổi ở trê n chứa mõ trong ete được gạn bỏ, p h ầ n bột đã loại

mõ được cho làm bav hơi ete ở nh iệ t độ phòng.
Bột đậu tương loại mõ được chiết b ằn g đệm Tris-HCl, 20 mM, pH 7,5 có chứa 50 mM
KC1 (đệm A) theo tỷ lệ 1:5 (khôi lượng:thể tích) trong 1 giò. Dịch đồng th ê được ly tâ m ỏ
14.000 v/ph trong 20 p h ú t ở 4°c. Dịch trê n tủ a được th u lại. Kết tủ a được c hiết lại với cùng
đệm A nhưng theo tỷ lệ 1:3 (w:v) và th u dịch trê n tủ a b ằ n g ly tâm .
3.2. S ắ c kỷ tra o đ ôi ion q u a côt DE-52 cellu lo se
Dịch chiết h ạ t đậu tương của h a i lần được trộn lại và cho lên cột DE-52 cellulose (có
kích thước l,6x 8 cm) đã được cân bằng với đệm A ở trên. Tốc độ lên cột là 20 ml/giờ.
Sau khi cho to àn bộ dịch chiết chảy qua cột, cột được rửa b à n g đệm A cho đên khi
A .,80 của dịch rửa chiết nhỏ hơn 0,005 (khoảng 120 ml) và sau đó được p h ả n hấp th ụ bằng
gradient NaCl từ 0,05-1,0M pha trong cùng đệm A. Tốc độ rử a chiết là 25 ml/giờ vói mỗi
phân đoạn th u là 2ml.
Kết quả cho th ấ y protein và TIA được p h á t hiện ở cả p h ầ n dịch không h ấ p th ụ (phân
đoạn I). Tuy nhiên, qua th ứ nghiệm chúng tôi th ấ y c h ấ t ức c h ế K unitz (Kl) khồng thuộc
p h ân đoạn I nên chúng tôi không tiếp tục tin h sạch KI từ p h â n đoạn này. s ắ c ký đồ của
phần protein hấp th ụ trê n cột (hình 1) cho th ấ y có hai đỉnh protein chính, tro n g đó chỉ đỉnh
thứ n h ấ t được đẩy ra ở nồng độ NaCl từ 0,3 đến 0,5M là có TIA (và được ký hiệu là phân
đoạn II). Còn đỉnh protein th ứ hai được đẩy ra ỏ nồng độ NaCl cao hơn thì không có TIA.
Nhờ loại bỏ được p h ầ n protein không gắn với cột và p h ầ n protein có ái lực cao do đó chê
phẩm KI th u được đã có độ sạch tă n g lên 10,2 lần so với b a n đầu (bảng 1). Kết q u ả SDSPAGE của ph ân đoạn II còn chứa r ấ t nhiều b ăn g protein, tro ng đó có b ăn g với khôi lượng
p hân tử 20 kDa (hình 3).
3.3. S ắ c ký q u a cột lọc g e l S e p h a d e x G-100
Các ph ân đoạn II có TIA của bước sắc ký qua cột DE-52 cellulose được dồn lại, loại

ion DE-52 cellulose, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-100 và sắc ký ái lực qua cột TrypsinSepharose 4B.
4. T h ả o l u ậ n
C h ất ức chê K u n itz (KI) với h o ạ t tính ức c h ế try p sin lần đầu tiên đã được K unitz tách
ra từ h ạ t đậu tương m ột qui trìn h nhiều bước khác n h a u [2]. Sau này F e d u rk in a và Mosolov
111dã p h á t triể n một phương p háp tin h sạch KI từ h ạ t đậu tương r ấ t đơn giản bằng sắc ký
lìấp th ụ miễn dịch, tro n g đó các tác giả đã sử dụng KI thương mại gây k h á n g the k h á n g KI
ỏ thổ và gắn k h á n g th ể th u được lên Sepharose 4B để tạo cột ái lực. Tuy nhiên, bước phức
tạp cua phương p h á p này là phải gây được k h á n g th ê k h á n g KI. Qui trìn h của chúng tôi với
3 bước sác ký phôi hợp ỏ tr ê n là dễ d àn g áp dụ n g với các phòng th í nghiệm hoá sinh thông
thường hiện nay. Qui trìn h cho phép th u được kh o ả n g 6 mg Kĩ từ 20 gam nguyên liệu ban
đẩu. Chê phẩm có độ tin h k h iế t cao, hoàn toàn p h ù hợp với mục đích sử dụng n h ư một
protein c h u ẩ n cho việc đ á n h giá khôi lượng p h â n tử b ằ n g sắc ký h a y điện di. Hơn t h ế nữa,
với hoạt độ riêng 1,17 ĨU /m g protein (bảng 1) và dựa trê n tỷ ]ệ ức c h ế lm ol KI: lm ol trypsin
c ho thây. KI th u được v ẫn giữ nguyên hoạt độ ức chế enzym đích.

Ỉ ỤỊÌ chi Khoa học DIIỌ C Ì/IN . K H IN & CN. T.xx. Sô'4. 2004


0

20

40
60
Sò phán đoạn

80

100


chiết bằn g đệm A
Sắc ký qua cột DE-52
2 Đ ỉnh th ứ n h ấ t
3
4

Sắc ký qua cột Sephadex G100 đ ỉn h TIA của côt DE-52
s á c ký qua cột TrypsinS e p h a ro se 4B

2

3

TIA
H oạt độ riêng (đơn
(đơn vị)
vị/ mg protein)
33,28
0,0314

Hệ sô tinh
sạch (lần)
1,00

38,4

12,23

0,318


H ình 3: Điện di gel polyacrylamid 12,5% có SDS chế phẩm chất TI từ đậu tương
1: Dịch chiết hạt đậu tương, 2: Đinh TIA thu từ cột DE-52, 3 và 4: đỉnh TIA thu từ cột
Sephadex G-100, 6 và 8: Chế phẩm TI thu từ cột sắc ký ái lực Trypsin-Sepharose 4B, 7:
Các protein chuẩn bao gồm: Phosphorylase B, albumin huyết thanh bò, ovalbumin,
cacbonic anhydrase, chất ức chê trypsin (KI) đậu tương và lactalbumin.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Fedurkina. N. V. and Mosolov.V.V.,
Purification of soy bean trypsin
immunoabsorption, Applied Biochem. and M ic r o b io l20(1984), 452-457

inhibitor by

2.

Kunitz. M, Crystalline soy bean trypsin inhibitor II. General properties, J
30(1947), 291-310

Gen Physiol

I tip chi Khoa hục DHQCiHN . K H IN & CN, T.XX, So 4, 2004


24

Phan Tuấn NiihTa, Đạiìii Qiumu. Hưim

3.


N04, 2004

P U R IF IC A T IO N O F T R Y P S I N IN H IB IT O R (TI) F R O M S O Y B E A N S
(G L Y C IN E MAX L.)
P h an Tuan N ghia and D ang Q uang H ung
D epartm en t o f Biology, College o f Science, V N Ư

A protocol for purification of the soybean trypsin inhibitor (SBTI) or K un itz inhibitor
(KI) h a s been reported. The ground powder was extracted with ethylic e th e r to remove fat,
then resu spen ded a n d m agnetically stirre d in 20mM Tris-HCl buffer, pH 7.5 co n tain in g 50
mM KC], followed by cen trifu gatio n to collect the clear s u p e r n a n ta n t fluid. T h e e x tra c t th en
u n d erw en t 3 steps of purification: i) anion exchange column c h ro m a to g ra p h y on DE-52
cellulose, ii) gel filiation on Sephadex GlOO and iii) affinity c h ro m a to g ra p h y on TrypsinSepharose 4B. The obtained TI p re p a ratio n contained only a single protein of a m olecular
w eight of 20 kDa

as shown at the sam e position of

th e s ta n d a rd KI pre sen t in the

molecular weight m a rk e rs on SDS-PAC tE. The protocol allows to obtain

6.4 mg KI from 20

g of soybean ground powder and the purification factor of the KI a fte r the 4 step s increased
37 fold.

Tạp chi Khou học ĐHQGHN. Kin N & CN. I .XX. So 4. 2004