TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

TRỊNH THỊ HOÀI THU

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC BERBERIN CỦA MÀNG CELLULOSE
VI KHUẨN LÊN MEN TỪ MÔI TRƯỜNG
NƯỚC DỪA GIÀ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học người và động vật

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Với lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn ThS.
Cao Bá Cường, nguời thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình thực hiện khóa luận này.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn tới các thầy cô tại Viện Nghiên cứu Khoa
học và Ứng dụng trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN,
trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Đặc biệt là sự giúp đỡ, động viên của gia
đình, bạn bè tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng để hoàn thành khóa luận một cách tôt nhất,
tuy nhiên do buổi đầu làm quen với công việc nghiên cứu khoa học cũng như
hạn chế về kiến thức và kinh nghiệm nên không thể tránh khỏi những thiếu

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu .................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 3
5. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Tổng quan về màng CVK .......................................................................... 4
1.1.1. Vi sinh vật tổng hợp CVK ...................................................................... 4
1.1.2. Cấu trúc của CVK ................................................................................... 4
1.1.3. Đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum ........................................... 5
1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum ............................................................. 5
1.1.5. Các phương pháp sản xuất CVK từ A. xylinum ...................................... 7
1.1.5.1. Lên men tĩnh ........................................................................................ 7
1.1.5.2. Lên men động ....................................................................................... 7
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn trên thế giới
và tại Việt Nam ................................................................................................. 8
1.2.1. Trên thế giới ............................................................................................ 8
1.2.2. Ở Việt Nam ............................................................................................. 9
1.3. Tổng quan về Berberin .............................................................................. 9
1.3.1. Công thức hóa học và tính chất ............................................................... 9
1.3.1.1. Công thức hóa học ............................................................................. 10
1.3.1.2. Nguồn gốc .......................................................................................... 10
1.3.1.3. Tính chất vật lý................................................................................... 10
1.3.1.4. Tính chất hóa học ............................................................................... 11
1.3.1.5. Tác dụng ............................................................................................ 11


1.4. Tình hình nghiên cứu Berberin trên thế giới và tại Việt Nam ................. 12

2. Kiến nghị ..................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 35


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH ............................................................. 10
Hình 2.1 Dùng máy khuấy từ khuấy đều môi trường nuôi cấy ...................... 16
Hình 2.2: Sơ đồ tinh chế màng CVK. ............................................................. 17
Hình 2.3: Phương trình đường chuẩn của BH ................................................ 19
Hình 3.1: Màng CVK được nuôi cấy trong môi trường nước dừa già ........... 23
Hình 3.2: Màng CVK thô ................................................................................ 24
Hình 3.3: CVK ngâm trong HCl

Hình 3.4: Màng CVK sau khi được tinh

chế ................................................................................................................... 25
Hình 3.5: Màng CVK dày 0.7cm .................................................................... 25
Hình 3.7: Màng CVK đang hấp thụ thuốc ...................................................... 26
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc BH của màng CVK ........... 28
Hình 3.9: Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH =12................................................... 30
Hình 3.10: Biểu đồ tỉ lệ giải phóng ở pH = 2.................................................. 30


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già ........................................ 6
Bảng 2.1 Môi trường tạo màng CVK.............................................................. 15
Bảng 2.2: Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch BH ở các nồng độ
(mg/ml) khác nhau (n = 3) .............................................................................. 19
Bảng 2.3: Môi trường đệm PBS với pH 2, 12................................................. 20
Bảng 3.1: Khối lượng hấp thụ thuốc BH cuả màng CVK .............................. 26

đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum. Cellulose vi khuẩn và cellulose thực
vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose vi khuẩn bao gồm các liên kết
β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hóa khác nhau. CVK có độ tinh sạch
cao so với các loại cellulose khác, không chứa các hợp chất cao phân tử như
ligin, hemicellulose do vậy chúng có những đặc tính vượt trội và dẻo dai, bền
1


chắc. Trên thế giới Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn
bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp
thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý nước thải, bảo vệ môi
trường… Đặc biệt trong lĩnh vực y học, màng CVK đã được ứng dụng làm da
tạm thời thay thế da trong quá trình điều trị bỏng, loét da, làm mạch máu nhân
tạo điếu trị các bệnh tim mạch; làm mặt nạ dưỡng da cho con người. Ở Việt
Nam, việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK còn ở mức độ khiêm tốn, các
nghiên cứu ứng dụng mới chỉ dừng lại bước đầu nghiên cứu.
Kết quả cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc
chậm lại, làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc.
Với mục đích tạo ra màng CVK dựa trên loài vi khuẩn thuộc chủng A. xylium,
từ đó chế tạo màng sinh học để nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc qua
màng nhằm hạn chế các tác dụng phụ, khắc phục tính ít tan trong nước và
tăng khả dụng sinh học của berberin trong việc điều trị bệnh. Đó là lí do
chúng tôi đã chọn đề tài:
“Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Berberin của màng cellulose vi
khuẩn lên men từ môi trường nước dừa già”.
2. Mục đích nghiên cứu
-

Chế tạo màng CVK từ vi khuẩn Acetobacter xylium.



Về mặt khoa học thì việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK vào việc khắc
phục hạn chế của thuốc berberin sẽ mở ra một hướng nghiên cứu mới không
chỉ dừng lại ở việc khắc phục hạn chế của thuốc này mà còn có thể ứng dụng
trên nhiều các loại thuốc khác nữa giúp cho ngành y học ngày một phát triển
hơn.
Bên cạnh đó ta cũng có thể tìm ra được những ưu nhược điểm của màng
CVK để từ đó có những hướng nghiên cứu làm tăng các đặc tính cả màng
CVK, hạn chế các yếu điểm của màng để ứng dụng màng trên nhiều các lĩnh
vực khác nhau.
-

Ý nghĩa thực tiễn

+ Xây dựng được quy trình tạo màng CVK từ chủng Acetobacter xylinum.
+ Từ màng CVK đã được tạo ra được dùng làm hệ thống nhằm khắc phục
được những tác dụng phụ không mong muốn .
+ Từ kết quả nghiên cứu được có thể áp dụng vào thực tiễn.
5. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu quy trình nuôi cấy A. xylinum với các nguyên liệu có sẵn

(nước dừa già).
-

Thu sản phẩm CVK từ dịch nuôi cấy và tiến hành xử lý màng CVK thu

được sau khi nuôi cấy.
-


Họ: Pseudomonadaceae

A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước ngang khoảng
0.6 – 0.8 μm, dài khoảng 2-3 μm, vi khuẩn không sinh bào tử, gram âm,
không di động, sắp xếp riêng rẽ đôi khi xếp thành chuỗi, nhưng khi tế bào già
hay do điều kiện môi trường nuôi cấy thì hình dạng có thể bị biến đổi: tế bào
dài hơn, phình to ra, phân nhánh hoặc không phân nhánh [6].
1.1.2. Cấu trúc của CVK
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau
bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp lại
với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1.5 nm. Đây là những thớ sợi tự
nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một
vài loại thực vật. Các thớ sợ thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi

4


tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3-4nm, và
chiều dài 130-177nm ( Yamanaka et al, 2000). Các dải siêu mịn của cellulose
vi khuẩn có chiều dài từ 1-9µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn
định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki at al, 2001).
Màng CVK do A. xylinum tạo ra có cấu trúc hóa học đồng nhất với PC, tuy
nhiên chúng khác nhau về cấu trúc đại thể [4].
1.1.3. Đặc tính của màng CVK tạo bởi A. xylinum
-

Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể

mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao.


Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản

xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian.
Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc
dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ.
1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum

5


Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn dinh
dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố
tăng trưởng và các yếu tố vi lượng [3].
Nước dừa già là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước dừa
già chứa rất nhiều chất dinh dưỡng và chất kích thích tố tăng trưởng như 1,3 –
diphenyllurea, hexitol, cytolunin, myoinositol, sorbitol, … Vì vậy A. xylinum
rất thích hợp phát triển trong môi trường này [6].
Nước dừa sau khi thu hoạch được sử dụng không quá 3 ngày, tránh để lâu làm
cho đường và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến cho hiệu suất kém
[6].
Thành phần của nước dừa già [6] được trình bày như ở bảng 1.1
Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già
Nước (%)

Protein (%)

Chất béo toàn phần (%)

94.99


Riboflavin (mg/100g)
Niacin (mg/100g)

0.04

0.142

1

2.4

0.03

0.057
0.08

Acid Panthenic (mg/100g) 0.043


Phosphorus (mg/100g)

20 Vitamin B6 (mg/100g)

Kali (mg/100g)

250

Natri (mg/100g)


năng tổng hợp CVK của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá trình lên men đạt

7


hiệu quả cao, các reactor có sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men
[3, 31].
1.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng Cellulose vi khuẩn trên thế
giới và tại Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Nghiên cứu về màng CVK từ vi khuẩn A. xylinum và những ứng dụng của
nó đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Nghiên cứu của Wei B và
cộng sự (2011) cho thấy màng khô CVK thu được sau khi ngâm trong
benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn; Merck KGaA, Darmstadt,
Đức) có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được
tìm thấy là 0,116 kg/cm2 và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại
hoạt động của S. Aureus và B. Subtilis [11].
Tác giả Brown (1989), dùng màng CVK làm môi trường phân tách cho quá
trình xử lý nước, dùng làm chất mang đặc biệt cho các pin và năng lượng cho
tế bào. Brown (1989), Jonas và Farad, 1998, dùng màng như là một chất để
biến đổi độ nhớt, để làm ra các sợi truyền quang, làm môi trường cơ chất
trong sinh học, thực phẩm.
Dựa vào đặc tính đặc biệt của CVK như khả năng thấm nước cao, khả
năng kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học nên CVK có vai trò như màng
sinh học. Người ta đã dùng màng sinh học để thay thế da tạm thời. Ở Brazil,
người ta cũng đã ứng dụng thành công màng CVK để làm da nhân tạo.
Tuy nhiên, những ứng dụng thường thấy trên thế giới của màng CVK là
dùng trong ngành dược phẩm và mỹ phẩm. Các tác giả: Hamlyn và cs (1997),
Cienchansk (2004), Legeza và cs (2004), Wan và Milon (2005), Czaja và cs
(2006) sử dụng màng CVK đắp lên các vết thương hở, vết bỏng đã thu được

dụng màng CVK trong việc hấp thu và giải phóng thuốc BH.
1.3. Tổng quan về Berberin
1.3.1. Công thức hóa học và tính chất
9


1.3.1.1. Công thức hóa học
- Tên quốc tế: Berberine hydrochloride
- Tên khoa học: 5,6-dihydro-8,9-dimethoxyl-1,3- dioxa 6a - azoniaindeno (5,6
- a) anthracen clorid dihydrat.
- Công thức hóa học: C20H18NO4Cl.2H2O
- Khối lượng phân tử: 371.82

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của BH
1.3.1.2. Nguồn gốc
BH thường có trong rễ, thân rễ, thân, vỏ cây những cây thuộc chi Berberis,
Hydrastis candensis, Coptis chinensis, BH có nhiều trong thân và rễ cây vằng
đắng với tỷ lệ 1.5 - 3%, berberin chiếm ít nhất là 82% so với alcaloid toàn
phần.
BH thường có lẫn tạp chất alcaloid khác nhau như: palmatin, jatrorrhizin.
Giới hạn tạp chất palmatin không quá 2%, jatrorrhzin không quá 5%.
1.3.1.3. Tính chất vật lý
Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi có vị rất đắng. Độ chảy khi ở
dạng base là 145ºC (bị phân hủy). Độ tan dạng base tan chậm trong nước, hơi
tan trong ethanol, khó tan trong ether. Dạng muối clorid tan ở tỷ lệ 1/400
10


trong nước, dễ tan trong nước sôi, tan trong ethanol, thực tế không tan trong
cloroform và ether. Dạng muối Sulfat dễ tan trong nước, tan trong ethanol

cường tim và chống loạn nhịp. Các nhà khoa học cũng phát hiện ra khả năng
ức chế bài tiết ion trong lòng ruột, ức chế co cơ, giảm cholesterol và
triglyceride, chống đái tháo đường, giảm viêm cho người bị viêm khớp...
Không dùng berberin cho người quá mẫn với thuốc, phụ nữ có thai (vì thuốc
có khả năng gây co bóp tử cung làm ảnh hưởng tới thai nhi).
1.4. Tình hình nghiên cứu Berberin trên thế giới và tại Việt Nam
1.4.1. Trên thế giới
Lin Huang, Xiuli Chen, Thanh Nguyen Xuan, Huiru Tang, Liming Zhang và
Guang [15] nghiên cứu tạo ra Chitosan tráng (bọc) nano-liposome cho việc
phân phối uống berberine hydrochloride. Kết quả cho thấy chitosan bọc nanoliposome là hiệu quả hơn so với những người không tráng cho việc cung cấp
bằng miệng của BH.
Huilixing và Jianping Ye đã xác định hiệu quả và tính an toàn của Berberin
trong điều trị bệnh nhân tiểu đường loại 2 [16].
Ryan Bradley, ND, MPH, và Bill Walter, ND đã nghiên cứu về Berberin
trong bệnh tiểu đường [31].
Gần đây, Lin Huang và cs [17] nghiên cứu việc sử dụng màng CV cho việc
kiểm soát in vitro của thuốc berberin. Ngoài thẩm thấu qua da, thí nghiệm
kiểm soát sự giải phóng thuốc berberin qua màng CV còn được thử nghiệm
mô phỏng trong dạ dày, ruột. Các kết quả thu được cho thấy thuốc berberin đã
được giải phóng từ màng CV với một tốc độ chậm.
1.4.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, đã có một số công trình nghiên cứu về Berberin như:
- Vũ Bình Dương, Nguyễn Trọng Diệp, Nguyễn Thị Thùy, Hoàng Văn Lương
(2010), Nghiên cứu bào chế viên nén Berberin giải phóng tại đích đại tràng,
kết quả đã nghiên cứu bào chế viên nén Bereberin clorid 100 mg giải phóng
tại đích đại tràng theo cơ chế phân hủy bởi hệ vi sinh vật đại tràng [9].
12


- Phan Quốc Kinh đã nghiên cứu những Alkaloid chiết xuất từ các cây thuốc



Đường glucose



Pepton



(NH4)2SO4



Acid acetic



NaOH, HCl



Nước cất



KH2PO4

2.2. Thiết bị và dụng cụ
2.2.1. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu




Nồi hấp khử trùng HV – 110/ HIRAIAMA



Tủ sấy, tủ ấm (Binder – Đức)



Máy lắc TEIO TRCH (Hàn Quốc)

2.2.2. Dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu
Bình định mức loại 100 ml, 500 ml, 1000 ml, pipet chính xác 1 ml, 5 ml, 10
ml, ... giấy bạc, vải lọc, giấy thấm và một số dụng cụ khác trong phòng thí
nghiệm cần thiết.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp tạo màng CVK
Sử dụng môi trường cải biến từ môi trường chuẩn Hestrin – Schramm [6] (cao
nấm men được thay thế bằng nước dừa già). Thành phần và khối lượng các
chất có trong môi trường nuôi cấy tạo màng CVK được thể hiện trong bảng
2.1.
Bảng 2.1 Môi trường tạo màng CVK
STT

Hóa chất

Hàm lượng


6

Acid axetic

2%

7

Dịch giống

10%

A. xylium

15


- Dùng máy khuấy từ để khuấy đều môi trường nuôi cấy (môi trường chưa có
acid acetic và dịch giống) cho đến khi bão hòa như hình 2.1.

Hình 2.1 Dùng máy khuấy từ khuấy đều môi trường nuôi cấy
- Cho dung dịch vào nồi hấp thanh trùng ở 1130C trong 15 phút để diệt khuẩn
và nấm mốc.
- Đặt môi trường tạo màng trong buồng cấy vô trùng, để dưới đèn tím 30
phút. Khi môi trường đã nguội hoặc ở nhiệt độ khoảng 30 – 350C.
- Sau đó cho dịch giống vào môi trường (10% thể tích của môi trường), thêm
vào môi trường 2% acid axetic để hạn chế nấm.
- Cho dung dịch vào hộp đựng có nắp đậy và đậy kín lại hoặc sử dụng vải xô
để đậy nắp hộp.
- Lên men trong vòng khoảng 7-8 ngày thu lấy màng CVK.