ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN NHƯ NHỨT

PHÂN LẬP Agrobacterium rhizogenes
VÀ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG
LÊN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP
Vinca ALKALOID CỦA RỄ TƠ
CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus)

Ngành: Sinh học
Mã số ngành: 62 42 30 15

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh – Năm 2018


Công trình đƣợc hoàn thành tại:
- PTN Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tƣờng tỉnh Bình Dƣơng.
- PTN LabB, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật và Chuyển hóa thứ
cấp, trƣờng ĐH KHTN – ĐHQG.HCM.
- TT Sâm và dƣợc liệu, trƣờng ĐH Y dƣợc Tp.HCM.

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ
Phản biện 1: PGS. TS. DƢƠNG TẤN NHỰT
Phản biện 2: PGS. TS. LÊ THỊ THỦY TIÊN
Phản biện 3: TS. PHAN TƢỜNG LỘC
Phản biện độc lập 1: PGS. TS. DƢƠNG TẤN NHỰT
Phản biện độc lập 2: TS. PHAN TƢỜNG LỘC

được sẽ có đặc điểm tăng trưởng khác nhau (Chandra và cộng sự, 2013).
Cũng chính vì lý do đó mà việc nghiên cứu sản xuất được nhiều dòng rễ tơ
khác nhau và sau đó là sàng lọc được dòng rễ tơ mong muốn gặp nhiều khó
khăn và tốn nhiều thời gian. Mặt khác, cho đến nay, hầu hết các nghiên cứu
trên rễ tơ cây Dừa cạn vẫn còn hạn chế khi chỉ vận dụng vài chủng A.
rhizogenes nhất định. Trong khi đó, loài vi khuẩn này phổ biến rộng rãi
trong đất (Wang, 2006; Murugesan và cộng sự, 2010). Do đó, việc khai
thác các chủng A. rhizogenes hoang dại được phân lập từ đất sẽ mang đến
cơ hội thu được nhiều dòng rễ tơ mới từ cây Dừa cạn cũng như tiềm năng
chọn lọc được dòng rễ tơ thích hợp cho các nghiên cứu có liên quan.

-1-


Mục tiêu
Phân lập các chủng A. rhizogenes có trong tự nhiên và đánh giá ảnh
hưởng của các chủng A. rhizogenes thu được lên khả năng sinh tổng hợp
Vinca alkaloid của cây Dừa cạn thông qua gây nhiễm trực tiếp lên cây in
vivo như yếu tố ngoại sinh và thông qua rễ tơ được cảm ứng bằng A.
rhizogenes như yếu tố nội sinh.
Ý nghĩa khoa học
Luận án nhằm ghi nhận sự hiện diện của A. rhizogenes trong đất vùng rễ
của một số cây trồng ở Việt Nam và khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ
tơ của chúng trên cây Dừa cạn cũng như ảnh hưởng của chúng lên khả năng
sinh tổng alkaloid của cây Dừa cạn và rễ tơ.
Ý nghĩa thực tiễn
Luận án góp phần thu thập được A. rhizogenes bản địa làm công cụ cho
các nghiên cứu chuyển gen vào tế bào thực vật. Ngoài ra, kết quả của luận
án giúp sản xuất được nhiều dòng rễ tơ khác nhau từ cây Dừa cạn phục vụ
cho các nghiên cứu sau này hướng đến sản xuất Vinca alkaloid.

chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn và có nhiều điểm giống với A.
tumefaciens.
1.2. Giới thiệu sơ lƣợc về cây Dừa cạn
Cây Dừa cạn (Catharanthus roseus) có nguồn gốc ở Madagascar và
được trồng như cây cảnh ở nhiều nơi trên thế giới. Chúng được sử dụng
như dược liệu nhờ khả năng sinh tổng hợp những hợp chất có giá trị. Trong
đó gồm các Vinca alkaloid có hoạt tính chống ung thư trên người. Tuy
nhiên, hàm lượng của chúng trong cây Dừa cạn rất thấp nên các nhà khoa
học không ngừng nghiên cứu các kỹ thuật sản xuất nhằm nâng cao sản
lượng của chúng (Peebles, 2008).
1.3. Sơ lƣợc về rễ tơ
Rễ tơ thu được từ sự chuyển gen của A. rhizogenes vào tế bào thực vật
có đặc điểm phát triển nhanh không cần hormone, ổn định về mặt di truyền,
có khả năng tổng hợp hợp chất thứ cấp cao hơn cây chủ. Do đó, rễ tơ được
ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như sản xuất hợp chất đích, xử lý môi
trường, nghiên cứu các con đường chuyển hóa và sinh lý rễ, tạo giống cây
trồng…

-4-


1.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng A. rhizogenes trong khai thác rễ
tơ Dừa cạn
Quá trình chuyển gen của A. rhizogenes vào tế bào thực vật xảy ra ngẫu
nhiên nên vị trí chèn các gen từ vi khuẩn vào bộ gen tế bào chủ cũng như số
lượng bản sao được chèn cũng không giống nhau. Do đó, các dòng rễ tơ thu
được có đặc điểm tăng trưởng vào biến dưỡng cũng không giống nhau.
Không may mắn là rễ tơ cây Dừa cạn có khả năng tăng trưởng thấp hơn rễ
tơ từ nhiều loài thực vật khác. Trong khi đó, hầu hết các nghiên cứu chỉ sử
dụng vài chủng A. rhizogenes nhất định và chủ yếu chúng mang plasmid tái

và sinh hóa của vi khuẩn Emanuel và Lorrence (2009), Murugesan
và cộng sự (2010) và José (2012); phương pháp kiểm tra bệnh học
in vivo theo Georgina và cộng sự (2007) và Kereszt và cộng sự
(2007); PCR nhận diện các gen rolABC và gởi mẫu giải trình tự
16s rDNA.
-6-


- Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường lỏng.
- Phương pháp gây nhiễm cảm ứng tạo rễ tơ in vitro; phương pháp
nhận diện rễ tơ chuyển gen bằng phân tích PCR sự hiện diện của
gen rolB trong rễ và các phương pháp nuôi cấy rễ tơ trên môi
trường thạch và môi trường lỏng.
- Các phương pháp sinh hóa như phương pháp xác định trọng lượng
tươi và trọng lượng khô, phương pháp OTT để tách chiết alkaloid
tổng số và phương pháp sắc ký lỏng cao áp phân tích các alkaloid.
- Phương pháp xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS (Statistical
Package for the Social Sciences) 20.0, phép thử Duncan.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
Mẫu đất
1. Phân lập, nhận diện A. rhizogenes
- Phân lập trên môi trường chọn lọc; nhận diện bằng kiểm tra hình thái và sinh hóa, sinh học phân
tử và kiểm tra bệnh học in vivo
2. Nghiên cứu thiết lập quy trình cảm ứng tạo rễ tơ
- Sàng lọc chủng vi khuẩn, lựa chọn loại mô và xác định các điều kiện gây nhiễm (thời gian ngâm
mẫu, mật độ tế bào, thời gian ủ cảm ứng, chất cảm ứng, chế độ chiếu sáng, môi trường khoáng cơ
bản, nguồn carbon)

3. Nghiên cứu nuôi cấy bảo quản rễ tơ cây dừa cạn
- Xác định điều kiện nuôi cấy bảo quản rễ tơ (môi trường khoáng cơ bản, nhiệt độ và ánh sáng) và

Hình 3.5. Sự xuất hiện triệu chứng rễ tơ trên bốn giống Dừa cạn in vivo khi
được xâm nhiễm bằng dòng C18 đã phân lập được sau 3 tuần gây nhiễm.

-8-


Kiểm tra bệnh học cho thấy có mười ba dòng khuẩn lạc có khả năng
xâm nhiễm tạo rễ tơ trên bốn giống cây Dừa cạn in vivo VIN002, VIN005,
VIN072 và VIN077 (Hình 3.5). Cả mười ba dòng này đều được nhân diện
thuộc loài A. rhizogenes dựa trên trình tự 16S ribosome DNA và đều có
chứa plasmid Ri mang các gen rolABC (Bảng 3.4 và Hình 3.6). Hầu hết
các dòng trong số mười ba dòng đã phân lập được sử dụng cao nấm men
1% làm nguồn nitrogen để phát triển với nguồn carbon thay đổi (glucose,
lactose, mannitol hoặc sucrose) 1-1,5% ở pH 6,5-7,5 (Bảng 3.5). Dựa vào
nguồn gốc phân lập được và điều kiện tăng trưởng đã cho thấy mười ba
dòng này là mười ba chủng A. rhizogenes khác nhau.
C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang

rolA rolB rolC nước thang

Đối chứng

rolA

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang

rolB

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 thang


C04
A. rhizogenes
99-100%
Có
Có
Có
C09
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C10
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C12
A. rhizogenes
99%
Có
Có
Có
C15
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có

C32
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
C34
A. rhizogenes
100%
Có
Có
Có
Bảng 3.5. Bảng tổng hợp nguồn gốc và một số điều kiện tăng trưởng của
13 chủng A. rhizogenes đã thu nhận được có khả năng chuyển gen cảm ứng
rễ tơ trên cây Dừa cạn
Ký hiệu Ký hiệu
chủng khuẩn lạc
C02

VBa2

C04

VBa9

C09

VĐu23

C10


7,5

Mannitol 1,5%

Cao nấm men 1%

3

MT4

6,5

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

2

MT5

6,5

Sucrose 1,5%

Peptone 1%

C12

VHa7


VLu14

Lúa nước

3

MT4

6,5

Lactose 1,5%

Cao nấm men 1%

C20

VNa11

Đậu nành

3

MT4

6,5

Lactose 1,5%

Cao nấm men 1%


VPh56

3

MT2

6,5

Mannitol 1,0%

Cao nấm men 1%

C32

VXa5

2

MT5

6,5

Glucose 1,0%

Cao nấm men 1%

C34

VXa21

Bảng 3.6. Tỷ lệ mẫu hình thành rễ trên bốn giống Dừa cạn được cảm ứng
bằng các chủng A. rhizogenes
Chủng
A. rhizogenes
C02

I (%)
VIN002
de

39,6

g

VIN005
11,0

g

39,3

d

VIN072

VIN077

d

4,6f


e

13,6

17,5c

C12

47,7c

23,2f

10,2fg

14,2d

C15

17,8

h

f

h

3,3f

C18


C26

e

38,1

43,2

c

f

10,6

26,7a

C29

24,8g

46,4b

0,8h

3,8f

C32

55,0


22,2
31,4

45,6b
30,3

- 11 -

8,1

0

23,5

0

32,5


C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C20 C24 C26 C29 C32 C34 nước rễ thang
thường

C02 C04 C09 C10 C12 C15 C18 C24 C26 C29 C32 C34 rễ thang
thường

Rễ tơ do các chủng khuẩn
cảm ứng từ giống dừa cạn VIN002

Rễ tơ do các chủng khuẩn


Thời gian gây nhiễm
Ủ cảm ứng
trong tối
Điều
Ủ loại nhiễm
kiện
nuôi cấy
Môi trường
mẫu
nuôi cấy
Nguồn carbon
Tỷ lệ mẫu hình thành rễ
(%)

Giống Dừa cạn
VIN002

VIN005

VIN072

VIN077

C18

C18

C18


5 ngày

6 ngày

6 ngày

6 ngày

1000 lux,
16h/ngày

1000 lux,
16h/ngày

1000 lux,
16h/ngày

1000 lux,
16h/ngày

1/2W

1/2W

1/2W

1/2W

Mal 3%


rễ tơ

Điều kiện bảo quản thích hợp

Gene rol
rolA
rolB rolC
o
VIN002
Môi trường B5, tối, 25 – 27 C
93,3
90,0
96,7
VIN005
Môi trường B5, tối, 25 – 27oC
90,0
93,3
93,3
VIN072
Môi trường W, tối, 25 – 27oC
90,0
80,0
86,7
o
VIN077
Môi trường W, tối, 25 – 27 C
93,3
93,3
90,0
Kết quả khảo sát trên 30 dòng rễ phát triển bình thường (không tạo sẹo, không tạo

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN002

Hình 3.12. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN002.
70
60
50
40
30
20
10
0

FGI (g/g FWi)

Alkaloid tổng số (mg/g DW)

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN005

Hình 3.13. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN005.
70

10
0

FGI (g/g FWi)

Alkaloid tổng số (mg/g DW)

Y alkaloid (mg/g FWi)

01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Dòng rễ tơ đƣợc cảm ứng từ giống Dừa cạn VIN077

Hình 3.15. Biểu đồ chỉ số tăng trưởng, hàm lượng alkaloid tổng số và khả
năng sinh tổng hợp alkaloid của các nhóm dòng rễ tơ từ giống bốn Dừa cạn
VIN077.
Bảng 3.23. Chỉ số tăng trưởng và khả năng sinh tổng hợp alkaloid của bốn
nhóm dòng rễ tơ từ bốn giống Dừa cạn
Nhóm
dòng rễ
Min
tơ
VIN002 8,4
VIN005 7,8
VIN072 7,3
VIN077 6,9

FGI
Max
36,6
31,8

11,8
57,7
23,3
4,4
54,2
17,4

Kết quả thu được từ khảo sát trên 20 dòng khác nhau của mỗi nhóm dòng
rễ tơ.
Tương tự như khi được nuôi cấy trên môi trường thạch, khi được nuôi
cấy trên môi trường lỏng trong môi trường không phù hợp, các dòng rễ có
thể bị gãy vụn, hóa nâu và không phát triển, vài trường hợp sẽ tạo sẹo tự
phát và chồi tự phát. Hai dòng rễ tơ VIN002-12 và VIN005-07 tăng trưởng
tốt trên môi trường lỏng 1/2B5 trong khi hai dòng rễ VIN072-15 và
VIN077-09 tăng trưởng tốt trên môi trường lỏng 1/2W.

- 15 -


FGI

25

VIN002-12
VIN005-07
VIN072-15
VIN077-09

20
15

VIN005-07
VIN072-15
VIN077-09

0

7

14

21 28 35 42
Thời gian (ngày)
Hình 3.17. Đồ thị đường cong tăng trưởng của các dòng rễ tơ chọn lọc theo
trọng lượng tươi (trên) và trọng lượng khô (dưới).

Nguồn carbon thích hợp cho cả bốn dòng rễ tơ chọn lọc phát triển là
sucrose 2%. pH ban đầu của môi trường nuôi cấy bốn dòng rễ tơ cần được
kiểm soát trong dãy 6,0-6,5. Ở các điều kiện nuôi cấy chọn lọc, cả bốn
dòng rễ có pha thích nghi kéo dài đến ngày thứ 14 sau khi cấy (Hình 3.17).
Dòng rễ VIN002-12 và VIN077-09 có pha tăng trưởng kết thúc ở ngày thứ
35 trong khi hai dòng rễ VIN005-07 và VIN072-15 kết thúc ở ngày thứ 28
sau khi cấy. Khi kết thúc pha tăng trưởng, các dòng rễ tơ chọn lọc VIN00212, VIN005-07, VIN072-15 và VIN077-09 đạt chỉ số tăng trưởng FGI
tương ứng là 20,41, 20,13, 20,11 và 17,12; năng suất sinh khối khô Ydb
tương ứng là 3,11, 3,13, 3,05 và 2,61 (g/g FWi).
- 16 -


3.6. Ảnh hƣởng của A. rhizogenes trên khả năng sinh tổng hợp alkaloid
của cây Dừa cạn in vivo và rễ tơ
Khi áp dụng A. rhizogenes như yếu tố ngoại sinh bằng cách gây nhiễm


VIN002
C18
Rễ thử thật
=




Lá thử thật
=




VIN005
C18
Rễ thử thật
=




Lá thử thật
=




VIN072

không chứa Vindoline và hai dòng VIN005-07 và VIN072-15 chỉ chứa
- 17 -


Ajmalicine. Dòng VIN077-09 có đầy đủ các alkaloid khảo sát, tuy nhiên có
chỉ số tăng trưởng FGI và năng suất sinh khối khô Ydb thấp nhất. Ba dòng
rễ VIN002-12, VIN005-07 và VIN072-15 có FGI và Ydb tương đương.
So sánh giữa áp dụng A. rhizogenes như yếu tố nội sinh (gây nhiễm trực
tiếp lên thân cây in vivo) và như yếu tố nội sinh (thông qua rễ tơ được
chuyển gen rol) cho thấy rễ tơ có biểu hiện tăng khả năng sinh tổng hợp
alkaloid cao hơn rễ cây được gây nhiễm trực tiếp (Bảng 3.44). Đáp ứng
tăng biểu hiện sinh tổng hợp alkaloid phụ thuộc vào từng giống Dừa cạn.
Ngoài ra, kết quả so sánh cũng cho thấy rễ tơ có khả năng tổng hợp
Ajmalicine cao hơn nhưng Catharanthine, Vindoline, Vinblastine và
Vincristine thấp hơn rễ cây được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes.
Bảng 3.44. So sánh hàm lượng alkaloid tổng số trong rễ tơ và trong rễ cây
in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes với rễ cây đối chứng
Giống Dừa
Rễ thử thật so với đối
Rễ tơ so với đối
cạn
chứng
chứng
VIN002
+ 1,51b
+ 2,26b
VIN005
+ 2,69a
+ 5,15a
VIN072

cảm ứng
Hình thái

Đặc
điểm
tăng
trƣởng
trên môi
trƣờng
thạch

Đặc
điểm
tăng
trƣởng
trong
môi
trƣờng
lỏng

Môi trường
Điều kiện nuôi cấy
FGI (g/g FWi)
Alkaloid tổng số
(mg/g DW)

Dòng rễ tơ chọn lọc
VIN002-12 VIN005-07 VIN072-15 VIN077-09
VIN002



8,93c

Yalkaloid (mg/g FWi)

57,9ns

58,4ns

57,7ns

54,2ns

Môi trường
pH
Nguồn carbon
Thời gian kết thúc
pha tăng trưởng
FGI cuối pha tăng
trưởng (g/g FWi)

1/2B5

1/2B5
1/2W
6,0 – 6,5
Sucrose 2%

1/2W


8,11c

9,09b

10,47a

8,24c

25,29b

28,46b
Ajm
1,287b
-

31,94a

21,51c

Cat 0,756a
Năng suất các
Ajm 1,648a
alkaloid thành phần VCR 0,020b
(mg/g FWi)
VBL 0,801a

Cat 0,258b
c
Ajm 1,069 Ajm 1,296b
VCR 0,040a

với pH ban đầu của môi trường 6,0 – 6,5 và nguồn carbon thích hợp là
sucrose 2%.
- Rễ tơ Dừa cạn mang gen rol được chuyển từ A. rhizogenes C18 và
C26 có khả năng sinh tổng hợp alkaloid cao hơn rễ cây in vivo được gây
nhiễm trực tiếp với A. rhizogenes. Trong đó, khả năng sinh tổng hợp
Ajmalicine ở rễ tơ cao hơn rễ cây in vivo được gây nhiễm trực tiếp với A.
rhizogenes nhưng khả năng sinh tổng hợp Catharanthine, Vindoline,
Vinblastine và Vincristine thì ngược lại.
- 20 -


- Chủng A. rhizogenes C18 có tiềm năng ứng dụng để làm tăng khả
năng sinh tổng hợp Ajmalicine, Vindoline, Vincristine và Vinblastine trên
lá của giống Dừa cạn VIN005 bằng cách gây nhiễm trực tiếp lên thân.
- Hai dòng rễ tơ VIN002-12 và VIN077-09 có hiện diện nhiều alkaloid
có giá trị và có khả năng tăng trưởng cao mà không cần bổ sung hormone
có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu thu nhận sinh khối rễ tơ giàu
Ajmalicine, Catharanthine, Vindoline, Vincristine và Vinblastine.
4.2. Đề nghị
Từ những kết quả đã thu được bước đầu trong luận án này cũng như
dựa trên những phân tích tổng quan ban đầu, chúng tôi nhận thấy sự cấp
thiết giải quyết các vấn đề như sau:
- Nghiên cứu bảo tồn các chủng A. rhizogenes đã phân lập được
nhằm bào tồn công cụ chuyển gen phục vụ cho nghiên cứu rễ tơ.
- Nghiên cứu thêm các điều kiện khác và phương pháp khác để bảo
quản bốn dòng rễ chọn lọc nói riêng cũng như rễ tơ từ cây Dừa cạn để phục
vụ việc bảo tồn những dòng rễ mục tiêu sau này.
- Nghiên cứu nuôi cấy bốn dòng rễ chọn lọc hướng đến các mục tiêu
thu nhận alkaloid, đặc biệt là hai dòng VIN002-12 và VIN077-09.
Ngoài ra, dựa trên những kết quả bước đầu này, chúng tôi cho rằng

nuôi cấy lên sự cảm ứng rễ chuyển gen từ các giống cây Dừa cạn
(Catharanthus roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C18”,
Tạp chí KHKTNLN, Trường ĐH Nông Lâm Tp.HCM, tập 2, 26-33.
6. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2016), “Ảnh hưởng của các yếu tố
nuôi cấy lên sự cảm ứng rễ chuyển gen từ cây Dừa cạn (Catharanthus
roseus) của chủng Agrobacterium rhizogenes C26”, Tạp chí Khoa học,
Trường ĐH Cần Thơ, tập 44b. 96-103.
- 22 -


7. Nguyễn Nhƣ Nhứt và Bùi Văn Lệ (2015), “Ảnh hưởng của các hợp
chất phenol trong huyền phù Agrobacterium rhizogenes lên khả năng
cảm ứng hình thành rễ chuyển gen từ cây Dừa cạn (Catharanthus
roseus)”, Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP TPHCM, tập 12(78), 152160.

- 23 -