i

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ DÒNG XẠ KHUẨN Streptomyces spp. ĐỐI
KHÁNG VỚI TÁC NHÂN GÂY BỆNH THỐI RỄ TRÊN CÂY CÓ MÚI

Tác giả
HUỲNH NGỌC QUANG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu
cấp bằng kỹ sư ngành Bảo vệ thực vật

NGƯỜI HƯỚNG DẪN:

TS. Võ Thị Thu Oanh

ThS. Đặng Thị Kim Uyên
Tp Hồ Chí Minh, tháng 07/2012


ii

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin được khắc ghi công ơn sinh thành dưỡng dục của cha mẹ, sự
động viên thương yêu sẻ chia những người thân trong gia đình trong suốt thời gian qua.
Tiếp đến, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS. Võ Thị Thu
Oanh và ThS. Đặng Thị Kim Uyên vì đã giúp tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình.
Đồng thời, tôi xin trân trọng biết ơn đến:
Ban chủ nhiệm khoa Nông học và ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh và đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp .
Ban Lãnh Đạo Viện, các anh chị làm việc tại bộ môn BVTV Viện Cây ăn Quả
Miền Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp.

nấm Fusarium solani (VBTG-5, VBTG-6 và VQTG-7), 5 chủng thể hiện tính đối kháng ở
các mức độ khác nhau lần lượt là chủng VCTG-1, VCTG-2, VCTG-3, VBTG-4 và
VQTG-8. Trong đó chủng VBTG-4 là thể hiện tính đối kháng lớn nhất.
Thí nghiệm đối kháng với nấm Phytophthora nicotianae trên đĩa petri: kết quả đạt
được là trong 8 chủng xạ khuẩn phân lập được thì có 2 chủng không thể hiện tính đối
kháng với Phytophthora nicotianae là VCTG-3 và VBTG-5, 6 chủng còn lại thể hiện tính


iv

đối kháng ở các mức độ khác nhau gồm các chủng VCTG-1, VCTG-2, VBTG-4, VBTG6, VQTG-7 và VQTG-8. Trong đó chủng VQTG-8 là thể hiện tính đối kháng lớn nhất.


v

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

TRANG TỰA………………………………………………………………………………i
LỜI CẢM ƠN.......................................................................................................................ii
TÓM TẮT........................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ............................................................................................................................ v
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...............................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................... viii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................................ix
Chương 1 GIỚI THIỆU ....................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu .......................................................................................................................... 2

điều kiện in vitro ................................................................................................................. 39
4.2.1 Khả năng đối kháng với nấm Fusarium solani ở phòng thí nghiệm ............................ 39
4.2.2 Khả năng đối kháng với Phytophthora nicotianae ở phòng thí nghiệm........................ 43
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 47
5.1 Kết luận ......................................................................................................................... 47
5.2 Đề nghị .......................................................................................................................... 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 48
PHỤ LỤC............................................................................................................................ 52


vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1: Đặc điểm 8 chủng xạ khuẩn phân lập được..............................................................39
Bảng 4.2: Khả năng đối kháng của 8 chủng xạ khuẩn đối với nấm Fusarium solani………..40
Bảng 4.3: Mức độ đối kháng của 8 chủng xạ khuẩn đối với nấm Fusarium solani……....42
Bảng 4.4: Khả năng đối kháng của 8 chủng xạ khuẩn đối với Phytophthora
nicotianae....................................................................................................................................44
Bảng 4.5: Mức độ đối kháng của 8 chủng xạ khuẩn đối với Phytophthora
nicotianae…................................................................................................................................46


viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 3.1: Sơ đồ minh họa đĩa cấy nuôi xạ khuẩn trên lam.......................................................25
Hình 4.1: Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn VCTG-1...................................................30
Hình 4.2: Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn VCTG-2...................................................31
Hình 4.3: Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn VCTG-3...................................................32
Hình 4.4: Đặc điểm hình thái của chủng xạ khuẩn VCTG-4...................................................33

1

Chương 1
GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề
Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi… là một họ cây
ăn quả lớn, được nhiều người ưa chuộng và được nhiều nhà vườn trồng. Cây có nhiều
công dụng như dùng để làm nước giải khát, ăn tươi, làm mứt, lấy tinh dầu cất từ vỏ quả,
lá, hoa. Vỏ có thể dùng để làm thuốc, hương liệu.
Tuy nhiên với tình hình sâu bệnh ngày càng phát triển mạnh mẽ như hiện nay đã
làm ảnh hưởng không nhỏ đến việc canh tác cây có múi. Trong đó thì bệnh vàng lá thối rễ
cũng là một trong những tác nhân quan trọng gây hại nặng trên các loại bưởi, cam sành,
quýt,…làm ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng quả. Để giải quyết tình trạng đó thì đa
số bà con nông dân đều lựa chọn phương pháp sử dụng thuốc hóa học. Tuy nhiên việc
lạm dụng các loại thuốc hóa học đã làm ảnh hưởng xấu đến môi trường, làm mất cân bằng
sinh thái: tăng tính kháng thuốc, tiêu diệt các thiên địch tự nhiên, làm xuất hiện trở lại một
số dịch hại và gây ô nhiễm môi trường.
Cho nên việc nghiên cứu các biện pháp sinh học để phòng trừ bệnh hại cây trồng là
điều rất cần thiết. Vì biện pháp sinh học có những ưu điểm hơn hẳn so với biện pháp hóa
học và có khả năng khắc phục được những hạn chế của biện pháp hoá học như: không độc
đối với con người, động vật và môi trường. Chính vì thế mà các biện pháp sinh học ngày
càng được nghiên cứu và phổ biến rộng rãi. Trong nhiều hướng nghiên cứu về biện pháp
sinh học thì có một hướng nghiên cứu cũng được rất nhiều người quan tâm. Đó là sử dụng
các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn để phòng trừ các tác nhân gây hại cho cây
trồng.


2

Hiện nay phần lớn các chất kháng sinh đều có nguồn gốc từ xạ khuẩn mà xạ khuẩn

Số lượng xạ khuẩn ít dần đi trong đất kiềm hoặc axit và hầu như không có trong đất rất
kiềm.
2.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
2.1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn
a. Khuẩn lạc
Xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (trừ
cuống sinh bào thử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với
đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 - 1 μm đến 2 - 3 μm, chiều dài có thể đạt tới một vài
cm (Nguyễn Lân Dũng và ctv., 2010).


4

Kích thước và khối lượng hệ sợi là một trong những đặc điểm để phân biệt khuẩn
lạc của xạ khuẩn với khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn
thay đổi từ 5 – 50 μm, dễ quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ướt như ở vi khuẩn, nấm men mà thường rắn
chắc, thô ráp, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, không trong suốt, do đó bề mặt
của khuẩn lạc có thể nhẵn, có mấu lồi, có nếp nhăn hoặc sần sùi như vỏ cam sành. Khuẩn lạc
có màu sắc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng... tùy thuộc vào loài và điều kiện
ngoại cảnh.
Khuẩn lạc của xạ khuẩn dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo
thành nhiều vòng tròn đồng tâm, khác với khuẩn lạc của nấm mem, nấm mốc và vi khuẩn,
khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, bề mặt xạ khuẩn xù xì có thể lỏm xuống, có mấu lồi,
nếp nhăn hoặc sần sùi.
Đường kính của mỗi khuẩn lạc khoảng 0,5 – 2 cm nhưng cũng có những khuẩn lạc đạt
tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn.
b. Khuẩn ty
Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu
vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất – substrate mycelium) với chức năng

- Loại II: có thành phần chính là acid meso - A2pm (m-ADP) và glixin.
- Loại III: có thành phần chính là acid meso - A2pm.
- Loại IV: có thành phần chính là acid meso - A2pm, arabinose và galactose.
- Loại V: có thành phần chính là acid lysine và ornitin.
- Loại VI: có thành phần chính là acid lysine và asparagin.
- Loại VII: có thành phần chính là acid lysine, acid diamino butyric và asparagin.
- Loại VIII: có thành phần chính là acid asparagin.


6

Tất cả các loại thành tế bào đều chứa alanine, acid glutamic, glucosamine và acid
muramic. Ngay sát dưới thành tế bào là màng sinh chất bao quanh tế bào chất. Màng sinh
chất được cấu tạo bởi 2 thành phần là phospholipid và protein, màng giữ vai trò quan trọng
trong quá trình trao đổi chất và hình thành bào tử của xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng và
Nguyễn Kim Nữ Thảo, 2006).
Nguyên sinh chất và nhân của tế bào xạ khuẩn khá giống với tế bào vi khuẩn. Trong
nguyên sinh chất có chứa mezosome, thể nhân, không bào và các thể ẩn nhập.
2.1.3 Vai trò của xạ khuẩn
Xạ khuẩn phân bố chủ yếu trong đất và đóng vai trò rất quan trọng trong chu trình
tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và
phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như xenlulo, chất mùn kitin, lignin,...
Đặc tính của xạ khuẩn là khả năng tiết ra kháng sinh dùng làm thuốc trị bệnh cho
người, gia súc và cây trồng. Đa số các chất kháng sinh được dùng trong y học có nguồn
gốc từ xạ khuẩn, trong số đó có nhiều chất hiện vẫn đang được sử dụng tương đối phổ
biến trong thực tiễn.
Xạ khuẩn còn có khả năng sinh ra các vitamin thuộc nhóm B (B1 , B2 , B6 , B12...) một
số acid amin như acid glutamic, acid metionin, tryptofan, lizin và các acid hữu cơ như acid
lactic, acid acetic.
Xạ khuẩn còn có khả năng tiết ra enzym (proteaza, amylaza,...) có thể dùng xạ khuẩn


2.2 Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces
2.2.1 Vị trí phân loại và phân bố
Chi Streptomyces có vị trí phân loại như sau:
Giới:

Bacteria

Ngành :

Actinobacteria

Lớp:

Actinobacteria

Dưới lớp:

Actinobacteridae

Bộ:

Actinomycetales

Dưới bộ:

Streptomycineae

Họ:


các xạ khuẩn khác được phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống được nhiều vi khuẩn
Gram (+) và Gram (-) (Fhrlich, 1944).
Daunorubixin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces coeruleorubidus, được
dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính.
Dactinomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces antibiticus, có hoạt tính
kìm hãm phát triển các khối u ác tính. Được dùng để điều trị một số bệnh ung thư.
Eritromixin (erixin, eritoxin, plotixin): thu nhận được từ Actinomyces erythreus là
chất kháng sinh có phổ rộng đối với vi khuẩn Gram (+), được sử dụng nhiều nhất trong
điều trị bệnh viêm phổi do Mycoplasma và viêm họng do liên cầu khuẩn (Mc. Guire,
1952).
Kanamixin: thu thập được từ Actinomyces kamamyceticus (Umezawa).
Neomixin: thu được từ Actinomyces fradiae hay một số xạ khuẩn khác, là chất
kháng sinh có hoạt phổ rộng có tác dụng chống cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)
(Waksman, Kechevalier, 1949).
Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces
niverus, có hoạt tính mạnh với các vi khuẩn Gram (+).


10

Oxiteraxiclin (tetraxiclin, oximicoin): thu thập được từ xạ khuẩn Actinomyces
rimosus (Finley, 1950).
Tetracyclin: Là kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn
thuộc chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ kháng sinh rộng, chống được cả
vi khuẩn Gram (+) và Gram (-), ricketsia và một vài loài virus lớn.
Streptomycin: thu được từ xạ khuẩn Streptomyces griceus còn gọi là Actinomyces
streptomycin có khả năng chống các vi khuẩn Gram (+) khá mạnh. Streptomycin được sử
dụng rất hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch, ho gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là
dùng để chữa các bệnh lao (Shatz, Bugie and Waksman, 1944).
2.2.2.2 Ứng dụng trong y học

rộng, kháng nấm và vi khuẩn nhưng mạnh nhất là chống chủng Pseudomonas
solanacearum gây bệnh héo lá ở cây trồng.
Nhiều kết quả nghiên cứu khác cũng cho thấy xạ khuẩn có khả năng đối kháng với
nấm tốt, chúng là vi sinh vật sống ở vùng rễ. Các loài Streptomyces và một số xạ khuẩn
khác cho thấy có thể bảo vệ nhiều loại cây trồng tránh khỏi nhiều loại nấm đất gây bệnh,
cả đối với các thí nghiệm trong nhà lưới và ngoài đồng (Tahvonen, 1982).
Theo Blaak và ctv. (1993) thì các loài Streptomyces spp. có thể kí sinh hoặc tấn công
các

nấm

gây

thối

rễ

như

Fusarium,

Rhizoctonia,

Pythium,

Phytophthora,

Phytomatotricum, Aphanomyces, Sclerotinia, Verticillium,….Dịch rễ cây có thể kích thích
sự tăng trưởng của xạ khuẩn Actinomycetes để khống chế nấm bệnh, trong đó xạ khuẩn sử
dụng dịch tiết từ cây để tăng trưởng và tổng hợp chất kháng nấm. Có trên 50 loại kháng


Rutaceae

Chi:

Citrus spp.

Cây có múi là tên gọi chung của nhóm cây cam, chanh, quýt, bưởi… có nguồn gốc
nằm trong vùng trải dài từ sườn núi phía Nam của dãy Hy Mã Lạp Sơn đến miền Bắc
Myanmar. Một số cam quýt có nguồn gốc ở Nam Trung Quốc, Việt Nam và cả Nhật Bản
(Nguyễn Văn Kế, 2008).
2.3.2 Công dụng cây có múi
Cam quýt là một loại cây phổ biến, có giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng cao.
Trong thành phần quả có chứa 6 – 12 % đường và nhiều loại Vitamin, provitamin A, E.


13

Đặc biệt là Vitamin C từ 40 – 90 mg/100 g tươi. Các acid hữu cơ từ 0,4 – 1,2 %, có nhiều
loại acid có hoạt tính sinh học cao cùng với các chất khoáng và dầu thơm.
Quả cam quýt còn được dùng để ăn tươi, làm mứt và nước giải khát. Tinh dầu
được cất từ vỏ quả, lá, hoa được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và chế mỹ
phẩm.Vỏ được dùng làm thuốc, hương liệu.
Vì là loại cây bổ dưỡng, lại cung cấp nhiều Vitamin C nên từ xưa đến nay loại quả
này được xem như món quà truyền thống để đi thăm hỏi người bệnh.
2.3.3 Tình hình sản xuất cây có múi
Trên thế giới, từ năm 1985 đến năm 1995, khối lượng và nhu cầu đối với cây có múi
tăng vọt từ 48 triệu tấn lên đến 80 triệu tấn. Diện tích trồng cây có múi rộng khoảng hơn
3,5 triệu ha đất trên toàn thế giới và bình quân 1 cây cây có múi cung cấp quả cho 5 dân
cư của hành tinh tương đương 15 kg/người/năm (Aubert và ctv., 1998).

Theo Sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh Tiền Giang, bệnh vàng lá thối
rễ gây hại trên 3.332 ha cây có múi. Nhiều nhất là huyện Tam Bình: 2.268 ha và Trà Ôn:
637 ha. Trong đó bệnh gây nhiễm với tỷ lệ từ 10 – 30% diện tích (cao nhất 50%) ở các
huyện Tam Bình, Mang Thít, Trà Ôn và Vũng Liêm.
2.3.4.2 Triệu chứng bệnh vàng lá thối rễ
Bệnh gây hại ở cổ rễ và giáp mặt đất. Trên rễ lúc đầu là một chấm nhỏ màu nâu sau
chuyển sang nâu đen và lan rộng bao quanh phần vỏ cổ rễ, vỏ bị thối khô, nứt và bong
tróc ra để trơ phần gỗ phía trong. Nấm có thể căn sâu vào thân làm thân bị khô đen, các rễ
phía dưới cũng bị thối đen.
Cây bị bệnh lá vẫn lớn bình thường, nhưng gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả
màu vàng xanh và sau đó rụng đi, các lá già rụng trước sau đó dẫn đến các lá trên. Nhìn
vào cây thấy gốc trơ trụi chỉ còn lại lá đọt. Lúc đầu chỉ một vài nhánh biểu hiện vàng lá


15

rụng lá, nhưng sau đó hoàn toàn cây sẽ bị rụng lá. Cây cho nhiều chồi ngắn, lá nhỏ, nhiều
hoa, trái, trái chua và cuối cùng cây chết hẳn.
Đào rễ lên thấy phía cành bị rụng lá thấy rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị
sọc nâu lan dần vào rễ lớn. Bệnh nặng tất cả các rễ cây đều bị thối và cây chết (Nguyễn
Thị Thu Cúc và Phạm Hoàng Oanh, 2002).
2.3.4.3 Điều kiện phát sinh, phát triển bệnh
Bệnh gây hại ở giai đoạn cây con và cây trưởng thành, xuất hiện quanh năm,
nhưng thường bắt đầu phát triển vào đầu mùa nắng, khoảng tháng 11 và 12 hàng năm.
Điều kiện đất, nước đặc trưng ở ĐBSCL giữ vai trò rất quan trọng đối với bệnh
vàng lá thối rễ. Đất có thành phần sét cao trong sa cấu tạo ra tình trạng tế khổng trong đất
rất nhỏ, làm cho đất khó thoát nước sau những đợt mưa dài vào giữa và cuối mùa mưa.
Nước trong tế khổng lâu dài sẽ dẫn đến tình trạng đất bị yếm khí do oi nước. Tình trạng
này nếu kéo dài sẽ làm rễ cây phải hô hấp yếm khí lâu dài, các chất độc sinh ra không
được oxit hóa để giải độc, tích lũy trong các tế bào non ở rễ sẽ dẫn đến chết và gây thối ở

của Vĩnh Long, Long Tuyền của Cần Thơ, Lai Vung của Đồng Tháp cho thấy hầu hết các
vườn đều bị vàng lá thối rễ do tập đoàn nấm đất gây ra như: Fusarium sp., Pythium sp. và
Phytophthora sp. trong đó Fusarium có tần số xuất hiện cao nhất và có sự xuất hiện của
các loại tuyến trùng như Pratylenchus sp., Tylenchulus sp., Radopholus sp., Meloidogyne
sp.,…(Nguyễn Ngọc Anh Thư và ctv, 2005).
Mặt khác, Phytophthora spp. được coi là nguyên nhân gây ra một số bệnh trên cây
có múi như thối rễ, thối nâu trên quả và thối gốc chảy mủ cả trên gốc ghép và mắt ghép.
Năm 2010, Nguyễn Thị Hằng đã kiểm chứng tác nhân gây bệnh vàng lá thối rễ trên
cây có múi trong điều kiện in vitro cho thấy tỉ lệ nhiễm bệnh đối với Pythium sp. là 100%,
Fusarium sp. là 88,33%, Phytophthora sp. là 85%, do đó kết luận rằng cả 3 dòng nấm trên
đều là tác nhân gây bênh thối rễ trong điều kiện in vitro. Đồng thời nhóm nghiên cứu
cũng xác định bưởi đường da láng có khử năng chống chịu tốt với nấm Phytophthora sp.,
bưởi bánh xe chống chịu tốt với nấm Fusarium sp. và không có giống bưởi nào chống