BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

THỬ NGHIỆM MỘT SỐ CHẾ PHẨM PHÒNG BỆNH GAN
THẬN MỦ TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878)

Họ và tên sinh viên: ĐỖ VIẾT PHƯƠNG
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2004-2008

Tháng 10/2008


THỬ NGHIỆM MỘT SỐ CHẾ PHẨM PHÒNG BỆNH GAN THẬN MỦ
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878)

Tác giả

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư
ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn: T.S NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 10 năm 2008
ii

kết hợp của 2 loại hợp chất này trong việc phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra. Sau
một thời gian cho cá sử dụng các hợp chất này chúng tôi tiến hành 2 lần gây nhiễm.
Gây nhiễm lần 1: Nhằm xác định khả năng bảo hộ miễn dịch của hợp chất ImP,
OrP và sự kết hợp của 2 loại hợp chất này. Mỗi nghiệm thức có 3 lần lặp lại với số
lượng cá cho mỗi lần lặp lại là 100 con. 30 ngày sau khi kết thúc việc cung cấp các
hợp chất cần thử nghiệm tiến hành gây cảm nhiễm đối với cá nuôi. Gây cảm nhiễm
bằng phương pháp ngâm cá trong dung dịch vi khuẩn với mật độ 7,62 x 106CFU/mL
bằng chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri VL33. theo dõi trong 14 ngày. Kết quả cho
thấy ở nghiệm thức sử dụng hợp chất chất ImP, OrP và sử dụng kết hợp của 2 loại hợp
chất này đã cho hiệu quả bảo hộ miễn dịch lần lượt là 25,19; 15,26; 51,91 %.
Gây nhiễm lần 2: Thí nghiệm này nhằm mục đích xem khả năng bảo hộ của
việc sử dụng hợp chất ImP, OrP và việc kết hợp 2 loại hợp chất này có còn hiệu quả
trong thời gian dài. Đồng thời thử nghiệm khả năng bảo hộ khi sử dụng nhắc lại hợp
chất OrP đối với nghiệm thức kết hợp 2 loại hợp chất này. Tiến hành cho ăn nhắc lại
hợp chất OrP từ ngày thứ 80 đến hết ngày 86 tính từ ngày ngưng cho ăn thức ăn có
trộn hợp chất OrP 2 tuần sau khi ngưng cho ăn nhắc lại, tiến hành gây cảm nhiễm đối
với cá nuôi. Gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm cá trong dung dịch vi khuẩn với
mật độ 8,05 x 106CFU/mL bằng chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri VL33. theo dõi
trong 14 ngày Kết quả cho thấy hiệu quả bảo hộ miễn ở nghiệm thức chỉ sử dụng hợp
chất ImP, OrP, sử dụng kết hợp 2 loại hợp chất này và nghiệm thức cho ăn nhắc lại
cho hiệu quả bảo hộ miễn dịch lần lượt là 11,11; 8,89; 28,89; 46,66%.

iv


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa
Cảm tạ


1.1 Đặt vấn đề

1

1.2 Mục Tiêu Đề Tài

2

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN

3

2.1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra

3

2.1.1 Sơ lược về bệnh

3

2.1.2 Tác nhân gây bệnh

3

2.1.3 Đường lây truyền của E. ictaluri vào cơ thể cá

5

2.1.4 Triệu chứng


8

2.2.3 Các đáp ứng miễn dịch cục bộ

9

2.3 Tổng quan về việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản

10

2.3.1 Định nghĩa về vaccine

10

2.3.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản

10

2.3.3 Phân loại vaccine

11

2.3.4 Vai trò của việc sử dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản

12

2.3.5 So sánh giữa việc sử dụng vaccine và kháng sinh

14


19

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

19

3.2 Vật liệu nghiên cứu

19

3.2.1 Dụng cụ

19

3.2.2 Hóa chất và môi trường

19

3.3 Đối tượng nghiên cứu

19

3.3.1 Hợp chất thí nghiệm

19

3.3.2 Cá thí nghiệm

20


3.4.6 Phương pháp cấy thuần

22

3.4.7 Phương pháp định danh

22

3.4.7.1 Phương pháp nhuộm Gram

23

3.4.7.2 Thử nghiệm về khả năng di động của vi khuẩn bằng

24

cách xem trực tiếp dưới kính hiển vi
3.4.7.3 Thử nghiệm catalase

24

3.4.7.4 Thử nghiệm Oxidase

24

3.4.7.5 Thử nghiệm LDC và di động bằng kit định danh IDS 14 GNR

24

3.4.7.6 Thử nghiệm các phản ứng sinh hóa trên bảng nhựa của bộ định

3.4.12 Phương pháp xử lí số liệu

32
vii


CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

33

4.1. Các chỉ tiêu môi trường

33

4.2 Kết quả quá trình kiểm tra sức khỏe cá nuôi trong quá trình thực hiện đề tài 33
4.2.1 Tỷ lệ sống của cá

33

4.2.2 Kết quả kiểm tra tăng trọng cá nuôi

34

4.2.3 Kết quả kiểm tra vi khuẩn

34

4.2.4 Kết quả kiểm tra kí sinh trùng

34

4.5.5 Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức

45

4.5.6 Kết quả kiểm tra cá còn sống sau khi gây nhiễm lần 1

46

4.5.7 Kết quả kiểm tra hàm lượng kháng thể trong huyết thanh

47

4.6 Kết quả gây nhiễm lần 2

48

4.6.1 Trọng lượng cá khi gây nhiễm lần 2

48

4.6.2 Số lượng vi khuẩn sống có trong dung dịch tăng sinh và

48

số lượng vi khuẩn sống có trong dung dịch gây nhiễm cho cá.
4.6.3 Kết quả quá trình phân lập và định danh vi khuẩn

49

4.6.4 Tỷ lệ cá chết ở các nghiệm thức

TÀI LIỆU THAM KHẢO

56

PHỤ LỤC

58

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: So sánh giửa kháng sinh và vaccine

14

Bảng 3.1: Số thứ tự các đĩa giấy trong các giếng

23

Bảng 4.1: Các chỉ tiêu môi trường trong quá trình thí nghiệm

33

Bảng 4.2: Tỷ lệ sống trung bình của các nghiệm thức

34

Bảng 4.3: Cường độ cảm nhiễm sán lá trung bình (sán/cung mang/cá)



47

khi gây nhiễm lần 1
Bảng 4.11: Trọng lượng cá trung bình khi gây nhiễm lần 2

48

Bảng 4.12: Tỷ lệ chết trung bình của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 2

51

Bảng 4.13: Khả năng bảo hộ miễn dịch trung bình của các nghiệm thức

52

khi gây nhiễm lần 2
Bảng 4.14: Tỷ lệ cá còn sống vào ngày thứ 14 có sự tạo thành khuẩn lạc

53

trên đĩa cấy
Bảng 4.15: Hiệu giá kháng thể trung bình của các nghiệm thức
khi gây nhiễm lần 2

x

54




36

Hình 4.4: Thao tác trộn vaccine

37

Hình 4.5: Mô gan cá tra khỏe (H&E, x100), các tế bào gan xếp sát nhau (a),

38

cấu trúc các đảo tụy nguyên vẹn (b)
Hình 4.6: Mô gan cá tra bệnh (H&E, x100), các tế bào gan bị thoái hóa (c),

38

đảo tụy bị phá hủy (d), có hiện tượng xuất huyết (e)
Hình 4.7: Mô thận cá tra khỏe (H&E, x1000), cấu trúc các ống thận nguyên vẹn. 38
Hình 4.8: Mô thận cá tra bệnh (H&E, x1000), cáu trúc các ống

38

thận bị phá hủy
Hình 4.9: mô lách cá tra khỏe (H&E, x100).

39

Hình 4.10: Mô lách cá tra bệnh (H&E, x100). có những vùng hoại tử (t)

39


qua 14 ngày gây nhiễm lần 1.
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ cá chết của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 1

45

Biểu đồ 4.3: Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức

46

khi gây nhiễm lần 1
Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ cá chết tích lũy ở các nghiệm thức qua 14 ngày

50

khi gây nhiễm lần 2
Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ chết của các nghiệm thức khi gây nhiễm lần 2

52

Biểu đồ 4.6: Hiệu quả bảo hộ miễn dịch của các nghiệm thức

53

khi gây nhiễm lần

xiii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT


Phenyl Alanin Deaminnase

LDC

Lysin decarboxylase

FKC

Formaline Killed Cell

DO

Dissolve Oxygen

FAO

Food and Agriculture Organization

Ig

Immunoglobulin

Xh

Xuất huyết

Xhcgv

Xuất huyết các gốc vây

cho nghề nuôi. Khi cá bị nhiễm bệnh người nuôi thường dùng kháng sinh để điều trị
nhưng thường sử dụng một cách tự phát, không theo một hướng dẫn cụ thể nào về mặt
liều lượng cũng như loại kháng sinh sử dụng, do đó đã dẫn đến sự lờn kháng sinh. Hơn
nữa, việc sử dụng kháng sinh trong việc điều trị bệnh tạo ra một hệ lụy nghiêm trọng là
sự tồn dư của kháng sinh trong cơ thịt cá, không thân thiện với môi trường. Mặt khác
một khi dịch bệnh đã xảy ra thường gây thiệt hại nghiêm trọng.
Để giải quyết vấn đề trên nhiệm vụ đặt ra là phải tìm một giải pháp thích hợp
vừa thân thiện với môi trường vừa ngăn ngừa được sự bùng phát của dịch bênh. Trước
yêu cầu đặt ra, liệu pháp phòng bệnh cho cá bằng chế phẩm là phương pháp được coi
1


là hữu hiệu nhất. Do đó chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Thử nghiệm một số
chế phẩm phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus
Sauvage, 1878)”.
1.2 Mục Tiêu Đề Tài
Khảo sát khả năng bảo hộ miễn dịch của một số chế phẩm trong việc phòng
bệnh gan thận mủ trên cá tra.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh Gan Thận Mủ Trên Cá Tra
2.1.1 Sơ lược về bệnh
Bệnh gan thận mủ trên cá tra lần đầu tiên được mô tả ở đồng bằng sông Cửu
Long vào cuối năm 1998 (Ferguson và ctv. 2001).
Khi cá bị nhiễm bệnh tỉ lệ chết cao từ 10 - 90% tùy theo cách quản lí và cỡ cá

chúng sẽ ức chế hoặc làm cho E. ictaluri phát triển rất chậm (Shotts và Walman,
1990).
+ Bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây ra được tìm thấy ở loài cá trê sông
(Ictalurus punctatus) (Hawke, 1979) còn có 2 loài khác như: cá trê sông xanh (Ictaluri
purcatus) và cá trê sông trắng (Ictalurus catus) (Plumb and Sanchez, 1983), cá trê
trắng (Clarias batrachus) (Kasornchandra, 1987) ở Thái Lan.
+ E. ictaluri có khả năng sinh tồn yếu, do nó chỉ sống được trong nước một
thời gian ngắn, khoảng 8 ngày (Hawke, 1979). Tuy nhiên, chúng có thể tồn tại trong
bùn đến 95 ngày ở 25 oC (Plumb và Quinlan, 1986).
+ Bệnh do E. ictaluri có khả năng lây lan mạnh với tỷ lệ chết cao. Bệnh có
thể lây trực tiếp từ cá sang cá thông qua chất thải như phân cá bệnh hoặc do cá khỏe ăn
cá bệnh, cá chết.
+ E. ictaluri có thể lây từ ao này sang ao khác qua lưới, vợt hay một số dụng
cụ khác dùng chung giữa các ao. Tuy nhiên, nếu các dụng cụ này được phơi nắng trực
tiếp thì có khả năng giết chết vi khuẩn.
+ Chim, cò, vật nuôi (chó, mèo…) và người cũng góp phần làm lây lan mầm
bệnh.

4


2.1.3 Đường lây truyền của E. ictaluri vào cơ thể cá
E. ictaluri có thể lây nhiễm cho cá bằng 2 con đường khác nhau:
+ Vi khuẩn trong nước có thể xâm nhập vào cơ thể của cá thông qua đường
mũi. Sau khi xâm nhập vào cơ quan khứu giác của cá chúng sẽ di chuyển vào dây thần
kinh khứu giác sau đó vào não (Miyazaki và Plumb, 1985; shotts và ctv, 1986). Bệnh
lan rộng từ màng não đến sọ và da màng hộp sọ.
+ E. ictaluri cũng có thể xâm nhiễm qua đường tiêu hóa, qua niêm mạc ruột
vào máu gây nhiễm trùng máu (Sotts và ctv, 1986). Bằng con đường này thì vi khuẩn
vào mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố da. Cá da trơn còn nhiễm

ra sông, rạch, trên mặt đất, cần được chôn vào các hố cách ly có rải vôi sống (CaO) để
tiệt trùng.
Vào mùa dịch bệnh, nhất là về mùa mưa lũ không nên cho cá tra ăn cá tạp tươi
sống. Thức ăn cần được nấu chín, tốt nhất nên sử dụng thức ăn viên.
Khi cải tạo ao cá bệnh mủ gan cần cải tạo kỹ bằng vôi CaO (12 - 20 kg/100m2).
Trong ao nuôi luân phiên mỗi tuần nên sử dụng CaCO3 (2 - 4 kg/100m3 nước)
và Zeolite. Duy trì oxy trong nước > 2,5 mg/L.
2.1.6.2 Trị bệnh
Theo các nghiên cứu gần đây vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh mủ gan cá tra, basa,
rất nhạy với florphenicol. Đây là loại kháng sinh mới được phép sử dụng để điều trị
bệnh cá đối với nhiều quốc gia trên thế giới.
Florfenicol có hoạt tính chống lại sự phát triển của vi khuẩn bằng cách kết dính
với tiểu đơn vị 50S của ribosom, ngăn chặn cầu nối peptid giữa các acid amin, vì vậy
ức chế sự tổng hợp protein làm cho vi khuẩn này không còn khả năng phát triển và tồn
tại.
Florfenicol có độ tồn dư thấp trong mô cơ. Dùng thuốc liều 10 mg/kg thể trọng
liên tục 12 ngày, khi ngưng sử dụng 7 ngày mức tồn dư trong cơ cá tra còn 0,222 -

6


0,109 ppm (mức cho phép của Việt Nam và Mỹ là 1 ppm) (Schering Plough Animal
Health Comporation, 2005).
2.2 Sơ Lược Về Miễn Dịch Học Ở Cá Xương
Cũng như các loài động vật có xương sống khác hệ thống miễn dịch ở cá cũng
được chia làm 2 nhóm: miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) và miễn dịch
đặc hiệu (miễn dịch thu được).
2.2.1 Miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch tự nhiên)
Đây là loại miễn dịch có sẵn khi cơ thể cá được sinh ra, và nó được di truyền từ
thế hệ này sang thế hệ khác.

Loại miễn dịch này được hình thành và đáp ứng với cấu trúc phân tử của nhân
tố kích thích tạo nên nó và có liên quan đến sự biến đổi thích ứng của hệ thống
Lympho bào dẫn đến sự hình thành kí ức miễn dịch. Các phân tử có khả năng tạo nên
đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tức là sự sản sinh kháng thể (antibody) được gọi là các
kháng nguyên (antigen).
Một khía cạnh quan trọng của miễn dịch đặc hiệu là tính nhớ, hình thành bởi
những biến đổi thích ứng của các quần thể tế bào lympho, nhờ đó mà khi tiếp xúc lại
với cùng loại kháng nguyên, cơ thể sẽ hình thành nên đáp ứng miễn dịch thứ cấp đặc
trưng bởi thời gian phản ứng nhanh với cường độ mãnh liệt hơn. Người ta vận dụng
tính chất này trong việc điều chế vaccine phòng bệnh cho người và vật nuôi.
Miễn dịch đặc hiệu gồm 3 khía cạnh: Miễn dịch dịch thể, miễn dịch qua trung
gian tế bào và kí ức miễn dịch
+ Miễn dịch dịch thể: Liên quan đến việc sản sinh các kháng thể hòa tan
(globulin miễn dịch (Ig)). Khi có kháng nguyên đi vào cơ thể tế bào lympho T hỗ trợ
sẽ hỗ trợ cho tế bào lymho B biệt hóa thành tế bào plasma và sinh ra kháng thể đặc
hiệu với kháng nguyên đã kích thích. Kháng thể có vai trò trong việc vô hiệu hóa các
nhân tố gây bệnh.
+ Miễn dịch qua trung gian tế bào: Khi có kháng nguyên đi vào cơ thể sẽ
kích thích dòng tế bào lympho T biệt hóa thành các loại tế bào như: tế bào độc đặc
hiệu (T killer cell) tác động trực tiếp lên mầm bệnh, hoặc có thể tác động gián tiếp
thông qua việc giải phóng các lymphokin. Các lymphokin này có tác dụng ứng động
8


hoặc hoạt hóa các tế bào khác, đặc biệt là đại thực bào tham gia thực hiện đáp ứng
miễn dịch.
+ Kí ức miễn dịch: Thể hiện thông qua qua hiện tượng đáp ứng miễn dịch thứ
phát mà điển hình là thời gian hình thành kháng thể sớm hơn, và cường độ phản ứng
mãnh liệt hơn so với đáp ứng miễn dịch nguyên phát. Kí ức miễn dịch mang tính đặc
hiệu đối với kháng nguyên. Tuy nhiên hàm lượng kháng thể cực đại hình thành trong

2.3.2 Lịch sử phát triển của vaccine trong nuôi trồng thủy sản
1936, Nybelin đã công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá
đối với vi khuẩn Vibrio angullarum. Đến năm 1939, ông nghiên cứu đáp ứng miễn
dịch của cá đối với Pseudomonas punctada.
1940, Smith công bố nghiên cứu của mình về đáp ứng miễn dịch của cá đối với
Bacterium salmonicida (Aeromonas salmonicida).
1942, Duff chứng minh một cách rõ ràng cá có thể tạo ra kháng thể chống lại vi
khuẩn Bacterium salmonicida.
Từ 1942 – 1946, các công trình nghiên cứu này bị gián đoạn bởi sự bùng nổ của
chiến tranh thế giới.
1966, khi nền công nghiệp nuôi cá hồi phát triển mạnh nhưng cá nuôi thường bị
bệnh đỏ miệng do vi khuẩn Vibrio anugillarum và V. ordalli gây ra nên đã kích thích
sự phát triển vaccine phòng bệnh.
1976, lần đầu tiên tổ chức USDA cấp giấy chứng nhận cho vaccine đầu tiên
trên cá. Đây là loại vaccine có chứa vi khuẩn bất hoạt.
1981, có vaccine dạng tiêm phòng bệnh do vi khuẩn Aeromonas salmonicida
gây ra.
Giữa thập niên 1980, nghề nuôi cá hồi phát triển mạnh tại Nauy và Scotland đã
mở ra một thị trường tiềm năng cho việc tiêu thụ vaccine cũng như thúc đẩy việc
nghiên cứu vaccine. Trong giai đoạn này người ta vẫn dùng vaccine dạng ngâm và
vaccine tiêm dạng nước.

10


Đầu thập niên 90, có vaccine thương mại đầu tiên dạng dầu có chứa chất bổ trợ
là nhũ dầu.
Cũng vào đầu thập niên 90, xuất hiện vaccine dạng ngâm (nhược độc) phòng
bệnh nhiễm trùng máu và đường ruột cho cá da trơn của Mỹ.
Đến năm 1998, xuất hiện vaccine dạng dầu phòng nhiều bệnh khác nhau với