Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

LỜI CẢM ƠN
--------------Trong qua trình thực hiện luận văn khoa học, tôi đa nhận được rất
nhiều sư giúp đỡ, khích lê va động viên của cac Thầy, Cô giao, cac bạn
đồng nghiêp, bạn bè va những người thân trong gia đình. Qua đây, tôi xin
được gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình đến những ca nhân va tập thể đa
hết lòng giúp đơ để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này.
Trước hết, tôi xin bày to lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nguyễn
Thi Mai Phương, phòng Sinh hóa Thực vật, Viên Công nghê sinh học, Viện
Han lâm Khoa học va Công nghê Viêt Nam đa tận tình hướng dẫn, tạo mọi
điều kiện tốt nhất để tôi có thể tìm hiểu, nâng cao kiến thức trong suốt qua
trình học tập, thực hiên nghiên cứu va hoan thiên bản luận văn này.
Tôi xin cảm ơn Đảng ủy, lãnh đạo, chỉ huy va can bô phòng Kỹ thuật
hình sư - Công an thanh phố Ha Nội đa tạo điều kiên giúp đơ trong thời
gian tôi đi học.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình thân yêu, bạn bè, người thân va
đồng nghiệp - những người đa luôn luôn ở bên tôi, luôn động viên, khích lê
va la chô dựa vững chắc cho tôi trong suốt qua trình học tập va nghiên
cứu.

Ha Nội,

thang

năm 2017


Exopolysaccharide

FESEM

Field emission scanning electron microscopy

HPLC

High performance liquid chromatography

NMG

Nanomagostin

NMR

Nuclear magnetic resonance

TLC

Thin layer chromatography

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle’s media

FBS

Fetal Bovine Serum


1.4.4. Alpha- mangostin tư vỏ của quả măng cụt (Garcinia mangostana
L) ............................................................................................................. 27
1.5. Y tưởng nghiên cứu của đề tài ............................................................. 28
Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP........................................ 29
2.1. Dòng tế bào ưng thư và các điều kiện nuôi.......................................... 29
2.2. Nguyên liệu thực vật ............................................................................ 30
2.3. Hóa chất, thiết bị. ................................................................................. 30
2.3.1. Hóa chất ........................................................................................ 30
2.3.2. Thiết bi .......................................................................................... 30
2.4. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 31
3


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

2.4.1. Tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cụt ............................................. 31
2.4.2. Tạo hạt nano polyme micelle bọc AMG (nanomangostin) và đánh
giá các đặc trưng của hạt ......................................................................... 32
2.5. Hoạt tính gây độc lên dòng tế bào ung thư phổi A549 ........................ 33
2.6. Đánh giá sự thâm nhập của hạt NMG vào tế bào ................................ 34
2.7. Đánh giá ảnh hưởng của NMG đến kích thước nhân tế bào................ 34
2.8. Xư ly thống kê...................................................................................... 34
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 34
3.1. Nghiên cứu quy trình tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cụt.................. 34
3.1.1. Tách chiết phân đoạn có chứa AMG tư vỏ quả măng cụt ............ 34
3.1.2. Tinh sạch AMG tư vỏ quả măng cụt ............................................. 37

Bảng 3.1. Đô sạch của chế phẩm α-mangostine so với chất chuẩn

41

Bảng 3.2. Số liệu phân tích phô 1H và 13C của AMG đa tinh sạch

43

Bảng 3.3. Đánh giá hiệu quả mang AMG của các chất nghiên cứu

48

Bảng 3.4. Ảnh hưởng của ti lệ trộn của chất mang β - cyclodextrin
và AMG lên các thông số hạt

49

5


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
Hình

Trang

măng cụt với hệ dung môi rửa chiết n-hexane: acetone theo ti lệ (3:1)

37

38

39

Hình 3.4 A. Sắc ky đô AMG tinh sạch tư vỏ quả măng cụt với hệ
dung

40

môi hexane: acetone (3:1 v/v).
Hình 3.4 B. Sắc ky đô AMG tinh sạch tư vỏ quả măng cụt với hệ
dung

40

môi TEAF (5:3:1:1 v/v)
Hình 3.5. Sắc ky đô HPLC của chất tinh sạch sau khi qua các cột sắc

40

ky silicagel đo trên máy Hitachi – DAD L2455

6


Luận văn Thạc sỹ Khoa


Hình 3.12 A. Ảnh chụp FE-SEM hạt NMG

50

Hình 3.12 B. Ảnh chụp kính hiển vi đồng tu quét laser hạt NMG

50

Hình 3.13. Thế zeta của hạt nanomangostin đo trên máy DLS 3.3

51

Hình 3.14. Hoạt tính gây độc tế bào của NMG tan trong nước lên

52

dòng tế bào ung thư A549
Hình 3.15. Khả năng xâm nhập của NMG vào tế bào ung thư phổi
(A). (B). (C)
Hình 3.16. Hình thái nhân tế bào khi xư ly với AMG và NMG

53
54

7


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

8


Luận văn Thạc sỹ Khoa
Nguyễn Trung
có
họcnhiều đặc tính sinh học quí. Alpha-mangostin (AMG)
Hợplà một dẫn xuất
xanthone tự nhiên phô biến nhất ở vỏ quả măng cụt. Chất này đa được chứng

9


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

minh là có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng viêm và ức chế sự phát
triển của các dòng tế bào ung thư rất cao. Phân tích in vitro cũng khẳng định
chất này ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư ruột HT-29 với IC50 khoảng
6–12 μM đồng thời làm giảm sự biểu hiện của BcL-2 DNA β-catenin. AMG
cảm ứng apoptosis ở các tế bào ung thư đa được nhiều nghiên cứu khăng
định. AMG đưa vào cơ thể theo đường uống cũng làm giảm sự phát triển của
khối u ở chuột. Các nghiên cứu gần đây của Nguyen và cộng sự [20] cho thấy
AMG có khả năng ức chế có hiệu quả sự hình thành biofilm của vi khuẩn
gây sâu răng ở người là Streptococcus mutans. Ngoài ra, AMG còn có tác
dụng ức chế hoạt tính enzyme HIV-1 protease với nồng đô IC50 là khoảng 5,1
M. Vì thế, việc nghiên cứu và ứng dụng chất này đa và đang thu hút sự

trật tự theo quy định của cơ thể (gọi là chết theo chương trình - Apoptosis).
Khi bi ung thư, tế bào phân chia bất thường, không kiểm soát tạo thành các
khối u, di căn khắp cơ thể gọi là ung thư [12].
Ung thư là vấn đề sức khỏe của con người trên toàn thế giới và là một
trong nguyên nhân hàng đầu gây tư vong trên toàn câu. Hiện nay đa phân
thành
5 loại ung thư theo nguồn gốc tế bào: i)Ung thư biểu mô Carcinoma: là loại
ung thư phô biến nhất, chiếm tới 80% tổng số loại ung thư. Chúng được sinh
ra tư các tế bào biểu mô, là loại tế bào bao phủ các bề mặt của da và cơ quan
nội tạng; ii)Ung thư Sarcoma:là loại ung thư xuất hiện tư những thay đổi
trong tế bào của cơ bắp, xương, mỡ, hoặc mô liên kết; iii)Ung thư Leukaemia:
là dạng ung thư các tế bào bạch câu ác tính; iv)Ung thư Lymphoma va
Myelmas: là dạng ung thư của tế bào thuộc hệ thống miễn dịch như hệ bạch
huyết, tủy xương; v)Ung thư hê thống thần kinh: là dạng ung thư bắt nguồn tư
các mô của nao và tủy sống [12].
1.1.1. Các giai đoạn phát triển của bệnh ung thư
-Giai đoạn khởi phát
Bắt đầu tư khi tế bào gốc tiếp xúc với các tác nhân gây đột biến. Quá
trình này diễn ra rất nhanh, hoàn thành trong một vài giây và không thay đổi
được. Trong cuộc đời, con người có rất nhiều tế bào cơ thể trải qua giai đoạn
này, nhưng không phải tế bào nào cũng phát sinh bệnh. Đa số các tế bào khởi
phát hoặc là không tiến triển hoặc là chết đi, hoặc bi hệ miễn dịch của cơ thể
vô hiệu
hóa.
10


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học -Giai đoạn tăng trưởng, thúc đẩy, chuyển biển


liệu di truyền (DNA) của một tế bào bi thay đổi hoặc hư hỏng, làm tăng sinh
vô tô chức các tế bào “lỗi”- tế bào ung thư. Các tế bào ung thư này không chết
đi theo chương trình được lập trình sẵn (apoptosis) như các tế bào bình thường
mà tiếp tục tăng sinh và nhân lên mất kiểm soát tạo thành một khối lớn gọi là
khối u. Các khối u có khả năng di căn sang các phần khác gọi là u ác tính hay
là ung thư.
1.1.3. Các liệu pháp điều tri ung thư
Điều tri ung thư có nhiều phương pháp, tùy thuộc vào từng loại ung thư
mà sư dụng phương pháp cho phù hợp hay kết hợp nhiều phương pháp điều tri
cùng một lúc. Theo Viện nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (NCI), hiệp hội ung
12


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

thư Hoa Kỳ (ACS) điều tri ung thư có thể chia thành một số nhóm lớn phương
pháp sau [32]:
-Phương pháp phẫu thuật: Phẫu thuật có thể được sư dụng để chuẩn
đoán, điều trị, hoặc thậm chí ngăn ngừa ung thư trong một số trường hợp. Hâu
hết những người bi ung thư sẽ có một số loại phẫu thuật. Đây là phương pháp
phô biến và đem đến cơ hội lớn nhất để chữa bệnh, đặc biệt là nếu ung thư
chưa ở giai đoạn di căn đến các bô phận khác của cơ thể.
-Phương pháp xạ trị: Xạ tri sư dụng các hạt năng lượng cao hoặc sóng
để tiêu diệt tế bào ung thư. Nó là một trong những phương pháp điều tri phô
biến nhất đối với một số bệnh ung thư ở dạng không thể phẫu thuật hoặc hóa
trị. Phương pháp này có thể sư dụng đơn lẻ hoặc kết hợp với các hình thức

Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

đơn dòng. Thuốc phân tư nhỏ là đủ nhỏ để dễ xâm nhập vào bên trong tế bào,
vì vậy chúng được sư dụng cho các đích bên trong tế bào. Ngược lại, các
kháng thể đơn dòng là loại thuốc mà không xâm nhập vào tế bào một cách dễ
dàng. Thay vào đó, chúng gắn với các mục tiêu cu thể trên bề mặt ngoài của
tế bào ung thư.
Hiện nay, trên thế giới có một số hệ nano polymer mang thuốc điều tri
ung thư đa và đang được thư nghiệm lâm sàng pha III được sư dụng trong
tiêm truyền tĩnh mạch như: Genexol-PM® là một dạng nano polymer
methoxypoly (ethylene glycol)-block-poly(D,L-lactic) (mPEG-PDLLA) (dùng
trong điều tri ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến tiền liệt) đa và
đang được thư nghiệm ở lâm sàng pha II đối với ung thư tuyến tụy. Kết quả
bước đầu cho thấy, Genexol PM làm tăng hàm lượng paclitaxel trong máu,
cho phép xư dụng liều cao hơn dạng paclitaxel tự do [34]; ELIGARD® là một
hệ nano polymer dẫn truyền leuprolide acetate dùng để tiêm dưới da trên
những bệnh nhân ung thư tuyến tụy và ung thư vú. Các kết quả lâm sàng pha
III cũng đang được theo dõi [30]. Paclitaxel poliglumexvới tên thương mại là
Opaxio® đang sư dụng trong điều tri ung thư buồng trứng, ung thư phổi tế bào
không nhỏ và ung thư não là một loại thuốc dạng nano được tạo nên tư sự kết
hợp các phân tư paclitaxel với các phân tư polymer polyglutamate tan được
trong nước cũng đang được thư nghiệm lâm sàng ở pha III [33].
1.1.4. Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và Việt Nam
Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tư vong trên thế
giới, với khoảng 14 triệu trường hợp mới vào năm 2012.Số ca bệnh mới sẽ
tăng khoảng 70% trong vòng 2 thập kỷ tới.Ung thư đa gây tư vong cho 8,8

giai đoạn muộn (khoảng 80%) hoặc quá muộn.
Tại Việt Nam, các loại bệnh ung thư hiện nay có tỷ lệ mắc và tư vong tùy
thuộc vào giới tính. Theo đó, ở nam giới 10 căn bệnh ung thư thường hay mắc
phải nhất đó là: ung thư phổi, dạ dày, da, đại trực tràng, thực quản, máu, tuyến
tiền liệt, khoang miệng. Còn ở phu nữ, 10 loại ung thư có tỷ lệ mắc cao nhất
đó là: ung thư vú, ung thư đại trực tràng, phế quản - phổi, cô tư cung, dạ dày,
giáp trạng, gan, buồng trứng, hạch và máu [31].
Tóm lại, tư những dẫn liệu trên có thể thấy rằng tỷ lệ mắc ung thư trên thế
giới cũng như ở nước ta ngày một gia tăng. Việc nghiên cứu đưa ra các kỹ
16


Luận văn Thạc sỹ Khoa
Nguyễn Trung
thuậ
việc phát hiện sớm,
học t và áp dụng các phương pháp điều tri mới, cũng như
Hợp
chẩn

17


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

đoán đúng và tăng cường công tác phòng chống căn bệnh này là rất cần thiết, có

khi làm xuất hiện những tác dụng sinh học mới so với thuốc ban đầu (Hình
1.2).

Hình 1.2. Cac yếu tố ảnh hưởng tới hê dẫn thuốc: vật lý (kích thước, hình
thai, phân hủy của polyme), dược động học (tương tác thuốc-chất mang) va
sinh học (hấp phụ protein, tương thích, hướng đích).
1.2.1. Hệ dẫn thuốc cấu trúc nano
Các kết quả của các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước cho thấy:
quá trình vận chuyển thuốc có thể được nâng cao hiệu quả nhờ những chất
mang thuốc (drug delivery system) có kích thước nano như polymer cấu trúc
nano, micelle, dendrimer, liposome, cấu trúc virut, và ống nano carbon (Hình
1.3). Để đảm bảo an toàn, những chất mang phải có dung lượng thuốc mang
lớn, thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn đủ dài và thuốc tập trung được
trong những khu vực có triệu chứng bệnh ly.

19


Luận văn Thạc sỹ Khoa
học

Nguyễn Trung
Hợp

Hình 1.3: Hình ảnh minh họa cấu truc cac loại nano dẫn thuốc
Có rất nhiều nghiên cứu đa được thực hiện để phát triển các chất mang
dạng keo cho các dược chất, bao gồm polymer cấu trúc nano, micelle,
liposome và nhu tương lipid nhằm mở rộng các lợi ích của thuốc cho các ứng
dụng lâm sàng. Mặc dù vậy, nhu tương lipid và liposome không thể giữ thuốc
trong cơ thể trong thời gian dài. Ngược lại, hạt micelle và polymer thể hiện là

Nguyễn Trung
Hợp

mô trong khối u khoảng 100 đến 400 nm. Do đó, kích thước hạt nano phải
nằm trong khoảng kích cỡ này để có thể tiếp cận khối u.
Đặc điểm bề mặt của hạt nano cũng là yếu tố quan trọng xác định tuổi thọ
và sự phân bố của chúng trong hệ tuần hoàn liên quan đến sự bắt giữ của các
đại thực bào. Hạt nano ly tưởng phải có bề mặt ưa nước để phân tán tốt trong
môi trường cơ thể. Điều này có thể đáp ứng bằng cách bọc trên bề mặt của hạt
nano một lớp polymer ưa nước như PEG (polyethylene glycol), Vitamin ETPGS, O-carboxylmethyl chitosan, alginat, glucan... hoặc BSA (Bovine serum
albumin) để bảo vệ chúng khỏi sự opsonine hóa [17].
1.2.3. Nghiên cưu về vật liệu nano phuc vu y học tại Việt Nam
Tại Việt Nam, một số cơ sở nghiên cứu trong nước đa và đang nghiên
cứu, ứng dụng thư nghiệm các cấu trúc nano phục vu điều tri trong y học. Có
thể kể đến là Viện Khoa học vật liệu, Viện Hóa học, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Khoa học vật liệu ứng dụng… thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam; Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thuộc Đại học
Quốc gia Hà Nội; Trung tâm Nghiên cứu Ứng dụng Sinh y dược học thuộc
Học viện Quân Y [13]. Điều này mở ra triển vọng nghiên cứu phát triển và
ứng dụng công nghệ nano cho các nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có khác tại
Việt Nam.
Đặc biệt, gần đây Phạm Hữu Ly và cộng sự (Viện Hoá học) đa sản xuất
thành công ở quy mô pilot nanocurcumin tư củ nghệ vàng (sư dụng sóng siêu
âm cao tân biến curcumin thành những phân tư kích thước nano và dùng các
polyme thân nước như Poly L- glutamic acid (PLGA) tương thích sinh học để
bảo vệ các hạt curcumin, giữ chúng ở kích thước khoảng 100 nm, phân tán tốt
trong môi trường nước, hấp thu tới 95%. Sản phẩm viên nang mềm
CumarGold đa được thư hoạt tính sinh học trên các dòng tế bào ung thư tại
Trung tâm ung thư thực nghiệm, Đại học Quốc Gia Hà Nội trước khi được
công ty Cô phần Dược Mỹ phẩm CVI tiếp thi và phân phối đưa ra thi trường.