VIỆN HÀN LÂM VÀ KHOA HỌC VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI TÀI NGUYÊN VÀ SINH VẬT

PHẠM THỊ HẰNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN ZmBZIP72 PHÂN LẬP TỪ GIỐNG NGÔ ĐỊA
PHƯƠNG VIỆT NAM VÀ THIẾT KẾ CẤU TRÚC MANG GEN PHỤC VỤ
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO CÂY TRỒNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN: TS. HUỲNH THỊ THU HUỆ

Hà Nội - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, Ngày tháng năm 2017
Tác giả luận văn

Phạm Thị Hằng

i


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Huỳnh Thị


ABRE

AB -responsive element

AP2/EREBP

APETALA2/ethylene responsive element binding protein

AREB

ABA responsive element binding protein

AS

Acetosyringone

bZIP

basic leucine zipper

CaMV

Cauliflower mosaic virus

CBF

CRT binding factor

CBU


DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

DRE

Dehydration responsive element

DREB

Dehydration responsive element binding
iii


DST

Drought and Salt Tolerance

EAR

ERF-associated amphiphilic repression

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid


Late embryogenesis abundant

MALDI-TOF

Matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight

MCS

Multiple cloning site

mRNA

Messenger RNA

NAC

NAM, ATAF1,2, CUC2

NACRS

NAC recognition sequence

NAM

No apical meristem

NF-Y

Nuclear factor Y


TF

Transcription factor

WFP

World Food Programme

WMO

World Meteorological Organization

ZAT

Zinc transporter

ZFP

Zinc finger protein

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

21 - 22


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 2.1

Sơ đồ vector biểu hiện mang gen ZmbZIP72

29

Hình 3.1

Sản phẩm tách chiết RNA tổng số từ mẫu mô lá ngô xử lý hạn

38

nhân tạo
Hình 3.2

Sản phẩm PCR nhân gen Actin từ các mẫu cDNA

39

Hình 3.3


ZmbZIP72 giống Tẻ vàng chắt dạo (Lai Châu) với trình tự tham
chiếu
Hình 3.8

Kiểm tra sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi ZmbZIP72SacI F/R

45

Hình 3.9

Kết quả cắt enzyme giới hạn BglII trên các plasmid pJET 1.2

46

Hình 3.10 Tách chiết và chọn lọc plasmid pRTL2 mang gen ZmbZIP72

47

Hình 3.11 Sản cắt plasmid pRTL2_ZmbZIP72 bằng enzyme HindIII

47

Hình 3.12 Sản phẩm cắt plamsid pRTL2_ZmbZIP72 với enzyme BamHI
và HindIII
Hình 3.13 Chọn lọc plasmid pCAMBIA1300 mang gen ZmbZIP72

48

Hình 3.14 Sản phẩm cắt plasmid pCAM1300_ZmbZIP72 bằng enzyme


61
62


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................iii
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................... vii
MỞ ĐẦU............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
1.1. Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán , .........................................3
1.1.1.

Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật ......3

1.1.3.1.

Các gen mã hoá protein chức năng ..........................................................5

1.1.3.2.

Các gen mã hoá protein truyền tín hiện ..................................................6

1.1.3.3.

Các gen mã hoá yếu tố điều khiển phiên mã ...........................................7



Tách chiết RNA tổng số từ thực vật .......................................................25

2.2.3.

Sinh tổng hợp cDNA sợi thứ nhất ..........................................................26

2.2.4.

Phương pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR..........................................26
ix


2.2.5.

Tinh sạch các đoạn DNA trên gel agarose .............................................27

2.2.6.

Tạo dòng gen và thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 .28

2.2.7.
Biến nạp các vector tái hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH10β và A.
tumefaciens .................................................................................................................3
0
2.2.8.

Tách chiết và tinh sạch plasmid..............................................................32

2.2.9.


Xác định và phân tích trình tự gen ZmbZIP72 .....................................42

3.2. Thiết kế các vector tái tổ hợp mang gen ZmbZIP72 ...................................44
3.2.1.

PCR nhân gen ZmbZIP72 với cặp mồi treo vị trí enzyme SacI ...........44

3.2.2.

Thiết kế vector trung gian mang gen ZmbZIP72 ..................................46

3.2.3.

Thiết kế vector biểu hiện thực vật mang gen ZmbZIP72 .....................49

3.3. Tạo chủng A. tumefaciens mang cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72 .........52
3.4. Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô .............................................................54
3.5. Đánh giá cây ngô T0 chuyển gen ZmbZIP72 ...............................................58
3.5.1.

Kết quả tách chiết DNA tổng số cây ngô chuyển gen ...........................59

3.5.2.

Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chỉ thị hygromycin ............60

3.5.3.

Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen ZmbZIP72

dưới mức trung bình (WMO, 2016). Theo Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên
Hợp Quốc (FAO), sản lượng ngũ cốc của khu vực này trong vụ mùa 2015-16 đã giảm
12% so với năm 2014-15. Những khu vực khác bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi hạn hán
trong những tháng đầu năm
2016 bao gồm phần lớn các khu vực ở phía Bắc Nam Mỹ, các vùng phía đông của
Australia, các hòn đảo thuộc phía Tây Thái Bình Dương và các nước Đông Nam Á thuộc
lưu vực sông Mekong đặc biệt là Việt Nam. Chương trình Lương thực thế giới (WFP)
ước tính sẽ có khoảng 17 triệu người cần được hỗ trợ vào đầu năm 2017 (WMO, 2016).
Cây ngô là một trong các loại cây ngũ cốc quan trọng đối với con người. Ở Việt
Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa và được trồng ở nhiều vùng khác
nhau. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, diện tích trồng ngô ở nước ta năm 2015 ước
đạt
1164,8 nghìn ha, sản lượng ước đạt 5287,2 nghìn tấn và năng suất bình quân đạt 4,54
tấn/ha (https://www.gso.gov.vn). Tuy nhiên, sản xuất ngô ở Việt Nam hiện vẫn chưa
đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng trong nước, năm 2015 nước ta vẫn phải nhập khẩu
khoảng 7,55 triệu tấn ngô (https://www.gso.gov.vn ). Một trong những nguyên nhân
chính là do việc canh tác ngô ở Việt Nam chủ yếu dựa vào nguồn nước mưa tự nhiên.
Điều này ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tăng năng suất và sản lượng ngô hàng năm và
đặc biệt là trong điều kiện nắng hạn kéo dài. Do đó, việc nghiên cứu tạo giống ngô chịu
hạn đang là chủ đề nghiên cứu của nhiều tổ chức và các nhà khoa học. Trong nhiều năm
1


gần đây, việc ứng dụng công nghệ sinh học đặc biệt là công nghệ gen để cải thiện khả
năng chịu hạn của cây

2


trồng đang được quan tâm. Tuy nhiên, ở nước ta, những thành tựu trong nghiên cứu tạo

-

Chuyển gen ZmbZIP72 vào cây ngô thông qua vi khuẩn A. tumefaciens

-

Kiểm tra sự có mặt của gen ZmbZIP72 trong cây chuyển gen T0 bằng kỹ thuật PCR.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Phản ứng của thực vật trong điều kiện hạn hán

1.1.1.

Tác động của hạn hán đến sinh trưởng và phát triển của thực vật

Hạn hán là một nguyên nhân quan trọng làm giảm năng suất và chất lượng sản
phẩm của cây trồng. Khi môi trường hạn hán, cây bị mất nước dẫn đến nhiều hậu quả
nghiêm trọng: (i) Gây nên hiện tượng co nguyên sinh và làm cho cây bị héo. Sự co
nguyên sinh chất xảy ra khi tế bào bị stress nước làm cho nước trong tế bào bị thất thoát
ra ngoài nên khối nguyên sinh chất của tế bào co lại, thể tích không bào bị thu hẹp. Khi
cây sống trong môi trường thiếu nước kéo dài, tế bào mất nước dẫn đến các mô trở nên
mềm yếu và sự héo xảy ra. Mô thực vật bị héo tạm thời nhưng cũng có thể vĩnh viễn nếu
sự thiếu nước xảy ra nghiêm trọng và trong thời gian dài. (ii) Môi trường sống bị khô hạn
cản trở sự vận chuyển nước trong mạch gỗ. Trong điều kiện thiếu nước, sự cung cấp
nước cho rễ không đủ trong đêm để thủy hóa các mô đã bị thiếu nước ban ngày, dẫn đến

(Wardlaw and Willenbrink, 2000).
1.1.2.

Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật

Để chống lại khô hạn, thực vật có những biến đổi sinh lý, hóa sinh phù hợp. Có hai
cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trường thiếu nước: cơ chế tránh mất nước và cơ
chế chịu mất nước. Cơ chế tránh mất nước liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái
của bộ rễ (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998). Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài,
mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với
số lượng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nước (Nguyễn Lan Điền, 2003). Cơ chế này phụ
thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm
mất nước một cách tối đa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998) (Đinh Thị Phòng, 2001).
Trong khi đó, cơ chế chịu mất nước liên quan đến những thay đổi hóa sinh diễn ra trong
tế bào nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nước.
Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào được điều chỉnh tăng lên, giúp
cho tế bào thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn lại trong đất. Nhờ vậy, thực vật
có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ (Steponkus P.L. et al, 2003). Tự điều chỉnh áp
suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích lũy các chất hòa tan, các protein, các axit amin
ví dụ như: axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzyme phân hủy gốc tự do… Sự
điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: Giữ và lấy nước vào trong tế bào và ngăn
chặn sự xâm nhập của ion Na+; thay thế vị trí nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa,
tương tác với lipid hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá hủy màng và các phức
protein (Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, 1998).
6


1.1.3.

Cơ chế phân tử của tính chống chịu hạn ở thực vật


cách sử dụng quang khối phổ MALDI-TOF ở lá ngô khi đáp ứng với stress hạn. Các phân
tích hệ phiên mã cho thấy mức biểu hiện của các sHSP này được điều chỉnh tăng lên khi
đáp ứng với stress nhiệt và hạn ở lá ngô. ABA chịu trách nhiệm điều hoà biểu hiện sau
phiên mã các sHSP này (Hu et al. 2010).
Protein Cyclophilin (CYP) liên quan đến nhiều chức năng như phân chia tế bào,
truyền tín hiệu tế bào, vận chuyển protein, điều hoà phiên mã, cắt nối tiền mRNA và khả
năng chịu stress (Trivedi et al. 2012). Các phân tích silico cho thấy rằng việc đáp ứng
stress của thực vật có liên quan với các protein cyclophilin. Các protein CYP ở lúa, ngô,
Arabidopsis, lúa mạch và brachypodium giống nhau đến trên 80% cho thấy tần số cao các
trình tự bảo thủ. CYP thường gặp ở lục lạp, cytosol, và ty thể (Trivedi et al. 2013). Đánh
giá so sánh chỉ ra rằng mRNA chịu trách nhiệm tổng hợp CYP được phát hiện với tần số
cao ở ngô sau 6 – 7 giờ xử lý stress hạn, ở đậu mất khoảng 48 giờ.
1.1.3.2. Các gen mã hoá protein truyền tín hiện
Nhiều hệ thống truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng với điều kiện bất lợi
phi sinh học, bao gồm kinase, enzyme chuyển hoá phospholipid, calcium sensing… Mặc
dù các quá trình truyền tín hiệu này khá phức tạp và chưa được hiểu rõ, một vài gen mã
hoá cho các yếu tố truyền tín hiệu có chức năng trong đáp ứng chịu hạn đã được phân lập.
Một vào yếu tố gần đây đã được sử dụng trong tạo tính chịu hạn ở cây chuyển gen như:
NPK (Kovtun et al, 2000), SnRK2 (Umezawa et al., 2004), CBL (Cheong et al., 2003).
Cũng giống như các yếu tố điều khiển phiên mã, việc biến đổi một yếu tố truyền tín hiệu
có thẻ làm thay đổi một loạt các sự kiện sau đó, kết quả là tạo khả năng chống chịu ở
nhiều mặt. Ví dụ, NPK1 là một kinase của Nicotinana. NPK1 nằm ở giai đoạn đầu của
con đường truyền tín hiệu oxi hoá và dẫn đến khả năng chịu hạn, lạnh, nóng và muối ở
cây ngô chuyển gen (Shou et al., 2014). PIS (Phosphatidylinositol synthase) là một
enzyme quan trọng trong con đường tổng hợp phosphatidylinositol không những là một
thành phần cấu trúc màng tế bào mà còn là tiền chất của phần tử tín hiệu điều hoà đáp
ứng của cây trước điều kiện bất lợi. Khi biểu hiện quá mức gen ZmPIS trong cây ngô,
cây tăng cường khả năng chịu hạn đặc biệt là giai đoạn trước khi nở hoa (Liu et al.,
2013).

tìm thấy ở nhiều loài, đặc biệt là ở các loài thực vật bậc cao (Ulker and Somssich, 2004).
7


Gần đây, các nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu vai trò của nhóm TF này trong đáp
ứng của cây với các điều kiện bất lợi phi sinh học, đặc biệt là hạn hán ở Arabidopsis, lúa
mạch (Luo et al., 2013; Xiong et al., 2010). Mới đây, các nhà khoa học đã phân lập được
gen ZmWRKY58 từ ngô và sự biểu hiện của gen này ở các dòng lúa chuyển gen làm tăng
khả năng chống chịu hạn và muối (Cai et al., 2014).
NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) là một họ TF đặc trưng cho thực vật, bao gồm các
vùng NAC bám DNA có tính bảo thủ cao (Guo et al., 2008). Có hơn 100 gen mã hóa cho
các protein NAC đã được xác định trên đối tượng Arabidopsis. Các protein NAC có nhiều
chức năng, không chỉ tham gia vào sự phát triển của cây mà còn tham gia vào phản ứng
chống chịu stress của thực vật (Nakashima et al., 2012). Có khoảng 40 TF NAC trong số
140 được tìm thấy chịu trách nhiệm đối khả năng chịu hạn và mặn ở lúa. NAC019,
NAC055 và NAC072 là các thành viên của họ các yếu tố phiên mã NAC, chúng nhận
biết và bám vào yếu tố NACRS (CATGTG) nằm trong vùng promoter của các gen đáp
ứng nhanh với mất nước (ERD1) và tăng cường khả năng chống mất nước (Tran et al.,
2004). Sự biểu hiện của gen SNAC1 trong cây lúa biến đổi gen làm tăng độ thụ phấn của
hoa lên 17 -22% và khả năng hình thành hạt lên 22 -34% so với các cây đối chứng trong
điều kiện hạn hán vừa và nặng (Hu et al., 2006). Các cây lúa chuyển gen OsNAC6 tăng
cường tính chịu hạn và mặn, ngoài ra còn tăng cường tính kháng bệnh bạc lá so với cây
đối chứng (Nakashima et al., 2007). Cũng nằm trong nhóm NAC, các cây lúa chuyển gen
OsNAC9 có tính chịu hạn rất cao đồng thời, năng suất tốt hơn 13 – 32% so với các cây
đối chứng trong điều kiện bình thường và khô hạn (Redillas et al., 2012).
Một số TF đáp ứng mất nước nhưng không liên quan đến ABA, chúng được gọi là
các TF đáp ứng mất nước không phụ thuộc ABA. Phân tích vùng promoter của các gen
biểu hiện không phụ thuộc ABA trong phản ứng stress của thực vật cho thấy một yếu tố
hoạt động cis với trình tự A/GCCGAC là vị trí liên kết của các TF này, được biết đến như
yếu tố đáp ứng mất nước (DRE- dehydration responsive element). Họ TF đáp ứng mất

(Xu et al. 2008) và ZAT10 (Xiao et al., 2009) tích cực tham gia vào việc điều hoà phản
ứng mất nước. DST là một chất điều hoà âm tính, cải thiện khả năng chịu hạn và mặn
thông qua việc giảm biểu hiện của gen (Huang et al., 2009). C2H2 ZFP, EAR và ZAT10
là thành viên của TF ZFP cải thiện khả năng chịu hạn ở lúa (Yang et al., 2010).
9


Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu tập trung vào các yếu tồ điều khiển phiên mã liên
quan đến tính chịu hạn của thực vật cũng đang được các nhóm nghiên cứu quan tâm.
Nhóm nghiên cứu của Phạm Xuân Hội đã phân lập một số gen TF (OsNAC1,
OsNAC6, OsDREB1A, OsDREB2A, OsAREB1A và ZmDREB2A) từ các giống lúa, ngô
Việt Nam và chuyển gen vào cây mô hình lúa và Arabidopsis (Phạm Thu Hằng et al.,
2014; Nguyễn Duy Phương et al., 2014; Nguyễn Thị Phương Dung và Phạm Xuân Hội,
2010; Cao Lệ Quyên et al., 2012; Phạm Thu Hằng và Phạm Xuân Hội, 2012 ). Một nhóm
tác giả khác cũng đã chuyển thành công các gen TF OsRAP2.4A, OsNLI-IF1 và cây lúa
nhằm nghiên cứu đặc tính của các yếu tố phiên mã này để tăng cường mức độ chịu hạn và
mặn của cây trồng (Nguyen Duy Phuong and Pham Xuan Hoi 2015, Nguyen Duy Phuong
et al., 2014). Cao Lệ Quyên và đồng tác giả (2009) đã phân lập được gen MtOsDREB2A
từ thư viện cDNA xử lý hạn của giống lúa Mộc tuyền. Đây là nguồn gen điều khiển chịu
hạn từ chính nguồn thực vật của Việt Nam, là cơ sở cho các nghiên cứu tính chịu hạn trên
cây lúa. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Đồng cũng đã áp dụng thành công các gen
yếu tố điều khiển phiên mã NF-YB2, MYB trong việc chọn tạo giống ngô và đậu tương có
khả năng chống chịu với điều kiện khô hạn (Nguyễn Văn Đồng và Nguyễn Hữu Kiên,
2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2013; Nguyễn Văn Đồng et al., 2015). Gen DREB1A
cũng được áp dụn g ở đậu tương (Trần Thị Cúc Hoà, 2009; Trần Thị Cúc Hoà et al.,
2015) để chọn tạo giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn.
1.2.

Họ bZIP là yếu tố điều khiển phiên mã trong cảm ứng chống chịu hạn ở thực
vật

còn khoảng 50 gen chưa được miêu tả trong các dữ liệu. Trong số 7 gen thuộc nhóm A,
nhóm tham gia quá trình chống chịu stress và đáp ứng ABA thì chỉ có 3 gen tham gia vào
sự chịu hạn của cây. Đó là ABRE-binding protein 1 và 2 (AREB1 và AREB2) và ABRE
binding factor 3 (ABF3) (Jakoby et al., 2002). Một số nghiên cứu cho thấy ABA và stress
phi sinh học cảm ứng sự biểu hiện của ABF/AREB và ABA gây sự phosphoryl hóa của
AREB1/2. Sự photphoryl hóa này là cần thiết cho AREB1/2 cảm ứng gen sau nó và có
thể xảy ra ở vị trí phosphoryl hóa bằng casein kinase II nằm ở các domain bảo thủ. ABA
và stress hạn do đó có thể cảm ứng cả sự phiên mã và điều hòa sau dịch mã của nhiều
gen bZIP thuộc nhóm A.
Ở lúa, có gần 100 gen thuộc họ bZIP, trong đó 33 gen tham gia phản ứng với hạn
11