BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VINH DŨNG

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU
CHỐNG VIÊM TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN VINH DŨNG
Mã sinh viên :1301077

XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM ĐAU
CHỐNG VIÊM TRỘN TRÁI PHÉP
TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC
BẰNG HPTLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn :
1. PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà
2. NCS. ThS. Đào Thị Cẩm Minh
Nơi Thực hiện:
1. Bộ môn Hóa phân tích-Độc chất
2. Viện công nghệ Dược phẩm Quốc gia


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...........................................................................................3
1.1. Tình hình trộn trái phép các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm đông
dược ..............................................................................................................................3
1.1.1. Trên thế giới ....................................................................................................3
1.1.2. Tại Việt Nam ..................................................................................................4
1.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu .....................................................................5
1.2.1. Cấu trúc, tính chất hóa lý của các thuốc giảm đau,chống viêm .....................5
1.2.2. Cơ chế tác dụng, tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc
giảm đau, chống viêm . .............................................................................................7
1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích ...................................................................9
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ..................................................................................9
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao(HPTLC) .................................................10
1.4. Một số nghiên cứu về nhóm thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược.......................................................................................13
1.4.1. Trên thế giới ................................................................................................13
1.4.2. Tại Việt Nam ...............................................................................................15
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................17
1.1. Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu ..............................................17
1.1.1. Nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu .......................................................17
1.1.2. Thiết bị, dụng cụ phục vụ nghiên cứu ..........................................................18
1.1.3. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................18
1.2. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................19
1.2.1. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu .......................................................................19
1.2.2. Khảo sát dung môi pha động ........................................................................19
1.2.3. Thẩm định phương pháp ...............................................................................20
1.2.4. Sơ bộ khảo sát các chế phẩm đông dược thu thập được trên thị trường ......21
1.3. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................22


Cyclooxygenase

HPTLC

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High performance thin layer
chromatography)

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

INDO

Indomethacin

IBU

Ibuprofen

KETO

Ketoprofen

LOD

Giới hạn phát hiện (Limit of detection)

LOQ


PIRO

Piroxicam

PDE-5

Phosphodiesterase-5

S/N

Tín hiệu/nhiễu(signal-to-noise)

Spic

Diện tích pic

QT

Quy trình


TOF

Thời gian bay(Time of flight)

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography)

UV

Hình 3. 16. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính indomethacin ....................................44
Hình 3. 17. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính giả Paracetamol ................................44
Hình 3. 18. Kết quả chồng phổ mẫu dương tính giả Indomethacin ..............................45
Hình 3. 19. Biểu đồ số mẫu dương tính được kết luận qua hai phương pháp TLC và
HPTLC...........................................................................................................................45


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. 1. So sánh giữa HPTLC và TLC .....................................................................11
Bảng 1. 2. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc giảm đau, chống viêm trên thế giới ....14
Bảng 1. 3. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc giảm đau chống viêm tại Việt Nam ....15
Bảng 2. 1. Chất chuẩn - hóa chất dùng trong nghiên cứu .............................................17
Bảng 3. 1. Kết quả khảo sát dung môi loại tạp .............................................................26
Bảng 3. 2. Kết quả khảo sát dung môi chiết .................................................................28
Bảng 3. 3. Kết quả đánh giá tính thích hợp trên hệ thống HPTLC ...............................32
Bảng 3. 4. Kết quả khoảng tuyến tính của 5 chất phân tích ..........................................33
Bảng 3. 5. Kết quả đánh giá độ đúng, độ chính xác của 5 chất phân tích ....................34
Bảng 3. 6. Kết quả phân tích LOD, LOQ trên 3 nền mẫu của 5 chất phân tích ...........38
Bảng 3. 7. Kết quả định lượng mẫu dương tính paracetamol và indomethacin ...........46


ĐẶT VẤN ĐỀ
Sản phẩm chăm sóc sức khỏe bằng thảo dược, thuốc có nguồn gốc Đông dược
đang được sử dụng trên toàn thế giới như là lựa chọn thay thế hiệu quả và tương đối an
toàn cho các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược. Theo tổ chức y tế thế giới có đến
80% dân số ở các nước đang phát triển đang sử dụng các sản phẩm này cho việc chăm
sóc sức khỏe của họ và doanh thu của các sản phẩm này tại thị trường châu Âu năm
2003 là 5 tỷ đô la Mỹ [trong đó tiêu thụ nhiều nhất là Đức (39%) và Pháp (21%)] [26].
Tuy nhiên, các sản phẩm này không được quy định nghiêm ngặt như các loại thuốc

Nội đã xây dựng phương pháp xác định đồng thời 4 chất paracetamol, piroxicam,
indomethacin và natri diclofenac trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng HPTLC với
hệ dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat: acid acetic (6: 2,5: 1,5) ; đã ứng dụng
trên 29 mẫu chế phầm đông dược thu thập trên thị trường và phát hiện được một mẫu
có trộn paracetamol với hàm lượng 37,64 mg/liều [12].
Tiếp nối nghiên cứu trên, nhằm nghiên cứu và thẩm định thêm 2 chất thuộc
nhóm giảm đau chống viêm là ketoprofen và ibuprofen có thể được trộn trái phép
trong chế phẩm đông dược và mở rộng ứng dụng phát hiện trên số lượng lớn các chế
phẩm đông dược thu thập được trên thị trường, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Xác định
một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
bằng HPTLC”.
Với mục tiêu:
1. Đánh giá phương pháp xác định đồng thời paracetamol,piroxicam,
indomethacin, ketoprofen và ibuprofen trộn trái phép trong chế phẩm đông dược
bằng HPTLC.
2. Sơ bộ khảo sát tình hình trộn lẫn không khai báo paracetamol, piroxicam,
indomethacin, ketoprofen và ibuprofen trong chế phẩm đông dược thu thập được
trên thị trường bằng phương pháp HPTLC.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình trộn trái phép các thuốc giảm đau chống viêm trong chế phẩm
đông dược
1.1.1. Trên thế giới
Trên thế giới hiện nay, vấn đề trộn trái phép thuốc tân dược trong chế phẩm đông
dược đang diễn ra rất phổ biến ở nhiều nước. Các nhóm thuốc tân dược hay được phát
hiện trộn vào các chế phẩm đông dược là nhóm hạ nhiệt, giảm đau chống viêm steroid
và non-steroid, nhóm ức chế enzym phosphodiesterase-5, nhóm giảm béo phì, nhóm

3


sau: ibuprofen,33%; diclofenac,19%; naproxen,16%; piroxicam ,15%; acetaminophen,
14% và indomethacin, 3%; Trong đó sản phẩm hoàn và viên nang chiếm khoảng 70%.
Một số nước Đông Nam Á như Thái Lan, Indonesia cũng tích cực trong việc xây dựng
phương pháp để phát hiện các thuốc hóa dược giảm đau chống viêm trộn vào chế
phẩm đông dược. Tại Thái Lan, Chutima Limmatvapirat và cộng sự đã dùng phương
pháp TLC phát hiện 2 chất thuộc nhóm glucocorticoid trộn trong chế phẩm đông
dược là dexamethason và prednisolon từ năm 2007 đến năm 2011 lần lượt là 28,57%;
10,39%; 3,33%; 4,41% và 6,95% [32].
1.1.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, từ lâu nhiều người đã tin dùng những sản phẩm có nguồn gốc
thảo dược do niềm tin vào tính an toàn của các sản phẩm này và thời gian gần đây nhu
cầu này càng tăng cao. Mặt khác, Việt Nam chúng ta cũng có nguồn tài nguyên cây
thuốc Nam dồi dào nên các sản phẩm đông dược cũng rất nhiều và đa dạng. Tuy nhiên,
nhiều sản phẩm được bán tràn lan trên mạng và tại các chợ thuốc mà chất lượng của
chúng lại không được kiểm soát chặt chẽ nên có nguy cơ lớn cho sức khỏe cộng đồng
nếu các sản phẩm này được trộn trái phép các thuốc hóa dược. Bằng chứng là một số
sản phẩm đã bị phát hiện trên thị trường như:
- Nang mềm Tăng phì hoàn(Ceng Fui Yen) do Công ty TNHH Dược phẩm
WELIP – Malaysia sản xuất, Công ty CP Dược liệu TW 2 nhập khẩu, trộn
dexamethason và cyproheptadin
- Cơ sở thuốc gia truyền lương y Dương Ngô Hiếu (Địa chỉ: Đồng Ngô, Ngọc
Vân, Tân Yên, Bắc Giang) sản xuất 2 thuốc chưa được cấp phép lưu hành: Thuốc KQ
3 Thận khí hoàn chữa đái tháo đường trộn glibenclamid và GB Giải biểu hoàn trộn
paracetamol.
- Viên nang Mãnh Nam do Công ty TNHH Dược phẩm Ngọc Khánh (Địa chỉ: Xã
Nam Hồng, Đông Anh, Hà Nội) sản xuất có chứa acetylsildenafil; Viên nang Bổ Thận
Hà Thành do Công ty TNHH Hà Thành sản xuất có chứa sildenafil,...[11].


Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Hơi tan trong nước, tan nhiều hơn
trong nước sôi, rất khó tan trong chloroform, ether, dễ tan trong dung dịch
kiềm, ethanol 96%,methyl clorid[8],[4].

-

Liều dùng: 325-650 mg, cứ 4-6 giờ dùng một lần, không quá 4 g một ngày [3].

1.2.1.2. Piroxicam
-

Công thức hóa học: C15H13N3O4S (M=331,4)

5


Hình 1. 2. Cấu trúc hóa học của piroxicam
- Tên khoa học: 4-hydroxy-2-methyl-N–(pyridin-2–yl)-2H-1,2-benzothiazin-3carboxamid 1,1-dioxyd
- Tính chất: Bột kết tinh đa hình, màu trắng hay ngà vàng. Thực tế không tan
trong nước, tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol khan [4],[8].
- Liều dùng: 20 – 40 mg/ ngày [3].
1.2.1.3. Indomethacin
-

Công thức hóa học : C19H16ClNO4 ( M=357,8)

Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của indomethacin
-


- Liều dùng : 50 mg, dùng 3 lần/ngày, có thể tăng liều tới 100 mg, dùng 2–3
lần/ngày [3].
1.2.1.5. Ibuprofen
-

Công thức hóa học : C13H18O2 (M=206,3)

Hình 1. 5. Cấu trúc hóa học của ibuprofen
-

Tên khoa học : acid (RS) - 2 - (4 - isobutylphenyl) propionic

-

Tính chất : Bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng hay tinh thể không màu. Thực
tế không tan trong nước, dễ tan trong aceton, và methanol và methyl clorid .
Tan trong các dung dịch hydroxyd kiềm loãng và carbonat kiềm [4],[8].

-

Liều dùng : 400-600 mg/ lần, có thể dùng 3-4 lần/ngày, tối đa 2,4g/ ngày [3].

1.2.2. Cơ chế tác dụng, tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc giảm
đau, chống viêm .
1.2.2.1. Cơ chế tác dụng và tác dụng
Các NSAID ức chế COX qua đó ức chế tổng hợp prostaglandin và thromboxan.
Có hai dạng COX: COX-1 cần thiết để tổng hợp prostaglandin bảo vệ niêm mạc dạ
dày và thromboxan cần thiết cho tiểu cầu kết dính, COX-2 tham gia tạo ra
prostaglandin khi có viêm. Các thuốc chống viêm ức chế không chọn lọc cả hai loại
COX-1và COX-2, bao gồm ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam, diclofenac,

giảm bạch cầu.
Trên hệ tiết niệu : Làm giảm lưu lượng máu nuôi thận, giảm mức lọc cầu thận,
giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi nước, gây nên các
rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, hoại tử nhú thận, suy thận cấp và
tăng kali máu.
Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, làm tăng thời gian mang thai ở 3
tháng cuối, và có thể ảnh hưởng đến tuần hoàn và hô hấp của thai nhi. Ức chế co bóp
tử cung, do đố gây trì hoãn sự chuyển dạ, tăng nguy cơ chảy máu ở cả mẹ và thai nhi.
Các tác dụng phụ khác:
Tăng huyết áp, phù. Khi dùng liều cao, kéo dài, gây ù tai, chóng mặt, giảm đời
sống hồng cầu Ngoài ra thuốc có thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX
nên làm tăng các chất chuyển hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien). Thuốc
còn có thể gây rối loạn chức năng gan, rối loạn về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào
8


(mất bạch cầu hạt), thậm chí có thể gây suy tủy. Trên hệ tim mạch: Các thuốc ức chế
COX-2 và liều cao các thuốc NSAID truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim
Đối với paracetamol: Paracetamol là chất chuyển hóa có hoạt tính của
phenacetin. Ở liều điều trị, paracetamol ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không
làm thay đổi cân bằng acid–base, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày
như khi dùng salicylate. Paracetamol không tác dụng trên cyclooxygenase (COX) toàn
thân, chỉ tác động đến COX của hệ thần kinh trung ương. Tuy nhiên khi dùng quá liều
paracetamol có thể gặp phản ứng dị ứng như ban đỏ hoặc mày đay, trầm trọng hơn là
phản ứng độc với gan do chính chất chuyển hóa của paracetamol là N-acetylbenzoquinonimin gây ra [3].
1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích
1.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kỹ thuật đã được phát triển từ lâu, cho phép tách
được hỗn hợp nhiều cấu tử với lượng phân tích nhỏ, tốc độ phân tích nhanh (có thể
phân tích hàng loạt mẫu). Chính vì vậy mà hiện nay TLC được ứng dụng rộng rãi

TLC được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực do có nhiều ưu điểm
như: thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh; phát hiện được tất cả các
chất kể cả các chất không di chuyển theo pha động (nằm ở điểm xuất phát), thực
hiện tách dễ dàng các mẫu có nhiều thành phần – có thể thực hiện sắc ký đồng
thời 10-20 mẫu hoặc hơn, so sánh trực tiếp mẫu thử với mẫu chuẩn, phương pháp
này cho phép bán định lượng nhanh thành phần trong thuốc nên thường dùng để
đánh giá nhanh chất lượng của thuốc; ngoài ra phương pháp cho phép cung cấp
hình ảnh sắc ký đồ làm dấu vân tay cho mỗi thuốc, do đó thích hợp cho việc kiểm
tra độ tinh khiết của thuốc và phát hiện thuốc giả [1].
1.3.2. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao(HPTLC)
Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) là một công cụ tiên tiến hơn của
sắc ký lớp mỏng (TLC). HPTLC được điều khiển bởi phần mềm thích hợp đảm
bảo tính ứng dụng và độ tin cậy, độ lặp lại cao nhất của các số liệu đưa ra. Các
bước của quá trình phun mẫu, khai triển mẫu, nhận diện vết được tiến hành bằng
thiết bị tự động hoặc bán tự động, giảm thiểu tối đa sai số có thể gặp trong quá
trình phân tích. Trong quá trình khai triển, điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm được
kiểm soát chặt chẽ, đảm bảo độ lặp lại của kết quả khi tiến hành giữa các lần phân
tích khác nhau và tại các phòng thí nghiệm khác nhau. Hệ thống đèn UV tích hợp
máy scan và hệ thống phần mềm giúp phân tích số liệu ứng dụng trong định tính
và định lượng[27]. Một vài ưu điểm của phương pháp HPTLC so với phương
pháp TLC được thể hiện qua bảng 1.1

10


Bảng 1. 1 So sánh giữa HPTLC và TLC [33]
Thông số

HPTLC


Chậm hơn

Thể tích tiêm mẫu nhỏ nhất

0,1 µl

1,0 µl

Pha tĩnh

Thường là silica gel và

Như nhau

trung bình

nhôm oxyd,
Quét phổ

Sử dụng quét phổ

Không

UV/VIS toàn bộ sắc ký đồ
để định tính và định lượng
Giới hạn phát hiện

100 – 500 pg

1 – 5 ng


Trong một lần khai triển sắc ký có thể phân tích đồng thời nhiều mẫu cùng

lúc, tiết kiệm thời gian và chi phí cho hóa chất, vật tư tiêu hao.
-

Phù hợp với cả phân tích định tính và định lượng, do sau khi triển khai , khi

quét bằng máy scanner có thể ghi lại phổ hấp thụ của chất, nên định tính đặc hiệu
hơn so với TLC thông thường khi chồng phổ của chất cần phân tích với chất
chuẩn, và định lượng chính xác hơn so với chụp ảnh và đo mật độ màu của vết
nhờ có thông số về diện tích pic giống như phương pháp HPLC.
-

Các mẫu phân tích và các mẫu chuẩn được chấm trên cùng một bản mỏng

sắc ký, khai triển cùng lúc trong cùng điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên
cho độ lặp lại cao, hạn chế sự tác động của môi trường giữa các lần phân tích.
12


-

Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước khi cho các dung môi như

lọc và khử khí, lượng tiêu thụ pha động thấp cho mỗi mẫu.
-

Quá trình thực nghiệm hoàn toàn tự động hoặc bán tự động nên giảm được



Phương pháp xử

chế

lý mẫu

Paracetamol,

Bột dược

Chiết trực tiếp

LC-MS [40]

indomethacin

liệu

Dung môi: MeOH

Cột: Nucleodur Sphinx RP

Tác động: Ly tâm

(150 × 4.6 mm, 5 m).

Chất phát hiện

Phương pháp phân tích

Tác động: Siêu âm

acetat 0,01M (gradient).
LC-ESI-MS/MS [22]

Phenylbutazon,

Bột dược

Chiết trực tiếp

dipyron

liệu

Dung môi : MeOH; Cột : Superspher 100 RP dichlormethan–

18(125 mm × 3 mm , 4 µm)

isopropanol (9:1)

và100 RP -18 (4 mm × 4 mm,

nếu mẫu có chứa

4µm)

đường hay mật ong Pha động: Kênh A: Đệm

Ibuprofen

TFA(78:22:0,1) (gradient).

Paracetamol,

Bột dược

Chiết trực tiếp

TLC [41]

dexamethason,

liệu

Dung môi:

Bản mỏng: Silica gel GF 254

Ethanol

Hệ dung môi triển khai:

prednison

14


Tác động: Lắc

Acid mefenanic,

Bảng 1. 3. Một số nghiên cứu phát hiện thuốc giảm đau chống viêm tại Việt Nam
Phương pháp phân tích

Các chất nghiên cứu
Paracetamol và

HPLC [9]

diclofenac natri

Cột:Inertsil ODS-3,(4,6x250 mm, 5 μm)
Pha động: methanol: dung dịch đệm phosphat pH 2,5

Dexamethason acetat

HPLC [6]

và betamethason acetat

Cột: C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm).
Pha động : H2O và acetonitril (55:45).

Piroxicam và

TLC [17]

indomethacin

Pha tĩnh:Bản mỏng TLC Silicagel 60 GF 254
Pha động: n-hexan – ethyl acetat – acid acetic (6:2,5:1,5)

HPTLC [12]

piroxicam, diclofenac,

Pha tĩnh: Bản mỏng HPTLC silicagel 60 GF 254 20 x 10.

indomethacin

Dung môi khai triển: n-hexan – ethyl acetat – acid
acetic(6:2,5:1,5).
Phát hiện: đèn UV 254nm và máy scanner ( quét từ 200700 nm)

Ta có thể thấy trên thế giới cũng như ở nước ta để phát hiện thuốc giảm đau,
chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược có rất nhiều phương pháp có thể
sử dụng. Từ đơn giản nhất như TLC cho đến phương pháp tiên tiến hơn như HPTLC,
HPLC hay hiện đại nhất hiện nay như LC-MS hay LC-MS/MS. Với ưu điểm của
phương pháp HPTLC đã nêu trên chúng tôi quyết định ứng dụng để nghiên cứu phát
hiện 5 chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm có thể trộn lẫn trong chế phẩm đông
dược.

16