BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN HIẾU
1201208

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN HIẾU
1201208

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH
MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU
TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. ThS. Ngô Quang Trung
2. NCS.ThS. Đào Thị Cẩm Minh


Hà Nội, tháng 5 năm 2017
Sinh viên

Nguyễn Xuân Hiếu


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ........................................................................... 3
1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ................................................................. 3
1.1.1. Tình trạng trộn trái phép thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược ......... 3
1.1.2. Tổng quan về Metformin hydroclorid ...................................................... 4
1.1.3. Tổng quan về nhóm Sulfonylure ............................................................... 5
1.1.4. Một số nghiên cứu xác định thuốc tân dược giảm glucose máu trộn trái
phép trong chế phẩm đông dược, TPCN ............................................................. 8
1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu .................................... 11
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ....................................................................... 11
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ ............................................................................... 12
1.2.3. Một số ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ ............................................. 16

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……17
2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu ............................................................ 17
2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn .............................................................................. 17
2.1.2. Máy móc - trang thiết bị .......................................................................... 17
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................ 19


Acetonitril

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Asoociation of
Official Analyical Chemists)

MET

Metformin hydroclorid

GLIB

Glibenclamid

GLIC

Gliclazid

GLIM

Glimepirid

GLIP

Glipizid

ESI


Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TB

Trung bình

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

TPCN

Thực phẩm chức năng

SERS

Tán xạ Raman tăng cường bề mặt (Surface- enhanced Raman

spectroscopy)


DANH MỤC CÁC BẢNG
Tên bảng

Trang



38

Bảng 3.6. Kết quả xây dựng đường chuẩn 5 chất phân tích

39

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

40

Bảng 3.8. Kết quả hàm lượng glibenclamid trong các mẫu thử

41


DANH MỤC CÁC HÌNH

Tên hình

Trang

Hình 1.1. Sơ đồ hệ thống HPLC

12

Hình 1.2. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

13


37

Hình 3.6. Sắc ký đồ của các chất phân tích ở nồng độ LOQ

39

Hình 3.7. Sắc ký đồ các mẫu dương tính

43


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, đái tháo đường thực sự trở thành gánh nặng của xã
hội khi số người bị bệnh không ngừng gia tăng. Tại Việt Nam, theo điều tra quốc gia
về tỷ lệ đái tháo đường năm 2008, tỷ lệ mắc đái tháo đường type 2 tại các thành phố
lớn là 7-10%, tăng 300% trong vòng 10 năm, đây là một con số đáng báo động [11].
Đái tháo đường là bệnh mạn tính, người bệnh thường phải dùng thuốc suốt đời để
khống chế tăng đường huyết, vì đường huyết càng tăng cao, càng biến động thì
biến chứng nguy hiểm xuất hiện càng sớm và càng nặng. Do nghi ngại tác dụng
phụ của tân dược khi sử dụng kéo dài, hiện nay có xu hướng sử dụng đông dược,
thuốc có nguồn gốc từ thảo mộc trong điều trị và hỗ trợ điều trị đái tháo đường
do tính an toàn của nó khi sử dụng trong thời gian dài, khả năng kiểm soát đường
huyết tương đối tốt và giá thành rẻ.
Thuốc giả hiện là vấn nạn có quy mô toàn cầu. Ở Việt Nam, năm 20122013, thuốc giả, thuốc không đạt tiêu chuẩn chiếm 2-3% thị trường dược phẩm [3].
Không chỉ ở thị trường tân dược, các chế phẩm đông dược cũng thường được làm
giả do có lợi nhuận lớn và quản lý còn chưa chặt chẽ. Những năm gần đây hệ thống
kiểm nghiệm cũng như các cơ quan công an, quản lý thị trường và thanh tra đã
phát hiện khá nhiều thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ
dược liệu trộn trái phép thuốc tân dược. Các tân dược trộn lẫn trong đông dược
gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau như thuốc chống viêm không steroid

1.1.1. Tình trạng trộn trái phép thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các
nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc
sức khỏe của họ, nhất là ở châu Phi và châu Á. Ví dụ như dân số sử dụng thuốc đông
dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali,
chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60%
ở Uganda [22]. Trong nước, nhận thức được tính an toàn của các sản phẩm có nguồn
gốc từ tự nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo
dược ngày càng tăng. Mặt khác, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ
truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có
nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được lựa chọn để sử dụng. Hiện nay, các chế phẩm
có nguồn gốc từ thảo dược được phát triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài
thuốc gia truyền được sản xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược;
các chế phẩm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược.
Chế phẩm đông dược, TPCN điều trị đái tháo đường trong thành phần có chứa
dược liệu có khả năng ổn định đường huyết như giảo cổ lam, dây thìa canh… Có hơn
1000 loài cây được xác định có khả kiểm soát glucose máu và ít tác dụng phụ [26],
trong đó có nhiều cây đã được nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam như giảo cổ lam,
khổ qua, quế,…[16,24,25]. Thành phần công bố của các chế phẩm này rất phong phú,
có chế phẩm thành phần chỉ gồm 1 vị dược liệu, hoặc phối hợp nhiều vị dược liệu để
tăng tác dụng. Dạng bào chế của các chế phẩm này rất đa dạng: viên nang, viên nén,
trà túi lọc, hoàn cứng, hoàn mềm, thuốc tán… Một số chế phẩm không có số đăng
ký, được sản xuất nhỏ lẻ và bán như những bài thuốc gia truyền của các lương y,
lương dược. Người dân có thể dễ dàng mua các chế phẩm tại các nhà thuốc, siêu thị,
chợ thuốc hay thậm chí là trên mạng internet.
Cho rằng sản phẩm đông dược có nguồn gốc từ thiên nhiên, gần gũi nên không
độc hại, hiệu quả điều trị được lịch sử chứng minh, ít tác dụng phụ nên nhu cầu sử

3


4


-

Công thức hoá học: C14H11N5.HCl

-

Khối lượng phân tử: M= 165,6

-

Tên khoa học: 1,1– dimethylbiguanid hydroclorid [6].

-

Tính chất: Tinh thể trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol, thực tế

không tan trong aceton và dicloromethan. Điểm chảy từ 222oC đến 226oC [6].
-

Liều dùng: Viên nén 500 mg: Bắt đầu uống 500 mg/lần, ngày 2 lần. Tăng liều

thêm một viên mỗi ngày, mỗi tuần tăng 1 lần, tới mức tối đa là 2,5 mg/ngày [4].
-

Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng ức chế hấp thu glucose ở ruột, tăng

nhập glucose vào tế bào, kích thích phân huỷ và ức chế tái tạo glucose. Ngoài ra còn

- Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong
dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung dịch kiềm
loãng. Nóng chảy ở 169oC đến 174oC [6].
- Liều dùng: Liều ban đầu từ 2,5- 5 mg mỗi ngày. Liều duy trì từ 1,25 - 10
mg/ngày. Liều tối đa là 15 mg/ngày [4].
1.1.3.2. Gliclazid (GLIC)

- Công thức hóa học: C15H21N3O3S
- Khối lượng phân tử: M= 323,4
- Tên khoa học: 1-(azabicyclo [3,3,0] oct-3-yl)-3-p-tolylsulfonylure [6]
- Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng . Thực tế không tan trong
nước, dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol [6]

6


- Liều dùng: Có thể bắt đầu dùng với liều: 40 - 80 mg, thường dùng 80
mg/ngày và tối đa là 320 mg/ngày [4]
1.1.3.3 Glimepirid (GLIM)

- Công thức hóa học: C24H34N4O5S
- Khối lượng phân tử: M=490,6
- Tên khoa học: 1-[[4-[2-(3-Ethyl-4-methyl-2-oxo-3-pyrroline-1-carboxamido)ethyl] phenyl] sulphonyl]-3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea [17].
- Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong
dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol [17].
- Liều dùng: Khởi đầu 1-2mg /ngày. Duy trì 1-4mg/ ngày. Tối đa 8mg/ngày [4].
1.1.3.4 Glipizid (GLIP)

- Công thức hóa học: C21H27N5O4S
- Khối lượng phân tử: M= 445,5


Viên nén
Viên nang

Phương pháp,điều kiện phân tích
và một số kết quả
UPLC-MS/MS
Glibenclamid Điều kiện sắc ký
Metformin
- Cột C18 (50mm x 2,1mm, 1,7µm)
Rosiglitazon - Pha động: Aceonitril chứa 0,1% acid
Glimepirid
formic và nước chứa 0,1% acid formic
Phenformin
(gradient nồng độ).
Gliclazid
- Tốc độ dòng: 0,20 ml/phút
Chlorpropamid - Thể tích tiêm 10 µl
Nateglinid
Điều kiện MS
Mitiglinid
- Chế độ phát hiện MRM
Kết quả nghiên cứu
- LOQ: MET (2,15ng/ml), GLIB
(3,84ng/ml), GLIC (1,9ng/ml), GLIM
(10,9ng/ml), GLIP (4,00ng/ml).
- 14 mẫu trong 30 mẫu phát hiện trộn tân
dược đái tháo đường. Lượng GLIB được
trộn lẫn thay đổi từ 0,88- 6,78 mg/viên;
lượng MET thay đổi từ 4,33- 34,1 mg/viên

29

Bột TPCN
thêm 1%
(kl/kl):
Meformin
Phenformin
Rosiglitazon
Pioglitazon

Phenformin
Metformin
Rosiglitazone
Pioglitazone

19

Viên nén
Viên nang
Thuốc viên
Thuốc hạt

Glibenclamid
Metformin
Phenformin
Rosiglitazon
Gliclazid
Glimepirid
Mitiglinid


điều chỉnh tới pH 3,75)
- Tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo
gradient
- Thể tích tiêm 20 µl
- Detector DAD, phát hiện ở UV 220 nm

9


22

Viên nén
Viên nang
Trà túi lọc
Thuốc hạt

28

Viên nang

TLC
Tolbutamid
- Pha động: n-butyl acetat có chứa 0,4 %
Acetohexamid acid formic
Chlorpropamid - Quan sát vết ở UV 254 nm
Gliclazid
- Thuốc thử phát hiện : Dragendoff, acid
Glibenclamid phosphomolybdic 10%/methanol, acid
Glimepirid
sulfuric 30%/methanol.

thuốc viên, thuốc tán, trà túi lọc. Chất phân tích trong mẫu thử được chiết siêu âm
bằng methanol (MeOH) và sắc ký với điều kiện: bản mỏng silica gel 60 F254, pha
động gồm n-butyl acetat - MeOH - acid formic (11: 2,5: 1,5), thể tích mẫu: 5µl,
quan sát vết ở UV 254 nm, bước sóng quét phổ để định lượng 230 nm. Kết quả, 41
mẫu âm tính với Metformin; Glibenclamid được tìm thấy từ 8 trong số 41 mẫu thu
thập được. Hàm lượng Glibenclamid được trộn lẫn thay đổi 0,18 mg/viên tới 2,21

10


mg/viên, lượng này tính theo liều dùng với 1 số mẫu là từ 1,8 mg/liều đến 2,21
mg/liều.
Vũ Ngọc Thắng và cộng sự [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định
lượng đồng thời 6 thuốc hóa dược điều trị tiểu đường (rosiglitazon, piogliazon,
glibenclamid, glimepirid, glipizid, gliclazid) trên nền mẫu viên nang cứng bào
chế từ dược liệu có tác dụng hạ đường huyết kiểm tra không có chất nghiên cứu
với cột C18, pha động là dung dịch đệm triethylamin điều chỉnh về pH 3,4 bằng
acid phosphoric, phát hiện ở bước sóng 230 nm. Nghiên cứu này mới dừng lại
ở phần thẩm định phương pháp.
Phương pháp HPTLC có ưu điểm có thể rà soát nhanh với số lượng mẫu lớn,
xử lý mẫu đơn giản. Tuy nhiên do nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa
dạng (biết đầy đủ thành phần- thuốc đông dược, chỉ biết thành phần chính- thực
phẩm chức năng), các thành phần trong dược liệu đi vào có thể xảy ra hiện tượng
âm tính giả HPTLC và hiện tượng dương tính giả TLC. Vì vậy chúng tôi lựa chọn
phương pháp hiện đại LC-MS/MS có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, khoảng nồng độ
tuyến tính rộng để tiến hành xác định chính xác các tân dược đái tháo đường trộn
trong đông dược.

1.2. Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu
1.2.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp phân tích
dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất. Phương pháp này
nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử cửa chất
đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện
trường hoặc từ trường nhất định.

12


Hình 1.2. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển
sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Các
ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối phổ. Tùy theo
loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm
(-). Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được
dùng phổ biến hơn.
 Thiết bị khối phổ
- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối
phổ. Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tùy thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần
phân tích:
+ Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng dễ bay hơi bằng cách
tiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC-MS), sắc ký lỏng (LC-MS).
+ Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các chất rắn, tinh thể…
Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký.
- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử
mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion,
các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao. Ion phân tử và các
mảnh ion là các phần tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e
(khối lượng ion/điện tích).
So với các kỹ thuật ion hóa đòi hỏi áp suất thấp như bắn phá nguyên tử nhanh

14


Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện đặt song
song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi
thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực.

Hình 1.4. Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy Brucker
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2,
Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ. Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích
khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí
dùng cho va chạm thường là khí argon. Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được
gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất
hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần.
- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại
thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ.
- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)
Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần
mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo
cáo, xuất dữ liệu thô vừa thu được. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ
bao gồm :
+ Quét toàn phổ (SCAN)
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường dùng
để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu dò khối
phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ
Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định
ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

15

Bảng 2.1. Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu
STT

Nguyên vật liệu

Tiêu chuẩn

Nguồn gốc

Chất chuẩn
1

Metformin.HCl

Chuẩn QG

2

Glibenclamid

Chuẩn QG

3

Gliclazid

Chuẩn QG

4


HPLC

Merck - Đức

7

Acetonitril

HPLC

Merck - Đức

8

Acid formic

PA

Merck - Đức

9

Ether dầu hỏa

AR

Trung Quốc

10