BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THẮM
Mã sinh viên : 1201557

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNHMỘT SỐ THUỐC
GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN
TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC- MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BÙI THỊ THẮM
Mã sinh viên: 1201557

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP
XÁC ĐỊNHMỘT SỐ THUỐC
GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN
TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM
ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. DS. Thái Khoa Bảo Châu

tâm và tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn này.
Hà Nội, ngày18tháng 5năm 2017
Bùi Thị Thắm


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .....................................................................................3
2.1.

Tổng quan các thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược .....3

2.2. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu ..........................................................5
2.2.1.

Tổng quan về Paracetamol ....................................................................5

2.2.2.

Tổng quan về indomethacin ..................................................................5

2.2.3.

Tổng quan về piroxicam ........................................................................6

2.2.4.


Nguyên vật liệu, thiết bị ............................................................................18

2.1.1.

Hoá chất- chất chuẩn ..........................................................................18

2.1.2.

Thiết bị ..................................................................................................19

2.1.3.

Đối tượng nghiên cứu..........................................................................20

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................20

2.2.1.

Thu thập mẫu .......................................................................................20

2.2.2.

Xử lý mẫu .............................................................................................20


2.2.3.

Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS ......................20

3.2.2.

Độ đặc hiệu ..........................................................................................35

3.2.3.

Độ đúng ................................................................................................38

3.2.4.

Độ lặp lại ..............................................................................................39

3.2.5.

Khoảng tuyến tính................................................................................40

3.2.6.

LOD và LOQ ........................................................................................41

3.3.

Ứng dụng phương pháp ............................................................................42

BÀN LUẬN ..............................................................................................................45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................46
TÀI LIỆU THAM KHẢO


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

: Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ

: Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

m/z

: Khối lượng/ điện tích

MeOH

: Methanol

PA

: Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TB

: Trung bình

TLC

: Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC)


Hình 3. 5. Phổ khối của indomethacin ............................................................ 29
Hình 3. 6. Phổ khối hai mảnh con 65,1 và 110,1 của paracetamol................. 29
Hình 3. 7. Sắc ký đồ phân tích 4 chất khảo sát thành phần pha động ............ 33
Hình 3. 8. Sắc ký đồ phân tích 4 chất khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp37
Hình 3. 9. Sắc đồ LOD của paracetamol. ....................................................... 41
Hình 3. 10. Sắc đồ LOQ của ketoprofen. ........................................................ 41
Hình 3. 11. Sắc đồ dương tính paracetamol mẫu HC08 ................................. 43
Hình 3. 12. Sắc đồ dương tính paracetamol và indomethacin mẫu BN01 ..... 43
Hình 3. 13. Sắc đồ dương tính mẫu BN51 ...................................................... 44


ĐẶT VẤN ĐỀ
Các loại thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ đông dược ngày càng
được sử dụng rộng rãi trên thị trường trong nước và trên toàn thế giới. Nó là một
phần quan trọng của xu hướng thay thế dược phẩm tổng hợp. Xu thế này đã khởi
đầu từ cách đây 20 năm, như một nghiên cứu của Harvard gần đây đã phát hiện ra
rằng một phần ba người được hỏi thừa nhận sử dụng ít nhất một liệu pháp thay thế
trong quá khứ, và chi tiêu tại Mỹ cho những biện pháp thay thế này có thể lên tới
13,7 tỷ đô la trong một năm [14]. Vì nó là những lựa chọn thay thế hoàn toàn tự
nhiên, kinh tế và được người sử dụng tin rằng chúng an toàn hơn các thuốc tân
dược. Ở Việt Nam, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu
đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ
thảo dược ngày càng chiếm ưu thế so với các thuốc tân dược. Theo Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các nước đang phát triển vẫn
dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe của họ. Ví dụ
như dân số sử dụng thuốc đông dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của
Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở
Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60% ở Uganda [16]. Vậy nên việc đánh
giá mức độ an toàn của các sản phẩm đông dược ngày càng trở nên quan trọng. Gần
đây, một số báo cáo cho thấy các loại thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc

Với mục tiêu:
1. Xây dựng qui trình định tính, định lượng paracetamol, piroxicam,
indomethacin và ketoprofen trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng
phương pháp LC/MS.
2. Ứng dụng phương pháp LC/MS để xác định paracetamol, piroxicam,
indomethacin và ketoprofen trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
2.1.

Tổng quan các thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược
Mặc dù thuốc đông dược đã sử dụng từ lâu, nhưng người sử dụng có rất ít

kiến thức về thành phần, tác dụng dược lý, an toàn hiệu quả của nó. Thuốc
đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị,
và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng. Do quy định ít chặt chẽ, có nhiều
thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp (tân
dược) không khai báo. Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Liên minh Châu Âu
(EU) ban hành một số hướng dẫn và các hành động liên quan đến an toàn và sử
dụng thuốc thảo dược thích hợp.Ở nước ta, nhằm đảm bảo chất lượng dược
liệu, chế phẩm đông dược sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã
ban hành nhiều văn bản chỉ đạo, thông tư hướng dẫn nhằm tăng cường công tác
quản lý chất lượng, đáng chú ý là Thông tư 43/2014/TT- BYT ngày 24 tháng
11 năm 2014 Quy định về quản lý thực phẩm chức năng. Đặc biệt, trong năm
2016 Quốc hội đã ban hành Luật Dược 2016 số 105/2016/QH13, trong đó dành
riêng chương IV với 8 điều qui định về dược liệu và thuốc cổ truyền sản xuất
và lưu hành tại Việt Nam.

thuốc

kháng

Histamin

(clopheniramin,...). Nhóm thuốc an thần gây ngủ (diazepam) [23]. Nhóm thuốc
giảm béo (sibutramin, phenolphthalein, N-mono-desmethyl sibutramin) [12],
[17], [25], [32]. Nhóm thuốc hạ glucose-huyết (metformin, gliclazid,...) [12],
[19], [24]. Nhóm thuốc hạ huyết áp (nifedipin, amlodipin,propranolon...) [23],
[24], [29].Và nhóm lợi tiểu [35].
Trong đó, có các thuốc nhóm giảm đau chống viêm không steroid
(diclofenac, ibuprofen, indomethacin, paracetamol, ketoprofen, piroxicam…)
được phát hiện trộn trong các thuốc đông dược[18],[23], [28], [33], [34]. Do
nhóm thuốc có giá thành hợp lí và tác dụng dược lí mạnh nên được trộn nhiều
trong chế phẩm đông dược. Bên cạch đó nhóm thuốc chống viêm không steroid
có nhiều tác dụng không mong muốn. Nênnhóm nghiên cứu lựa chọn 6 chất
diclofenac, ibuprofen, indomethacin, paracetamol, ketoprofen, piroxicam để
xây dựng phương pháp xác định các chất này trong chế phầm đông dược.
Trong khuôn khổ luận văn dưới đây sẽ trình bày phương pháp xác định 4 chất
paracetamol, piroxicam, ketoprofen và indomethacinđược trộn trong đông
dược bằng LC/MS sử dụng ion hóa phun điện tích dương ESI(+).

4


2.2.

Tổng quan về đ
đối tượng nghiên cứu

Liều dùng:Liềuu dùng cho ngư
người lớn và trẻ em trên 11 tuổi,
i, uống
u
hoặc đưa vào
trựctràng là 325 - 650 mg, ccứ 4 - 6 giờ một lần,
n, nhưng không quá 4g một
m ngày[2],
[3].
2.2.2. Tổng quan về indomethacin

5


-

Công thức phân tử: C19H16ClNO4.

-

Khối lượng phân tử: M= 357,8

-

Tên khoa học: Acid 1 ––(4-clorobenzoyl)-5-methoxy-2-methylindol
methylindol-3-yl acetic.

-

Tính chất:Bột kếtt tinh tr

Khối lượng phân tử: M= 331,4.

-

Tên

khoa

học:

4--Hydroxyl-2-methyl-N–(pyridine-2-yl)-2H
2H-1,2-benzothiazin-3-

carboxamid - 1,1 - dioxid
dioxid.
-

Tính chất:Bột kếtt tinh màu vàng nh
nhạt, vị đắng, không mùi. Thự
ực tế không tan trong
nước, tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol. Dung dịch
d
bão hòa trong
dioxan- nước (2:1)
2:1) có pKa kho
khoảng 6,3.Nhiệt độ nóng chảy khoảảng 200oC [2], [6].

-

Liều dùng:Người lớnn uuống 10-30 mg/ngày, một lần vào bữaa ăn (không quá liều tối


-

Liều dùng: Vài ngày đđầu dùng liều tấn
n công 300 mg, chia làm 3 lần/ngày,
l
uống sau
bữa ăn. Sau dùng liềuu duy trì 150
150-200 mg, hoặc nạp ngày 1, 2 viên thuốc
thu đạn. Liều
tiêm bắp ngày 50-100
100 mg.
Thuốc bôi trị bong gân, viêm gân, hư kh
khớp, ngày bôi 2 lần [6].
2.2.5. Tác dụng
ng và tác dụng không mong muốn của các thuốcc thuộc
thu nhóm chống
viêm không steriod.
a) Tác dụng
ng và cơ ch
chế tác dụng
Tác dụng giảm
m đau, hhạ sốt, chống viêm: Nhóm thuốcc này có tác dụng
d
giảm
đau, hạ sốt, chống
ng viêm ở những mức độ khác nhau. Thuốc ứcc chế
ch cyclo-oxygenase
(COX)) là enzym xúc tác vi
việc sản xuất một số chấtt trung gian, đặc

b) Tác dụng không mong muốn
Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin
Rối loạn dạ dày-ruột: Thuốc chống viêm không steroid với mức độ khác nhau ức
chế COX-1 làm giảm tổng hợp prostaglandin ở dạ dày dẫn đến ức chế sản sinh ra
chất mucin (yếu tố bảo vệ dạ dày), tạo điều kiện cho HCl và pepsin của dịch vị gây
tổn thương cho niêm mạc. Ngoài ra các thuốc chống viêm không steroid còn tác
động trực tiếp hủy hoại các tế bào biểu mô tiêu hóa, gây thủng ổ loét do phần lớn
chúng đều là những acid.
Trên hệ tiết niệu: Ức chế prostaglandin ở thận làm giảm tưới máu nuôi thận, giảm
mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi
nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, suy thận cấp.
Trên hệ huyết học: Tăng nguy cơ chảy máu, kéo dài thời gian đông máu, có thể gây
ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu.
Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, ở 3 tháng cuối có thể làm tăng thời
gian mang thai, có thể gây đóng sớm ống động mạch, chảy máu trong tử cung, nguy
hiểm cho sản phụ.

8


Với những người bị phù hoặc có xu hướng phù: Như suy tim, suy thận mạn, suy gan
có thể gây tình trạng giữ nước nặng nếu điều trị bằng nhóm thuốc này.

9


Các tác dụng phụ không do ức chế tổng hợp prostaglandin
Trên hệ thần kinh: Có thể gây ù tai, điếc thoáng qua, say thuốc. Ngoài ra thuốc có
thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng các chất chuyển
hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien). Rối loạn chức năng gan, rối loạn

CAN (B) (gradient).
Detector : ESI- MS.

28

Indomethacin
Acetaminophen
Piroxicam
Ketoprofen

33

Paracetamol
Indomethacin

11

Paracetamol
Indomethacin
Ketoprofen

34

Paracetamol
Piroxicam

26

paracetamol
Ibuprofen

TLC
Bản mỏng: Silicagel H
Detector: Hơi iod
Pha động: Toluen : n-propanol : acid formic (5: 4: 1)
n-hexan :1% CTAB trong MeOH : ethyl acetat: acid
acetic(13:1:4:2)
Toluen: 1% CTAB trong MeOH : n-propanol: acid formic
(14:1:3:2).
n-hexane : ethyl acetate : acid acetic (7: 2,5: 0,5).

11


2.3.2. Tại Việt Nam
Mặc dù các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm steroid đã được quan tâm
từ rất lâu và đã có nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành xây dựng các
phương pháp phát hiện các chất giảm đau chống viêm steroid trộn trái phép trong
chế phẩm đông dược. Các phương pháp đã được xây dựng phát hiện các thuốc này
như LC-UV [4], [5], [7], TLC [8] và LC-MS tiêm trực tiếp mẫu vào khối phổ [10].
Nhưng các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm không steroid có rất ít nghiên
cứu xây dựng phương pháp phát hiện các chất này trộn trái phép trong chế phẩm
đông dược. Hơn nữa, số nghiên cứu tiến hành trên các mẫu đông dược là thực phẩm
chức năng chưa nhiều chủ yếu tiến hành trên các mẫu đông dược.
Chúng tôi chỉ tìm thấy 2 nghiên cứu đã công bố về phát hiện các chất thuộc
nhóm giảm đau chống viêmkhông steroid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược và
thực phẩm chức năng:
Nghiên cứu của Cao Công Khánh đã tiến hành địnhlượng silbutramin,
furosemid, piroxicam, dexamethason trong thực phẩm chức năng bằng HPLCtrên
các dạng viên nén, nang và lỏng cho thấy có 5 mẫu dương tính sibutramin, không
cópiroxicam, dexamethason và furosemid trong 20 mẫu thu thập trên thị trường [7].

thế giới nhưng chưa được ứng dụng nhiều trong nước ta để phân tích các thuốc
giảm đau chống viêm không steroid trong các chế phẩm đông dược. Trong đề tài
này, phương pháp LC/MS được sử dụng định tính và định lượng các thuốc giảm đau
chống viêm không steroid trong chế phẩm đông dược để cải thiện độ nhạy và độ đặc
hiệu so với các phương pháp khác, giúp cho kết luận có độ tin cậy cao hơn.
2.4.

Tổng quan về sắc kí lỏng khối phổ

2.4.1. Sắc kí lỏng hiệu năng cao
a. Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự
phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha
động lỏng dưới áp suất cao. Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng.
b. Nguyên tắc
Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một
dòng chất lỏng liên tục (pha động). Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển

13


qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất
tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành
phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định
lượng [1].
c. Cấu tạo máy HPLC
-

Bình chứa pha động


Tứ cực thứ
nhất

Buồng va
chạm

Tứ cực thứ
hai

Hình 1. 1. Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS với tứ cực chập ba.
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu
các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên
sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc
từ trường nhất định. Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn
đối với chuyển động trong điện trường hay từ trường của ion. Nếu biết được điện
tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó.
14


b. Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)
-

Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối
phổ.Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký.

-

Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử
mang điện tích hoặc sự bắn phá, phânmảnh phân tử trung hoà thành cácmảnh ion,

những ion con tùy theo yêu cầu phân tích.
Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton –
ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical
Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric
Pressure Photonization – APPI).
Trong đó, kiểu ion hóa phun điện tử (ESI) thực hiện ở áp suất khí quyển. Các
mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu
ống này có một điện thế có thể lên đến 3500V. Đồng thời, các dung dịch mẫu này
được phun sương dưới tác động của một dòng khí. Kết quả là tạo ra các hạt mang
điện tích và được gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật này phù hợp cho chất phân cực,
không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100
000Da.

15


-

Hình 1. 2. Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI
Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽđược
gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi
đến bộ phận phát hiện.
Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion
trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube).

Hình 1. 3. Tứ cực gập cong
Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): Có 4 thanh tích điện đặt
song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau. Các ion phù hợp với tần số quét
sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực.
Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2,

liệu

(data

system):

Làmộthệthốngbaogồmhệthốngkếtnốivàthunhậndữliệuthôvà
phầnmềmkiểmsoát,điềukhiểnthiếtbị,quátrìnhphântíchvàtínhtoán,xử
lý,báocáo,kếtxuấtdữliệuthôvừathuđược. Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối
phổ bao gồm :
 Quét toàn phổ (SCAN):
Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho
khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích. Thường
dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn. Đối với đầu
dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion
mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng
để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất
 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)
Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2
kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM.
SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh
ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện.
MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên
các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông
dụng hơn SRM. Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân
mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion
con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để
phát hiện.

17