BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

VÕ NGỌC BÌNH

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CÁC DẪN XUẤT MỚI CỦA ALKALOID DỪA CẠN

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ
Mã số: 9 44 01 14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Ngô Quốc Anh
2. TS. Đoàn Duy Tiên

Hà Nội – 2018


Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và các cộng
sự. Các số liệu và kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa được ai
công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu trước đây. Toàn bộ các thông tin
trích dẫn trong Luận án đã được chỉ rõ nguồn gốc xuất xứ.



II


“All sciences are vain and full of errors that are not born of
Experience, the mother of all Knowledge”

 Leonardo da Vinci

III


MỤC LỤC
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt ..............................................................................vii
Danh mục các bảng .............................................................................................................. x
Danh mục các hình vẽ, sơ đồ ...............................................................................................xi
MỞ ĐẦU.............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
1.1. Microtubule - Một đích tác dụng quan trọng của các thuốc điều trị ung thư 3
1.1.1.

Định nghĩa ................................................................................................... 3

1.1.2.

Động học của microtubule ......................................................................... 4

1.1.3.

Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule. 6

2.1.2.

Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 30

2.1.2.1. Phổ hồng ngoại IR .................................................................................. 30
2.1.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................................................ 30
2.1.2.3. Phổ khối lượng MS và HRMS ............................................................... 30
2.1.2.3. Năng suất quay cực riêng [α]D ............................................................... 31
IV


2.2. Các phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 31
2.2.1.

Các phương pháp tổng hợp hữu cơ......................................................... 31

2.2.2.

Phương pháp thử hoạt tính sinh học....................................................... 31

2.2.3.

Các phương pháp tinh chế và xác định cấu trúc ................................... 31

2.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone α,βkhông no ........................................................................................................................ 32
2.3.1. Tổng hợp anhydrovinblastine 12 ................................................................ 32
2.3.2. Tổng hợp 18(S)-3’,5'-dimethoxyanilinecleavamine 77 .............................. 33
2.3.3. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới chứa mạch nhánh ketone
α,β-không no .............................................................................................................. 34
2.4. Tổng hợp một số dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine


3.2. Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới từ 3’-cyanoanhydrovinblastine
88….. .............................................................................................................................. 84
3.2.1.
Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử chọn lọc
3’-cyanoanhydrovinblastine 88 ............................................................................... 84
3.2.2.
Tổng hợp các dẫn xuất vinca alkaloid mới thông qua việc khử alkyl
hóa aminomethyl 92c ................................................................................................ 99
3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các chất nghiên cứu.................................... 102
3.3.1.

Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro ............................................ 102

3.3.1.1. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB và ung thư gan
HepG2… .............................................................................................................. 102
3.3.1.2. Đánh giá hoạt tính sinh học trên dòng tế bào ung thư bạch huyết cấp
tính ở người HL-60 .............................................................................................. 106
3.3.2.

Kết quả Docking...................................................................................... 115

3.3.2.1. Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Autodock 4.0 ................ 116
3.3.2.2. Kết quả docking phân tử sử dụng phần mềm Patchdock ..................... 117
KẾT LUẬN ..................................................................................................................... 120
NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ......................................................................... 121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ............................................................. 122
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 123
PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 139



COSY

Correlation Spectroscopy

CBPI

Cytochalasin B proliferation index

m-CPBA

meta-Chloroperoxybenzoic acid

13

Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy

C-NMR

D
DCM

Dichloromethane

DEPT

Distortioless Enhancement by Polarisation Tranfer

DMSO



EtOAc

Ethyl acetate

EtOH

Ethanol

VII


F
FDA

Fluorescein diacetate

H
HRMS

Hight resolution Mass Spectroscopy

1

Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation



Infrared Spectroscopy

IC50

Inhibitory concentration of 50% of cell proliferation

K
KB

Human epidemoid carcinoma

M
MeOH

Methanol

N
NMR

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

NOESY

Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

NIS

N-Iodosuccinimide



TFA

Trifluoroacetic acid

TLC

Thin Layer Chromatography

V
VBL

Vinblastine

VCR

Vincristine

VFL

Vinflunine

VRB

Vinorelbine

IX


DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Cấu trúc và các quá trình polymer hóa, khử polimer hóa microtubule ............... 3
Hình 1.2. Microtubule trong hai tế bào xương osteosarcoma trong kỳ trung gian của chu
kỳ tế bào. Microtubule có màu đỏ, chromatin có màu xanh lam và các centromeres có
màu xanh lá cây .................................................................................................................... 4
Hình 1.3. Động học của microtubule ................................................................................... 6
Hình 1.4. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule và vị trí
liên kết của chúng trên microtubule ..................................................................................... 7
Hình 1.5. Vị trí gắn kết của vinblastine (màu xanh) và colchicine (màu vàng) trên tubulin ......... 7
Hình 1.6. Cây dừa cạn Catharanthus roseus ........................................................................ 9
Hình 1.7. Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng ..................................... 10
Hình 1.8. Sự oxi hóa vinblastine 1 thành vincristine 2 ...................................................... 11
Hình 1.9. Tổng hợp vindesine 3......................................................................................... 11
Hình 1.10. Sinh tổng hợp vinblastine 1 từ Catharanthine 6 và vindoline 7....................... 12
Hình 1.11. Tổng hợp anhydrovinblastine theo Potier và các cộng sự ............................... 12
Hình 1.12. Tổng hợp anhydrovinblastine theo Vukovic ................................................... 13
Hình 1.13. Tổng hợp vinblastine từ anhydrovinblastine theo Potier ................................. 13
Hình 1.14. Tổng hợp vinblastine theo Kutney................................................................... 14
Hình 1.15. Tổng hợp in situ vinblastine từ catharanthine và vindoline theo Dale Boger .... 14
Hình 1.16. Sự chuyển hóa chloroindolenine 21 thành vinblastine 1 ................................. 15
Hình 1.17. Sự chuyển hóa amin bậc 3 24 thành vinblastine 1........................................... 15
Hình 1.18. Chuyển hóa của anhydrovinblastine N-oxide 26 hoặc chloro-indolenine 30
thành vinorelbine 4 ............................................................................................................. 16
Hình 1.19. Tổng hợp vinflunine 5 ..................................................................................... 16
Hình 1.20. Sự chuyển hóa của chloroindolenine 31 và 34 thành vinblastine 1................. 17
Hình 1.21. Tổng hợp toàn phần vinblastine theo Boger và các cộng sự, 2009 ................. 18
Hình 1.22. Các dẫn xuất được biến đổi trên phần vindoline: vinglycinate 42, vinzolidine
43, vintriptol 44, vinepidine 45, vinfosiltine 46 và 47 ....................................................... 21
Hình 1.23. Sự thay đổi cấu trúc vinblastine tại vị trí 12’................................................... 22
XI

Hình 3.23. Sự khử hợp chất 88 sử dụng LiAlH4................................................................ 93
Hình 3.24. So sánh một phần phổ 1H NMR (CDCl3) của hợp chất 88, 92d và 92e .......... 93
XII


Hình 3.25. Sự khử hợp chất 88 bằng NaBH3CN với xúc tác Ni2B ................................... 94
Hình 3.26. Phổ IR của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b. ................... 94
Hình 3.27. So sánh tương quan phổ 1H NMR (CDCl3) của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)anhydrovinblastine 92b và 88 ............................................................................................ 95
Hình 3.28. Phổ NOESY của 3'R-cyano-(4’R,5’-dihydro)-anhydrovinblastine 92b ........... 95
Hình 3.29. Sự khử hợp chất 88 sử dụng NaBH4, xúc tác CoCl2 ....................................... 96
Hình 3.30. Phổ IR của hợp chất 92c .................................................................................. 96
Hình 3.31. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất 92c.................................... 97
Hình 3.32. So sánh một phần phổ 1H NMR của hợp chất (3'S-aminomethyl)-(4’S,5’dihydro)-anhydrovinblastine 92c và 88 .............................................................................. 97
Hình 3.33. Cấu trúc và đánh số theo IUPAC của các hợp chất 93a-f ............................. 100
Hình 3.34. Phổ 1H NMR của hợp chất 93a...................................................................... 101
Hình 3.35. Phổ khối phân giải cao của hợp chất 93a ...................................................... 101
Hình 3.37. Sự tăng sinh sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và vinca alkaloid mới (B)
với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ. ........... 108
Hình 3.38. Tế bào apoptosis sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloids mới (B) với
nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ .................. 110
Hình 3.39. Sự chết tế bào sớm sau khi xử lý với vinca alkaloid (A) và alkaloid mới (B)
với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM) trong 24 giờ. ........... 111
Hình 3.40. Kiểm soát chu kỳ tế bào sau khi xử lý với vinca alkaloid được tạo thành (A)
và alkaloid mới (B) với nồng độ khác nhau (NC = 0,1% DMSO, 1, 10, 100, 1000 nM)
trong 24 giờ....................................................................................................................... 113
Hình 3.41. Tubulin – 83a ................................................................................................. 118
Hình 3.42. Tubulin-92b ................................................................................................... 119
Sơ đồ 3.1. Quy trình chung tổng hợp các hợp chất 76a-c. ................................................. 71
Sơ đồ 3.2. Tổng hợp các vinca alkaloid chìa khóa 12 và 77.............................................. 71
Sơ đồ 3.3. Cơ chế của phản ứng Vukovic .......................................................................... 72

tế bào để ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và sau đó gây ra sự chết tế bào theo
chương trình (apoptosis). Do đó, hai cách tiếp cận thường được sử dụng: nhắm mục tiêu
DNA (ngăn ngừa sự tổng hợp hoặc làm hỏng DNA) hoặc hạn chế các chức năng của
thoi phân bào [5]. Trong đó, thuốc tác dụng lên microtubule là một trong những loại
thuốc trị liệu được sử dụng rộng rãi nhất trong điều trị ung thư. Hiệu quả của chúng đã
được chứng minh để điều trị nhiều loại ung thư ở người, bao gồm ung thư vú, phổi,
buồng trứng và tuyến tiền liệt, cũng như các khối u ác tính về huyết học và ung thư ở trẻ
em [6-7].
Phần lớn các thuốc ức chế phân bào là các hợp chất tự nhiên ngăn chặn sự phân
bào bằng cách tương tác với microtubule, một protein thiết yếu của tế bào. Trong những
năm 1950, sự phát hiện ra vinblastine (Velban®) và vincristine (Oncovin®), hai alkaloid
tự nhiên từ cây dừa cạn Madagascar (Catharanthus roseus) là một trong những ví dụ
nổi bật nhất của loại hợp chất này, các vinca alkaloid gây chết tế bào bởi apoptosis bằng
cách ức chế động học của microtubule. Kể từ đó, những nỗ lực để thay đổi cấu trúc ban
đầu của các phân tử này đã dẫn tới sự phát triển và sau đó là sử dụng lâm sàng của ba
1


vinca alkaloid tổng hợp vindesine (Eldesine®), vinorelbine (Navelbin®) và vinflunine
(Javlor®).
Xuất phát từ cơ sở các kết quả nghiên cứu và tính cấp thiết trong thực tiễn, chúng
tôi đã thực hiện luận án: “Nghiên cứu tổng hợp và hoạt tính sinh học các dẫn xuất
mới của alkaloid dừa cạn” với mục tiêu tổng hợp được các dẫn xuất mới của alkaloid
dừa cạn và đánh giá hoạt tính kháng ung thư của chúng.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN


1.1.2. Động học của microtubule
Một điều quan trọng trong tính chất của các đại phân tử này là đặc tính động
học của nó. Có thể tạm hiểu là sự thay đổi cấu trúc theo thời gian. Có 2 kiểu động học
trong cấu trúc là: (a) “dynamic instability” cấu trúc của microtubule có thể dài ngắn tuỳ
theo chu kỳ; (b) “treadmilling” đầu (+) dài ra, sau đó đầu (-) ngắn lại, nhưng chiều dài
tổng thể không đổi. Đáng chú ý là các microtubule cấu tạo nên các sợi siêu vi, nơi bám
4


của các chromosome trong quá trình phân bào. Các sợi siêu vi microtubule này có tính
động học rất lớn, 4-100 lần so với sự thay đổi cấu trúc của các microtubule thông thường.
Các chức năng sinh học của các microtubule trong tất cả các tế bào được xác định
và được điều chỉnh phần lớn bởi các động học polimer hóa của chúng [15-18].
Microtubule cho thấy hai loại động học không cân bằng, cả với các hệ thống microtubule
tinh khiết trong in vitro và trong các tế bào (Hình 1.3). Một loại tính chất động học rất
nổi bật trong tế bào được gọi là "dynamic instability", là một quá trình trong đó các đầu
microtubule riêng lẻ chuyển đổi giữa các giai đoạn tăng trưởng và rút ngắn [19]. Hai
đầu của một mictubule không tương đương, một đầu được gọi là đầu dương tăng trưởng
và rút ngắn nhanh hơn và rộng hơn đầu kia (đầu âm). Sự thay đổi độ dài theo thời gian
ở các đầu của một nhóm các microtubule do quá trình “dynamic instability” được minh
họa trong hình 1.3a, 1.3b. Các microtubule trải qua thời gian tương đối dài của sự kéo
dài, thời gian ngắn của sự rút ngắn nhanh và thời kỳ các động học suy giảm hoặc tạm
dừng, khi các microtubule không phát triển cũng không thể rút ngắn được.
Kiểu động học thứ nhất, “Dynamic instability” được đặc trưng bởi bốn yếu tố
chính: tốc độ tăng trưởng microtubule, tốc độ rút ngắn, tần suất chuyển đổi từ trạng thái
tăng trưởng hoặc tạm dừng sang rút ngắn (quá trình chuyển đổi này được gọi là
“catastrophe”) và tần suất chuyển đổi từ rút ngắn sang tăng trưởng hoặc tạm dừng (gọi
là “rescue”). Các khoảng thời gian tạm dừng được xác định hoạt động khi bất kỳ sự thay
đổi độ dài microtubule nào có thể xảy ra thấp hơn độ phân giải của kính hiển vi quang
học. Yếu tố được gọi là “dynamicity” rất hữu ích để mô tả tổng thể nhìn thấy bằng mắt


Thời gian (s)
Đầu (-)

Thời gian
(đơn vị bất kỳ)

Đầu (+)

Hình 1.3. Động học của microtubule [10]
1.1.3. Các nhóm thuốc chống ung thư theo cơ chế tác dụng lên microtubule
Các loại thuốc ức chế phân bào tác dụng lên microtubule thường được phân thành
hai nhóm chính. Một nhóm được biết đến như là các chất làm bất ổn định microtubule
(microtubule-destabilizing), ức chế quá trình polimer hóa microtubule ở nồng độ cao và
hầu hết các chất này liên kết với một trong hai vùng microtubule hoặc vùng vinca hoặc
vùng colchicine. Các chất liên kết trên vùng vinca bao gồm các vinca alkaloid
(vinblastine, vincristine, vinorelbine, vindesine và vinflunine), cryptophycin và
dolastatin (eribulin, spongistatin, rhizoxin, maytansinoid và tasidotin). Chất liên kết trên
vùng colchicine bao gồm colchicine và các chất tương tự, podophyllotoxin,
6


combretastatin,

CI-980,

2-methoxyoestradiol,

phenylahistin


dụng trong trị liệu
Vùng liên kết

Tên biệt dược

Ứng dụng trị liệu

Tài liệu tham
khảo

Vùng Vinca

Vinblastine (Velban)

Bệnh Hodgkin, ung thư tế bào

[36-39]

mầm tinh hoàn
Vincristine (Oncovin)

Ung thư bạch cầu, ung thư bạch

[40-42]

huyết
Vinorelbine (Navelbine)

Các khối u rắn, ung thư bạch



Methoxybenzene-

Các khối u rắn

CA-1-P, CA-4-P, Nacetylcolchicinol-O-phosphate,
ZD6126)

[53]

sulphonamide
(như ABT-751,
E7010)
Vị trí Taxane

Paclitaxel (Taxol),

Ung thư buồng trứng, vú và phổi,

TL00139 và các chất

ung thư Kaposi

[54-57]

tương tự paclitaxel
Docetaxel (Taxotere)

Các u tuyến tiền liệt, não và u


……………

microtubule

1.2.

Vinca alkaloid
Vinca alkaloid là một trong những lớp chất chống ung thư quan trọng và lâu đời

nhất và là tác nhân tác dụng lên microtubule. Phần này chứa một số thông tin quan trọng
về vinca alkaloid, tổng hợp vinca alkaloid, mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính cho đến sự
phát triển lâm sàng.
1.2.1. Giới thiệu về vinca alkaloid
Cây dừa cạn Catharanthus roseus (L.) G. DON (Vinca rosea L.) là loài cây có
nguồn gốc từ Madagasca thuộc họ Apocynaceae được trồng chủ yếu ở các nước có khí
hậu ấm, ban đầu được trồng làm cây cảnh vì nó có hoa màu hồng hoặc màu trắng rất
đẹp, hơn nữa nó cũng đã trở thành chè thuốc và dược liệu chữa trị nhiều loại bệnh. Từ
lâu, cây dừa cạn là vị thuốc dân gian được người dân các nước châu Phi và châu Á dùng
để chữa trị nhiều loại bệnh như tiểu đường, cao huyết áp, làm thuốc giảm đau, chữa bệnh
thiếu vitamin C,… [74-75].

Hình 1.6. Cây dừa cạn Catharanthus roseus
9


Hình 1.7. Một số alkaloid dừa cạn được sử dụng trong lâm sàng
Alkaloid dừa cạn (Vinca alkaloid) là một họ các hợp chất indole dạng dimer được
chiết xuất hoặc bán tổng hợp từ cây dừa cạn Catharanthus roseus, đại diện cho một
trong những lớp chất chống ung thư quan trọng nhất. Hoạt tính chống ung thư của
alkaloid dừa cạn được phát hiện từ những năm 50 của thế kỷ 20. Hơn 40 năm sau đó,