TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2
KHOA SINH - KTNN

======

NGUYỄN THỊ THANH THỦY

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
THUỐC OMEPRAZOLE CỦA MÀNG

CELLULOSE VI KHUẨN LÊN MEN
TỪ MÔI TRƢỜNG CHUẨN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật

HÀ NỘI-2018


TRƢỜNG ĐẠI
HỌC
SƢƠN
PHẠM HÀ NỘI 2
LỜI
CẢM
KHOA
SINH
- KTNN
Lời đầu tiên, em xin đƣợc bày
tỏ lòng
biết ơn
sâu sắc đến thầy Nguyễn Xuân

cảm ơn!
KHUẨN

LÊN MEN

Hà Nội, Ngày 10 tháng 05 năm 2018

TỪ MÔI TRƢỜNG CHUẨN
Sinh viên
Nguyễn Thị Thanh Thủy

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Chuyên ngành: Sinh lý học ngƣời và động vật
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN XUÂN THÀNH

HÀ NỘI-2018


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn
Xuân Thành, ngƣời đã hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2; các
thầy, cô giáo trong khoa Sinh - KTNN cùng toàn thể các thầy cô trong Viện
Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong
suốt quá trình làm thực nghiệm hoàn thành khóa luận của mình.
Vì chƣa có nhiều cơ hội tham gia nghiên cứu khoa học nên em còn
nhiều bỡ ngỡ cũng nhƣ kinh nghiệm của em còn nhều hạn chế do đó không
tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong nhận đƣợc sự góp ý, xây dựng của

Hestrin - Schramm

MT1

Môi trƣờng 1

MT2

Môi trƣờng 2

MT3

Môi trƣờng 3


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài ............................................................................................ 1
2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2
3. Phạm vi nghiên cứu ....................................................................................... 2
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn.......................................................... 2
NỘI DUNG ....................................................................................................... 4
Chƣơng 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 4
1.1.Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose.......................... 4
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK)....................................................................... 4
1.1.1.1. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (CVK). ........................................... 4
1.1.1.2. Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn. ............................................. 4
1.1.1.3. Tính chất của cellulose vi khuẩn .......................................................... 5
1.1.1.4. Đặc tính của màng CVK ...................................................................... 5
1.1.1.5. Ứng dụng của CVK .............................................................................. 6

2.2.4. Xác định lƣợng thuốc hấp thụ vào màng CVK. .................................... 19
2.2.5. Môi trƣờng pH dùng để xác định lƣợng thuốc giải phóng thông qua hệ
thống đƣợc thiết kế .......................................................................................... 20
2.2.6. Nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ CVK nạp thuốc với các loại màng
CVK có kích thƣớc khác nhau và điều kiện môi trƣờng khác nhau ............... 20
2.2.7. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc ..... 21
2.2.8. Xử lý thống kê ....................................................................................... 22
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 23
3.1. Tạo màng CVK ........................................................................................ 23
3.1.1. Thu màng CVK từ môi trƣờng HS........................................................ 23
3.1.2. Xử lý màng CVK trƣớc khi hấp thụ thuốc ............................................ 23
3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết của màng CVK sau xử lý.................................. 24
3.1.3.1. Xác định sự hiện diện của glucose trong màng CVK tinh chế .......... 24


3.1.3.2. Xác định sự hiện diện của protein trong màng CVK tinh chế ........... 24
3.2. Kết quả quét phổ và xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn của
Omeprazole ..................................................................................................... 24
3.3. Xác định lƣợng thuốc hấp thụ vào màng CVK ........................................ 29
3.4. Lƣợng thuốc giải phóng từ màng CVK vào các môi trƣờng pH khác nhau.
......................................................................................................................... 29
3.4.1. Mật độ quang của Omeprazole khi tiến hành giải phóng thuốc tại các
thời điểm khác nhau trong các môi trƣờng pH khác nhau .............................. 29
3.4.2. Tỉ lệ giải phóng dƣợc chất của các màng ở các môi trƣờng pH khác
nhau trong các khoảng thời gian khác nhau. ................................................... 32
3.5. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng CVK nạp thuốc ........ 35
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40



Hình 3.6. Phƣơng trình đƣờng chuẩn Omeprazole dung môi NaOH 0,1M ở
pH = 6,8……………………………………………………………………..28
Hình 3.7. Hiệu chỉnh pH ................................................................................. 30
Hình 3.8. Dùng máy khuấy từ gia nhiệt, tốc độ khuấy 50 vòng/phút, nhiệt độ
370C ± 0,50C. ................................................................................................... 30
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn OD giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK
......................................................................................................................... 32
Hình 3.10. Đồ thị tỉ lệ giải phóng thuốc Omeprazole của màng CVK ........... 34


MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Cellulose vi khuẩn (viết tắt là CVK) là sản phẩm của một loài vi khuẩn,
đặc biệt là chủng Acetobacter xylinum (A. xylinum). Màng sinh học (CVK) có
cấu trúc và đặc tính rất giống với cellulose thực vật (gồm các phân tử glucose
liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozit) [3]. Ngày nay, màng CVK đã
đƣợc ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: dùng màng CVK làm
môi trƣờng phân tách cho quá trình xử lí nƣớc, làm chất mang đặc biệt cho
các pin và năng lƣợng cho tế bào, làm môi trƣờng cơ chất trong sinh học,
trong thực phẩm hay thay thế thực phẩm, dùng để thiết kế hệ thống vận tải
phân phối thuốc và nhiều ứng dụng khác [17]. Trong lĩnh vực y học, màng
CVK đã đƣợc ứng dụng làm da tạm thời để thay thế da trong điều trị bỏng,
loét da, làm mạch máu nhân tạo, làm mặt nạ dƣỡng da,… [7,17]. Theo nghiên
cứu cho thấy màng CVK có khả năng giữ thuốc và giải phóng thuốc chậm lại,
làm tăng hiệu quả sử dụng của thuốc. [9,10,13].
Ở nƣớc ta việc nghiên cứu và ứng dụng màng CVK vẫn còn khá mới
mẻ nhƣng cũng đã đạt đƣợc một số thành tựu ban đầu. Đề tài của Nguyễn
Văn Thanh – Đại học Y Dƣợc thành phố Hồ Chí Minh 2006 [5] đã “ Nghiên
cứu chế tạo màng cellulose trị bỏng từ Acetobacter xylinum”. Kết quả cho
thấy màng CVK đƣợc tạo nên từ các nguyên liệu có giá thành rẻ, dễ kiếm, có

- Thiết kế hệ thống giải phóng thuốc Omeprazole nhờ màng CVK trong
một số trƣờng hợp khác nhau về kích thƣớc, độ dày màng, pH. Đánh giá khả
năng giải phóng thuốc trong các trƣờng hợp đó.
3. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu đƣợc thực hiện trên quy mô của phòng thí nghiệm.
4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
4.1. Ý nghĩa khoa học
- Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của màng CVK trong việc giải phóng

2


thuốc.
- Việc nghiên cứu ứng dụng màng CVK nhằm khắc phục hạn chế của
Omeprazole sẽ mang lại lợi ích cho việc điều trị.
- Đánh giá những ƣu nhƣợc điểm của giải phóng omeprazole của màng
CVK để từ đó đề xuất hƣớng nghiên cứu với các thuốc khác.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Tạo ra hệ thống giải phóng Omerazole kéo dài từ màng CVK.
- Từ kết quả nghiên cứu đƣợc có thể áp dụng vào thực tiễn.

3


NỘI DUNG
Chƣơng 1: TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Cellulose vi khuẩn (CVK) và sinh vật tổng hợp cellulose
1.1.1. Cellulose vi khuẩn (CVK)
1.1.1.1. Đặc điểm của Cellulose vi khuẩn (CVK).
Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với

và hemicellulose.
- Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số loại vi sinh vật.
- Là nguồn tài nguyên có thể phục hồi.
- Khả năng kết sợi và tạo tinh thể tốt.
- Tính bền cơ tốt và khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn
có độ bền cao, trọng lƣợng nhẹ,... [5,12].
1.1.1.4. Đặc tính của màng CVK
Trong nuôi cấy tĩnh, CVK tích lũy trên bề mặt môi trƣờng lỏng thành
lớp mỏng nhƣ da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản phẩm tƣơng tự
nhƣ giấy da với độ dày 0,01 – 0,05mm. Sản phẩm này có những tính chất rất
đặc biệt nhƣ:
- Độ tinh kết cao: CVK là cellulose sinh học duy nhất đƣợc tổng hợp
không chứa lignin hay hemicelluloses nên có thể bị vi khuẩn phân hủy hoàn
toàn và là nguồn nguyên liệu tái sinh.
- Độ bền dai cơ học lớn: Cellulose có độ bền dai cao, trọng lƣợng nhẹ.

5


- Khả năng hút nƣớc cực cao ở trạng thái ẩm.
Màng CVK có bề mặt tiếp xúc lớn hơn gỗ thƣờng, không độc và không
gây dị ứng, chịu nhiệt tốt (khoảng 100oC không ảnh hƣởng lớn đến tính chất
của CVK nhƣng nhiệt độ thấp có thể làm tăng tính mềm dẻo của nó). Đặc biệt
có khả năng cản khuẩn. Với đặc tính này, CVK đã đƣợc ứng dụng làm màng
lọc vô khuẩn [22].
1.1.1.5. Ứng dụng của CVK
CVK đƣợc ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực nhƣ: thực phẩm, công
nghiệp dệt, mỹ phẩm, công nghệ pin,…và đặc biệt trong lĩnh vực y học.
Trong y học, màng CVK thu đƣợc từ nuôi cấy tĩnh đƣợc nghiên cứu và sử
dụng làm da nhân tạo để trị bỏng, đắp lên các vết thƣơng hở. Ở Brazil, màng

Nhiệt độ tối ƣu để A. xylinum phát triển là 25 – 30oC và pH từ 5,4 –
6,3. A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 –
35oC và nồng độ ethanol có thể tới 10% [6].
Các đặc điểm sinh hóa dùng định danh của A.xylinum bao gồm: oxy hóa
ethanol thành acid acetic, CO2, H2O, phản ứng catalase dƣơng tính, không
tăng trƣởng trên môi trƣờng Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid, chuyển
hóa glyxerol thành dihydroxyacetol, không sinh sắc tố nâu, tổng hợp cellulose
[6].
1.1.4. Môi trường nuôi cấy A. xylinum
Môi trƣờng nuôi cấy A. xylinum là môi trƣờng tổng hợp từ các nguồn
dinh dƣỡng cần thiết nhƣ cacbon, nito, nguồn sulfur và phospho, các yếu tố
tăng trƣởng và các yếu tố vi lƣợng. Nhu cầu sử dụng đƣờng của A. xylinum là
rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp CVK nên có rất
nhiều nghiên cứu đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp trong các ngành công
nghiệp khác nhƣ: rỉ đƣờng, nƣớc dừa già, nƣớc mía,... để làm nguyên liệu
trong nuôi cấy A. xylinum.

7


Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum tạo CVK đƣợc trình bày trong
bảng 1.1.
Bảng 1.1. Thành phần của các môi trƣờng lên men thu màng CVK
Các loại môi trƣờng

Thành phần

MT1

MT2


0,3g

Amoni sulfat

0,5g

0,5g

Nƣớc dừa già

1.000ml

Cao nấm men

5g

Nƣớc cất 2 lần

1.000ml

Nƣớc vo gạo

1.000ml

Thêm dịch giống vào từng môi trƣờng với lƣợng nhƣ nhau và tối thiểu
bằng 10% thể tích môi trƣờng. pH của môi trƣờng đƣợc đo và hiệu chỉnh
bằng 4-6 (pH tốt nhất cho sự phát triển của A. xylinum là 6. pH thấp sẽ giúp
tránh bị nhiễm những vi khuẩn khác).
Môi trƣờng chuẩn (Hestrin và Schramm (HS)) là môi trƣờng nuôi cấy

đƣợc dùng điều trị trong các trƣờng hợp: trào ngƣợc dạ dày thực quản, loét dạ
dày tá tràng, hội chứng Zollinger-Ellison.

9


Dược động học [3]: Omeprazole là một chất ức chế bài tiết dịch vị dạ
dày do ức chế bơm proton ở các tế bào thành dạ dày. Thuốc có tác dụng
nhanh, kéo dài. Omeprazole đƣợc hấp thụ tốt ở ruột non sau khi uống từ
khoảng 3 đến 6 giờ. Sinh khả dụng sau khi uống liều đầu tiên đạt khoảng 35%
và đạt tới trên 60% sau khi dùng vài liều. Sự hấp thụ của thuốc phụ thuộc vào
liều dùng, không bị ảnh hƣởng bởi thức ăn. Thuốc liên kết cao với protein
huyết tƣơng (khoảng 95%) và đƣợc phân bố vào các mô đặc biệt ở các tế bào
thành dạ dày. Thời gian bán thải của thuốc khá ngắn (khoảng 40 phút), nhƣng
tác dụng ức chế bài tiết kéo dài, nên có thể chỉ cần dùng một liều mỗi ngày.
Omeprazole hầu nhƣ chuyển hóa hoàn toàn tại gan, đào thải nhanh
chóng, chủ yếu qua nƣớc tiểu (80%), phần còn lại theo phân. Các chất chuyển
hóa không có hoạt tính nhƣng lại tƣơng tác với nhiều thuốc khác do tác dụng
ức chế enzyme CYT.P450 của tế bào gan. Dƣợc động học của thuốc thay đổi
không có ý nghĩa ở ngƣời già hoặc ngƣời có chức năng thận suy giảm. Với
những ngƣời suy giảm chức năng gan, sinh khả dụng của thuốc tăng và độ
thanh thải giảm, nhƣng không có biểu hiện tích lũy thuốc trong cơ thể.
1.2.4. Chỉ định và chống chỉ định
Chỉ định:
- Trào ngƣợc dạ dày – thực quản
- Loét dạ dày – tá tràng
- Hội chứng Zollinger-Ellison
Chống chỉ định: Mẫn cảm với thuốc.
Phản ứng bất lợi: Một số phản ứng thƣờng gặp có thể xảy ra khi điều trị
với Omeprazole nhƣ: rối loạn tiêu hóa, buồn nôn, nôn, đau bụng, trƣớng

AstraZeneca) nghiên cứu sử dụng làm thuốc điều trị và đăng ký lƣu hành từ
năm 1988 với tên biệt dƣợc Losec (đƣợc công nhận là thuốc phát minh,
Innovator), với doanh số khoảng 8 tỷ USD mỗi năm. Tuy nhiên, khi chƣa hết
hạn bản quyền (1997), AstraZaneca đã xin rút đăng ký sản phẩm này ở một số

11


nƣớc thành viên chính của EU và cho ra đời viên nén và viên nang Losec
MUPs (omeprazole + magnesi). Mặc dù chế phẩm mới đã đƣợc đánh giá
tƣơng đƣơng sinh học với chế phẩm Losec gốc nhƣng nhiều nƣớc không coi
Losec MUPs là chế phẩm innovator. Từ đó, trên thị trƣờng chỉ còn lƣu hành
chế phẩm generic của omeprazole đã đƣợc đánh giá tƣơng đƣơng sinh học với
Losec hoặc chế phẩm đƣợc cấp phép ở các nƣớc Losec không đƣợc đăng kí
bản quyền, nhƣ Apo – omeprazole, (Apotec – Canada), Probitor (Biochemie –
Áo).
Sayed Aboflazl Mostafavi (Iran) [20] đã nghiên cứu đánh giá tƣơng
đƣơng sinh học của 2 sản phẩm viên nang Omeprazole sản xuất tại Iran:
Omeprazole (Abidi) và Lorsec (Lorestan) so với thuốc chứng là viên nang
Losec của Astra, Sweden. Nghiên cứu thực hiện trên 12 ngƣời tình nguyện,
thiết kế chéo theo ô vuông latin, mở, liều đơn, 3 thuốc, 3 giai đoạn với thời
gian nghỉ giữa các giai đoạn là 7 ngày. Phân tích nồng độ thuốc trong huyết
tƣơng bằng HPLC. Kết quả đánh giá qua các giá trị dƣợc động học AUC và
Cmax cho thấy 3 chế phẩm này là tƣơng đƣơng sinh học.
Elkoshi Z. [16] và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá tƣơng đƣơng sinh
học của viên Omepradex so với thuốc đối chứng là viên Losec trên 2 mô hình
invitro (thử độ hòa tan) và in vivo (dƣợc động học). Nghiên cứu in vivo với
thiết kế chéo, ngẫu nhiên, đơn liều kết hợp với đa liều, thực hiện trên 40
ngƣời tình nguyện khỏe mạnh. Hai chế phẩm nghiên cứu cho thấy không
tƣơng đƣơng, sự sai khác sau khi dùng đa liều lớn hơn. Các tác giả đã nhận

- Đã có 1 số đề tài nghiên cứu liên quan đến thuốc Omeprazole nhƣ:
Phùng Thị Vinh, Trịnh Văn Lẩu (2007) “Nghiên cứu đánh giá tương đương
sinh học viên nang Helinzole (Omeprazol 20G) theo mô hình đơn liều kết hợp
đa liều”, Viện Kiểm nghiệm thuốc TW, Bộ Y tế. Nguyễn Nam Hƣơng (2009)
“Nghiên cứu bào chế viên nang chứa pellet omeprazol tan trong ruột”,...
- Omeprazole đƣợc sử dụng nhiều trong chữa trị các bệnh nhƣ: trào

13


ngƣợc dịch dạ dày - thực quản, loét dạ dày - tá tràng, hội chứng Zollinger Ellison… nhƣng vẫn còn rất ít nghiên cứu nhằm hạn chế các tác dụng phụ
cũng nhƣ yếu điểm của thuốc.
Trong khoảng 10 năm trở lại đây, Bộ Y tế đã cấp phép cho khoảng 42
chế phẩm của omeprazole lƣu hành ở Việt Nam. Hiện nay, 37 sản phẩm có số
đăng kí còn hạn, trong đó có 25 sản phẩm nƣớc ngoài và 12 sản phẩm trong
nƣớc.

14


Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Hóa chất và dung môi sử dụng trong nghiên cứu
- Omeprazole (95%) xuất xứ từ Ân Độ.
- Dung môi là NaOH 0,1M và chất phản ứng khác đƣợc cung cấp từ
Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2.
- Màng CVK lên men từ môi trƣờng chuẩn.
2.1.2. Thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
- Buồng cấy vô trùng (Haraeus);
- Cân kỹ thuật (Sartorius - TE612);